電針對(duì)MCAO大鼠皮層神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

1、電針對(duì)MCAO大鼠皮層神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響摘要：目的應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察電針對(duì)缺血皮層神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)的影響。方法實(shí)驗(yàn)分缺血組和缺血+電針組，大腦中動(dòng)脈線栓(MCAO)造成局灶性缺血75min，缺血+電針組在缺血后立即給予電針1h。在缺血再灌不同時(shí)間分別處死，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果BDNF和NGF主要在缺血灶周圍的皮層表達(dá)。在再灌后8h內(nèi)缺血+電針組BDNF和NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)高于缺血組(P0.01)。結(jié)論電針能夠提高NGF和BDNF在缺血灶周圍皮層的表達(dá)，這種高表達(dá)可能對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：電針；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；神

2、經(jīng)生長(zhǎng)因子；腦缺血；免疫組織化學(xué)中分類號(hào):R743文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1003-2754(2000)03-0139-03 The effect of electroacupuncture on neurotrophins expression of ischemic cortex in MCAO RatCHEN Ying-hui,HUANG Xian-fen.(Department of Neurobiology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China)Abstract：ObjectiveTo observe the effect

3、 of electroacupunture(EA) on brain derived neurotrophic factor(BDNF) and nerve growth factor (NGF) expression of ischemic cortex in rat by immunohistochemical method. MethodsThe experiment was divided into two groups,ischemia and EA group. The middle cerebral artery (MCA) in Wistar rats was occluded

4、 for 75min to result in the focal ischemia. One-hour-EA was applied immediately after cerebral ischemia.These animals were decapitated at different reperfusion point,and the immunohistochemical method was used evaluate the change of BDNF and NGF expression between ischemia group and EA group. Result

5、sIt was found that BDNF and NGF immunoreactive cells expressed mainly in the peripheral cortex of the infarction,and both of them were same in the time-course of the expression. The expression of BDNF and NGF increased gradually after EA. At 8 hour of reperfusion,it reached the peak,then it decrease

6、d gradually. At 12 hour,it returned the level of ischemia group. In EA group the expression of BDNF and NGF in 8 hours of reprefusion was significantly higher than that in ischemia group(P0.01). ConclusionEA may increase expression of BDNF and NGF in the peripheral cortex of the infarction,and it wo

7、uld be protective effect against cerebral ischemia.Key words：Electroacupuncture;Brain derived neurotrophic factor;Nerve growth factor；Cerebral ischemia；Immunohistochemistry實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用，并能促進(jìn)缺血后損傷神經(jīng)元的修復(fù)。但NGF和BDNF作為大分子蛋白質(zhì)很難通過(guò)血-腦脊液屏障。腦室內(nèi)或皮層給藥雖然可以達(dá)到治療目的,但也不可避免對(duì)大腦造成損傷，而且操作復(fù)雜不易為臨床接受。因此尋求一

8、條能提高NGF和BDNF內(nèi)源性表達(dá)的途徑尤為重要。針灸對(duì)腦缺血的療效已被國(guó)際公認(rèn)，而且大量實(shí)驗(yàn)證明針灸能影響腦內(nèi)一些遞質(zhì)或神經(jīng)肽的表達(dá)。因此我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法觀察電針對(duì)缺血大鼠不同再灌時(shí)間，缺血灶周圍皮層NGF和BDNF表達(dá)的影響。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Wistar雄性大鼠(230g260g)，由上海醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供。隨機(jī)分成兩組：缺血組和缺血+電針組。每組又根據(jù)不同的缺血后再灌時(shí)間分成6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。1.2動(dòng)物模型及電針參數(shù)采用大腦中動(dòng)脈線栓法造成大腦局部缺血75min1，電針則在缺血后立即給予，取穴為“人中”和“百會(huì)”，時(shí)間為1h，強(qiáng)度3.5mA,頻率10

9、0Hz。兩組大鼠分別在缺血再灌后1、2、4、8、12和24h處死。1.3樣品采集及處理10%水合氯醛腹腔麻醉，心臟快速灌流生理鹽水100ml，然后用4%多聚甲醛(4)灌流固定30min。斷頭取腦放入20%蔗糖多聚甲醛溶液進(jìn)行后固定，然后置于30%蔗糖脫水。待腦組織下沉后取出做冰凍切片，片厚30m,取缺血中心的腦片(前囟嘴側(cè)0.20.8mm)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。1.4免疫組織化學(xué)染色(ABC法)切片入 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.27.4)漂洗3次 ， 每次5min 。 然后入含有10%正常羊血清和 0.2%TritonX-100 PBS液中，37孵育1h。將切片放入稀釋后

10、的第一抗體(兔抗大鼠1200，Santa Cruz產(chǎn)品)中，37孵育2h，移入4冰箱孵育4872h。然后經(jīng)PBS漂洗3次，切片入生物素標(biāo)記的第二抗體(Biotin 羊抗兔IgG 1200 Vector產(chǎn)品)，37孵育1h。PBS漂洗3次，入AB peroxidase complex液，37孵育1h。PBS漂洗3次，再用0.1mol/L Tris-HCL緩沖液洗5min。切片挑入0.05%DAB+0.05mol/L,Tris-HCl緩沖液 ， 加3%過(guò)氧化氫12滴顯色 ， 顯微鏡下觀察監(jiān)控顯色反應(yīng) 。 切片入0.05mol/L Tris-HCl緩沖液終止反應(yīng),洗去非特異性著色。貼片，晾干，透明，

11、封片，鏡下觀察。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以正常羊血清和PBS代替一抗，同步進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果為陰性。1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)光鏡下(100)對(duì)缺血組及電針組缺血側(cè)皮層的免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每只大鼠取3張相同缺血部位腦片，每一腦片在皮層隨機(jī)取10個(gè)視野，求其算術(shù)平均值。最后測(cè)定結(jié)果均以s表示，并進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。2結(jié)果正常大鼠皮層內(nèi)偶見少量BDNF和NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞，當(dāng)MCAO 75min后，導(dǎo)致大腦局灶性缺血，缺血灶主要位于紋狀體和皮層。BDNF和NGF在皮層表達(dá)部位主要有外側(cè)中央前區(qū)，內(nèi)側(cè)中央前區(qū)，第、感覺運(yùn)動(dòng)顆粒皮層。BDNF免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在皮層層。胞體形似棱錐，自胞體尖頂發(fā)出一個(gè)長(zhǎng)

12、的主干樹突伸向腦表面。胞體還發(fā)出若干近于水平方向的基底樹突。BDNF免疫陽(yáng)性顆粒主要分布在胞漿和細(xì)胞膜表面，胞漿和突起被染成棕黃色，主干樹突和近細(xì)胞膜的胞漿處染色較深，而細(xì)胞核周圍染色較淺(見1、2)。與BDNF稍有不同，NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要在皮層層，形態(tài)與BDNF相似。NGF的免疫陽(yáng)性顆粒分布在神經(jīng)元胞漿內(nèi)，胞漿染色呈深棕色而且均勻，而主干樹突染色較淺(見3、4)。缺血+電針組BDNF和NGF的免疫陽(yáng)性細(xì)胞在表達(dá)時(shí)程上與缺血組基本一致，電針后1h表達(dá)開始增加，8h左右達(dá)到高峰，以后逐漸減少，12h恢復(fù)到缺血組水平。在缺血再灌后8h內(nèi)，缺血+電針組NGF和BDNF的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯多于缺

13、血組(P0.01)(見14)。因此缺血后給予電針能夠提高BDNF和NGF在缺血區(qū)周圍皮層的表達(dá)，此高表達(dá)為一過(guò)性的，持續(xù)時(shí)間大約為8h左右。表1電針對(duì)缺血再灌不同時(shí)間BDNF免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響缺血組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)缺血+電針組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)缺血再灌1h缺血再灌2h缺血再灌4h缺血再灌8h缺血再灌12h缺血再灌24h15.503.7315.171.4719.004.9024.002.0823.003.1617.503.8923.003.22*23.833.25*30.002.61*35.001.79*24.504.7217.173.97與缺血組比較*P0.01表2電針對(duì)缺血再灌不同時(shí)間NGF免

14、疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響缺血組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)缺血+電針組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)缺血再灌1h缺血再灌2h缺血再灌4h缺血再灌8h缺血再灌12h缺血再灌24h21.833.9221.502.7423.173.8229.002.0020.172.5213.334.6331.835.12*34.676.06*31.002.90*40.504.18*19.833.5413.004.15與缺血組比較*P0.013討論3.1腦缺血后BDNF和NGF的變化腦缺血后BDNF和NGF以及它們的受體均表達(dá)增加2，3。谷氨酸的釋放、興奮性氨基酸受體的激活和鈣離子的內(nèi)流均可誘導(dǎo)BDNF、NGF及其受體表達(dá)4。增加的BDNF和NGF

15、可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，減少興奮性氨基酸及鈣超載引起的損傷5，6，拮抗NO介導(dǎo)的細(xì)胞毒，調(diào)節(jié)自由基代謝，并且對(duì)損傷神經(jīng)元具有修復(fù)作用。因此，腦缺血后增加的BDNF和NGF對(duì)缺血損傷具有保護(hù)作用。3.2缺血梗死灶與NGF、BDNF的關(guān)系我們?cè)诖笫驧CAO模型上，用TTC(氯化-2，3，5-三苯基四氮唑)染色證明電針可以縮小缺血再灌注大鼠的梗死灶體積，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道外源性NGF和BDNF可以減少缺血引起的梗死面積，而且可以保護(hù)半影區(qū)神經(jīng)元抵抗延遲性死亡7。提示電針誘導(dǎo)的BDNF和NGF在梗死灶周邊區(qū)的表達(dá)增加可能與電針使缺血梗死灶縮小有關(guān)。3.3電針提高NGF和BDNF的機(jī)制電針可以提高缺血后c

16、-fos及c-jun等即刻早期基因在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)8，而c-fos與c-jun可作為第三信使或潛在的轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)機(jī)體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激或損傷發(fā)生反應(yīng)。c-fos及c-jun表達(dá)的產(chǎn)物FOS和JUN蛋白通過(guò)亮氨酸拉鏈形成異源二聚體，與許多基因的激活蛋白1(AP-1)結(jié)合位點(diǎn)或佛波脂(TPA)反應(yīng)序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄速度。NGF基因具有AP-1結(jié)合位點(diǎn)9，而BDNF的基因可能也具有AP-1結(jié)合位點(diǎn)或TPA反應(yīng)序列結(jié)構(gòu)。最近報(bào)道有人用反義寡核苷酸抑制c-fos表達(dá)，隨后用原位雜交和免疫組織化學(xué)方法觀察到NGF也表達(dá)下降10。因此電針提高NGF、BDNF的表達(dá)可能是通過(guò)刺激c-fos、c-

17、jun等即刻早期基因的表達(dá)引起的。一次電針提高NGF和BDNF在缺血灶周圍皮層的表達(dá)的作用大約維持8h左右，這使NGF和BDNF的保護(hù)作用僅能維持很短的一段時(shí)間。而腦缺血造成的損傷可以持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間(包括延遲性神經(jīng)元死亡)，為了使NGF和BDNF在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持高水平，是否可以增加電針次數(shù)，這也符合臨床治療的常規(guī)，此方面工作目前我們正在進(jìn)行中。1缺血組再灌后8h,BDNF在皮層的表達(dá)(400)2缺血+電針組再灌后8h,BDNF在皮層的表達(dá)(400)3缺血組再灌后8h,NGF在皮層的表達(dá)(400)4缺血+電針組再灌后8h,NGF在皮層的表達(dá)(400)基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(397305

18、10)作者單位：陳英輝（上海醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物教研室，上海 200032）黃顯奮（上海醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物教研室，上海 200032）參考文獻(xiàn)1Kuge Y,Minematsu K,Yanaguchi T,et al. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in ratsJ. Stroke,1995,26:1655-1657.2Arai S,Kinouchi H,Akabane A,et al. Induction of brain derived neurotrophic factor and th

19、e receptor trkB mRNA following middle cerebral artery occlusion in ratJ. Neurosci Lett,1996,211(1):57-60.3Lindvall O,Kokaia Z,Bengzen J,et al. Neurotrophins and brain insultsJ. TINS,1994,17:490-496.4Tsukahara T,Yonekawa Y,Tanaka K. The role of brain derived neurotrophic factor in transient forebrain

20、 ischemia in the rat brainJ. Neurosurgery,1994,34(2):323331.5Cheng B,Mark P. NT-3 and BDNF protect CNS neurons against metabolic/excitotoxic insultsJ. Brain Research,1994,640:56-67.6Frim DM,Short MP,Roseberg WS,et al. Local protective effects of nerve growth factor-secreting fibroblasts against excitotoxic lesions in the rat striatumJ. J Neurosergury,1993,78(2):267-273.7Schabitz WR,Schwab S,Spranger M. Intraventricular brain derived n