SlingshotN端結構域自抑制機制及其被F

1、Slingshot N 端結構域自抑制機制及其被 F-actin 激活機制的研究絲切蛋白磷酸酶 Slingshot 屬于 I 型酪氨酸磷酸酶家族 (Protein TyrosinePhophotase,PTP)中的雙特異性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase,DUSP)家族, 雙特異性磷酸酶家族不同與經(jīng)典型的蛋白酪氨酸磷酸酶家族 , 它們既能夠 去磷酸化酪氨酸 (pY), 又能夠去磷酸化絲 / 蘇氨酸 (pS/T) 。目前被報道已知的 Slingshot 特異性底物是磷酸化的絲切蛋白 (p-Cofilin);Slingshot 可以通過調(diào) 節(jié)底物 Cofilin 的

2、去磷酸化來影響肌動蛋白 (F-actin) 的聚合與解離 , 從而參與 細胞骨架動力學；另一方面，F(xiàn)-actin會與Slingshot磷酸酶上的某些特定氨基酸 或是結構域相結合 , 從而極大提高 Slingshot 磷酸酶的活力。最近的研究發(fā)現(xiàn) , 在一些癌癥 , 阿爾茲海默病及某些血管性疾病中都檢測到了 Slingshot 磷酸酶 的活性異常升高 ；盡管 Slingshot2(SSH2) 催化結構域晶體結構在 2006時年就被 解析出，但目前關于SSH2磷酸酶更為全面深入的底物催化機制及如何被F-actin激活的相關機制并沒有詳細的說明。一、研究目的 :1.Slingshot 磷酸酶動力學催

3、化機制研究 ；2.Slingshot 底物 選擇性機制的研究 ；3.F-actin 激活 Slingshot 機制研究 ；4. 如何通過我們自己建 立的方法高效篩選 Slingshot 的小分子抑制劑或激動劑 ； 二、研究方法 :主要研究 方法簡述如下:1.通過PCF方法構建一系列Slingshot截短質(zhì)粒,利用大腸桿菌 BL21 感受態(tài)細胞體外表達 Slingshot 截短蛋白 , 用于后期酶活檢測 ；2. 選用結構 不同的小分子底物及生理底物或是磷酸化短肽檢測 Slingshot 對底物的選擇性 機制;3.繪制pH依賴性曲線,檢測Slingshot磷酸酶的酸堿催化機制；4.繪制底物 解離基

4、團依賴性曲線 , 檢測 Slingshot 對產(chǎn)物小分子解離基團的依賴性大小 ；5.利用肌肉丙酮粉制備F-actin,以pNPF和p-Cofilin 作為底物檢測F-actin激活Slingshot 機制;6. 繪制底物解離基團依賴性曲線 , 進一步明確 F-actin 激活 Slingshot 機制;7. 體外 Trypsin 酶切實驗驗證 F-actin 激活 Slingshot 屬于變 構激活調(diào)節(jié)；8.在Slingshot蛋白N端特定位點引入半胱氨酸突變和小分子熒光 底物mBB標記方法,通過連續(xù)熒光光譜掃描檢測F-actin激活Slingshot分子機 制;9.FIAsH-BRET實驗用

5、來檢測驗MCF-7細胞給予NR喇激時，細胞內(nèi)Slingshot 激活機制;10.利用FlAsH-BRET方法，拓展Slingshot酶活檢測探針，可以用來檢 測不同生理條件下的 Slingshot 酶活或是篩選小分子抑制劑、激動劑 ; 三、結 果:1.SSH2 N端結構域具有自抑制作用通過對已構建好的一些列SSH2不同長度截短蛋白的表達純化，最后酶活檢測發(fā)現(xiàn)隨著SSH2N端（1-305）的不斷截短,SSH2 酶活逐漸增強，相反,N端結構域的存在會抑制SSH2酶活，對生理底物p-Cofilin 蛋白的活性檢測，同樣發(fā)現(xiàn)SSH2 N端對生理底物有抑制作用，細胞內(nèi)檢測SSH2 全長蛋白和截去N端1-

6、227的截短蛋白酶活相比，同樣發(fā)現(xiàn)SSH2勺N端對酶活有 自抑制的作用。對pNPP單環(huán)）,DiFMUP（雙環(huán)）,OMFP侈環(huán)）小分子底物酶活檢測 發(fā)現(xiàn),SSH2對于多環(huán)底物相對于單環(huán)底物選擇性較好；SSH2 N端233-305結構域 對于生理底物的識別起著關鍵作用，沒有233-305區(qū)域,SSH2不能識別Cofilin 無法去磷酸底物。2.SSH2 N端結構域自抑制屬于非競爭抑制方式將SSH2 N端1-227結構域在體外表達純化，與SSH2233-490和SSH2305-490兩個磷酸酶共孵 育，檢測加入1-227后的233-490和305-490對小分子底物pNPF酶活，發(fā)現(xiàn)隨著 1-227

7、蛋白的濃度不斷增加，233-490和305-490對pNPP的親和力Kmfi并無變化， 而VmaX降低，屬于非競爭抑制方式；由于233-305對于生理底物cofilin 的識別 是必須的，所以檢測1-227對SSH2 233-490的Ki抑制常數(shù)，同樣發(fā)現(xiàn)SSH2 N端 的抑制是非競爭的方式,即SSH2 N端并不與底物競爭性的結合 SSH2舌性中心，應該是作用于活性中心外的某些關鍵氨基酸或是結構域。3.SSH2磷酸酶催化機制屬于酸堿催化，并且N端結構域限制了通用酸對產(chǎn)物 小分子解離基團的穩(wěn)定性繪制 pH依賴性曲線檢測到SSH2 1-490,233-490,305-490 的基本催化機理同大部分

8、經(jīng)典磷酸酶催化機理相似 , 都 屬于酸堿催化,通過通用酸和通用堿的作用調(diào)節(jié)催化；此外,pH profile 中,當 pH>6之后,1-490的pH曲線要明顯比233-490和305-490 pH曲線淺,說明通 用酸在 1-490催化過程中的作用明顯弱于在 233-490和305-490中的作用,可能 是N端結構域的存在限制了通用酸對小分子解離基團的穩(wěn)定性作用。繪制Leaving group dependence 曲線，發(fā)現(xiàn)SSH2 1-490的B 1絕對值明顯大于其它 233-490和305-490兩個蛋白，也就是說1-490在N端存在的情況下，通用酸對產(chǎn) 物解離基團的穩(wěn)定性弱于其它兩個

9、蛋白。4.F-actin通過解除N端自抑制激活SSH2酶活，增加產(chǎn)物解離基團穩(wěn)定性將 F-actin分別與SSH2 1-490,SSH2 233-490,SSH2 305-490共孵育，檢測SSH2不同截短對生理底物的酶活；結果發(fā)現(xiàn) 加入F-actin后1-490酶活顯著提高，而233-490和305-490酶活基本無變化， 說明F-actin可以解除SSH2 N端 1-233對酶活的抑制作用；換用pNPP小分子底 物檢測,同樣發(fā)現(xiàn)加入 F-actin 后,1-490 和1-455的酶活顯著升高 ,而其它截短 蛋白活性并無明顯變化。為了驗證F-actin的激活機制，我們檢測加入F-actin后

10、,SSH2對不同pKa 值的小分子底物的解離基團依賴性 , 結果表明加入 F-actin 后,1-490 的直線斜率 變小，接近233-490的B 1值，說明F-actin加入之后，通用酸開始發(fā)揮作用，底物 解離基團穩(wěn)定性增加，N端對通用酸的限制作用被解除,SSH2酶活升高。5. F-actin 激活SSH2屬于別構激活體外Trypsin酶切實驗證實,加入F-actin后,SSH2 1-490酶切的蛋白片段大小與不加 F-actin時蛋白酶切片段大小不同;1-490單獨酶切時,酶切后片段大小在40kDa和28kDa,加入F-actin之后,酶 切后片段變?yōu)?4kDa。通過Adman N端降解測

11、序法和SSH2 1-490 一級結構氨基 酸序列分析,1-490單獨存在時,酶切位點在R66,K291和K450;加入F-actin后, 原本暴露在結構表面的K291被F-actin保護起來,免于Trypsin的酶切;而位于 第2個a螺旋和第3個B折疊之間loop上的R332在沒有F-actin時掩藏在里面, 加入 F-actin 后暴露在結構表面 , 被 Trypine 識別并酶切。6. F-actin 激活SSH2的分子機制在SSH2 N端特定位點(19,63,78,98,146,161)引入半胱氨酸突變,用小分子熒光底物mBBr標記上述突變的半胱氨酸，同時在此基礎上將VYD-loop中的

12、Tyr突變成Trp,通過熒光光譜 連續(xù)掃面檢測N端哪些氨基酸參與了 SSH2的構象變化，及N端的哪個位置氨基酸 與VYD-loop發(fā)生了相互作用。熒光淬滅實驗證實了，當SSH2處于靜息狀態(tài)時,C19 和 C146距離 VYD loop 較遠，而 C63,C78,C98,C161 距離 VYD-loop 較近，當F-actin 激活SSH2后,C63開始遠離VYD-loop,C19則開始靠近 VYD-loop。 7.細胞內(nèi)SSH2被 F-actin激活的分子機制利用FIAsH-BRET實驗驗證我們在體外提出 的F-actin激活SSH2勺機制同樣適用于生理條件下的激活機制，將真核表達載體 SSH

13、2全長質(zhì)粒N端23位,63位插入rLuc(海腎熒光素酶),VYD-loop中插入6個 氨基酸的特定位點序列CCPGC根據(jù)NRG刺激前后,BRET信號強度變化判斷出 L63在細胞刺激后遠離VYD-loop,而23位氨基酸在細胞刺激后BRET信號強度增 加 , 說明 23 位氨基酸在細胞受刺激后向 VYD-loop 靠近。8.將SSH2-63-FlAsH拓展成可以檢測SSH2B活的分子探針FIAsH-BRET實驗中,通過計算我們發(fā)現(xiàn) BRET值的大小與p-Cofilin去磷酸化程度之間成正相關 性,即當 BRETS增大時,SSH2磷酸酶活力增加。根據(jù)之前的文獻報道,當SSH2N 端21,25,32

14、,36位的絲氨酸被GSK激酶磷酸化之后,SSH2的磷酸酶活力降低；我 們在SSH2-63-FIAsH質(zhì)粒的基礎之上，將N端21,25,32,36分別突變成酸性氨基 酸Asp和Glu,來模仿磷酸化狀態(tài)，構建成了新的SSH2-DDEE-63-FIAsH質(zhì)粒。將 上述質(zhì)粒在細胞中過表達之后，檢測ABRET言號,發(fā)現(xiàn)ABRET信號強度減弱，突變 后SSH2的磷酸酶活力降低，可能與N端氨基酸突變之后，無法使N端結構域從VYD loop 解離有關。四、結論 :1.SSH2 N 端結構域具有酶活自抑制作用 , 這種抑制方式表現(xiàn)為非 競爭抑制。2.SSH2催化機理屬于酸堿催化,N端結構域作用于VYD-loop

15、中的通用 酸D361,限制其活性，降低通用酸對產(chǎn)物解離基團的穩(wěn)定性。3.F-actin可以激活 SSH2B活,其激活機制是解除了 N端結構域?qū)νㄓ盟酓361的限制作用，提高產(chǎn)物 解離基團的穩(wěn)定性。4.F-actin激活SSH2的同時,SSH2構型發(fā)生變化，屬于變構激活機制。5.熒 光淬滅實驗，連續(xù)熒光光譜檢測發(fā)現(xiàn)了 SSH2N端參與酶活調(diào)節(jié)機制中的關鍵氨基 酸分子,63C在SSH2靜息時靠近VYD-loop,激活時遠離VYD-loop;19C在SSH2靜 息狀態(tài)時 , 遠離 VYD-loop, 激活狀態(tài)時靠近 VYD-loop。 6. 體外證實的 F-actin 激 活SSH2分子機制同時適用于生理狀態(tài)下 SSH2激活機制。7. 拓展了新的FlAsH-BRET探針，用于篩選檢測SSH2不同狀況下的磷酸酶活 力大小，及篩選SSH2小分子抑制劑/激動劑。五、意義：我們的研究發(fā)現(xiàn)了 S