甘草酸二銨原料藥-質(zhì)量研究資料10

1、甘草酸二銨原料藥 - 質(zhì)量研究資料 1010、質(zhì)量研究工作的試驗資料及文獻資料一、樣品本公司試制的甘草酸二銨原料藥三批 : 批號為。批量分別為 804g，799g， 802g。二、含量限度按干燥品計算，含 CHNO應(yīng)為97.0%,103.0%。4268216三、性狀 本品為應(yīng)白色結(jié)晶性粉末 ;無臭，味甜 取本品三批檢查，結(jié)果見表 1。表 1 甘草酸二銨外觀檢查結(jié)果批號白色結(jié)晶性粉白色結(jié)晶性粉白色結(jié)晶性粉性狀末;無臭，味甜 末; 無臭，味甜 末; 無臭，味甜 本品三批均符合規(guī)定。溶解度: 本品在水中易溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿或乙醚中幾乎不溶。依 法檢查(中國藥典 2000年版二部凡例 ) ，

2、檢查結(jié)果見表 2。表 2 甘草酸二銨溶解度檢查結(jié)果溶劑 樣品量 (g) 溶解情況 結(jié)論水在1ml中未全溶，在10ml中溶解 溶解0.98176乙醇 在10ml中未全溶，在100ml中溶解 極微溶解0.01019氯仿 在 100ml 中未全溶 幾乎不溶 0.00917乙醚 在100ml中未全溶 幾乎不溶0.01023本品三批均符合規(guī)定。四、鑒別1. 取本品約0.5g，加稀鹽酸4ml與水6ml，煮沸10分鐘，放冷，濾過，濾液 備用。取沉淀用水洗滌至中性， 105? 干燥 1 小時，加乙醇 10ml1使溶解，取乙醇溶液1ml，力卩10%2 6-二叔丁基對苯甲酚乙醇溶液0.5ml和 20%S氧化鈉溶液

3、1ml，至水浴上加熱30分鐘，液面應(yīng)出現(xiàn)紫紅色懸浮物。本品三 批均呈正反應(yīng)。2. 取鑒別（1）項下的濾液1ml，加間苯二酚10ml和鹽酸5滴,煮沸1分鐘，放 冷，加苯3ml，振搖，苯層即顯紫紅色。本品三批均呈正反應(yīng)。3. 取含量測定項下的溶液，照分光光度法 （中國藥典 2000年版二部附錄 ? A） 測定，在252nm的波長處于最大吸收。本品三批均符合規(guī)定。4. 取本品約50mg加水5ml使溶解，顯銨鹽的鑒別反應(yīng)（中國藥典2000年版 二部附錄 ?）。本品三批均呈正反應(yīng)。五、檢查1. 有關(guān)物質(zhì)1.1 方法照高效液相色譜法（中國藥典2000年二部附錄？ D）測定色譜條件及系統(tǒng)適用性 用十八烷基硅

4、烷鍵合硅膠為填充劑 ;以 0.02mol/L 磷酸 溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.5）-乙腈（75:25）為流動相；檢測波長為252nm理論 板數(shù)按甘草酸二銨峰計算應(yīng)不低于 1500。甘草酸二銨峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng) 符合要求。測定法 取本品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每 1ml 中約含 0.2mg 的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成每1ml中約含2yg的溶液，作為對照溶液。取對照溶液101注入液相色譜儀進行預試，調(diào)節(jié)檢測靈敏 度，使主成分色譜峰的峰高約為記錄儀滿量程的20%,25%再取供試品溶液101注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的 2 倍，供試品溶液的

5、色譜圖中如顯 雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的總和不得大于對照溶液主峰面積的 10倍（10%）。1.2.1 檢測波長的確定2取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1ml中含有甘草酸二銨40卩g/ml的溶液，照分光光度法（中國藥典2000年版二部附錄？ A），測定結(jié)果見 附圖9,同法測定中間體？（7 B -氨基-3-3-甲酰氨基-2-（2-甲酰氧基乙基）-1-吡唑 鎓基甲基-3-頭抱烯4羧酸雙三氟乙酸鹽）、中間體？（7 B -氨基-3-3-氨基-2-（2- 羥乙基）-1-吡唑鎓基甲基-3-頭抱烯-4-羧酸鹽酸鹽）、中間體？ （1 -（Z）-2-（2-氨基噻唑-4- 基）-2- 甲氧基亞氨基乙酰

6、基 苯并三氮唑 -3- 氧化物）紫外最大吸收波長分 別為258nm 255nm 257nm 見附圖10,12，可見以上中間體在 252nm的波長處均 有較大吸收，故選擇檢測波長為 252nm。1.2.2 系統(tǒng)專屬性試驗取流動相20卩l(xiāng)，依法測定，HPLC圖譜見圖13。1.2.2 系統(tǒng)適用性試驗取甘草酸二銨適量，依法測定，HPLC圖譜見圖14,按甘草酸二銨峰計算，理 論板數(shù)為 6317，甘草酸二銨峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度為 2.21 。1.2.3 耐用性試驗 照有關(guān)物質(zhì)檢查方法，改變流動相組成及流速，進行耐用性試驗，結(jié)果見表7（其中水相是：0.02mol/L磷酸溶液，用三乙胺調(diào)節(jié) pH值為6.5）

7、，HPLC圖譜見圖15,19。表 7 甘草酸二銨有關(guān)物質(zhì)檢查耐用性試驗結(jié)果流動相組成 流速 (ml/min) 理論板數(shù) 分離度水相 乙腈75 25 1.0 8490 2.3175 25 0.9 8150 2.2675 25 1.1 8778 2.4076 24 1.0 8271 2.2274 26 1.0 8506 2.06結(jié)果表明 : 本方法流動相組成及流速發(fā)生一定改變時，理論板數(shù)及3主成分峰與最近雜質(zhì)峰的分離度均符合規(guī)定，說明本方法耐用性良好。1.2.4. 破壞性試驗1.2.4.1 酸性破壞試驗取本品約20mg力卩O.1mol/L鹽酸20ml，回流0.5小時，冷至室溫，調(diào)節(jié) pH 值為中性

8、，依法測定，HPLCffl譜見圖20。由圖可見，本品經(jīng)酸性破壞后，甘草酸 二銨峰與各主要分解產(chǎn)物峰均可分開，最小分離度為 4.52。1.2.4. 2 堿性破壞試驗取本品約20mg加0.1mol/L氫氧化鈉20ml，回流15分鐘，冷至室溫，調(diào)節(jié) pH值為中性，依法測定，HPLC圖譜見圖21。由圖可見，甘草酸二銨峰與各主要分 解產(chǎn)物峰均可分開，最小分離度為 8.89 。1.2.4. 3 氧化破壞試驗取本品約20mg加30%過氧化氫溶液20ml，回流15分鐘，冷至室溫，依法測 定，HPLC圖譜見圖22。由圖可見，本品經(jīng)氧化破壞后，甘草酸二銨峰與各主要分 解產(chǎn)物峰均可分開，最小分離度為 2.61 。1

9、.2.4.4 高溫破壞試驗取本品適量，置 170?烘箱中烘烤 2 小時后，冷至室溫，加流動相使溶解，依法 測定，HPLCffl譜見圖23。由圖可見，本品經(jīng)熱破壞后，甘草酸二銨峰與各主要分 解產(chǎn)物峰均可分開，最小分離度為 8.90 。1.2.4.5 光破壞試驗取本品約20mg置強光照下照射2天，加流動相使溶解，依法測定，HPLC圖 譜見圖 17。由圖可見，甘草酸二銨峰與各雜質(zhì)峰均可分開，與相鄰雜質(zhì)峰的最小 分離度為 2.0 。1.2.5 中間體及粗品的檢測取本品合成過程中的中間體？、中間體？、中間體？及甘草酸二4銨粗品，依法測定，HPLC圖譜見圖24,27。由圖可見，中間體？、中間體？、中 間體

10、？峰的保留時間與甘草酸二銨峰的保留時間不同，與甘草酸二銨峰可以分 開。甘草酸二銨粗品中主峰與各個雜質(zhì)峰均可實現(xiàn)基線分離，最小分離度為 7.71。1.2.5 檢測限的測定精密稱取甘草酸二銨對照品及中間體 ？、中間體？、中間體？各適量，加流動 相溶解并制成適宜濃度的溶液，作為供試品溶液，依法測定。同時測定檢測器的基 線噪音，取信噪比為3:1時的進樣量作為檢測限，HPLC圖譜見圖28,31。由圖可 得，甘草酸二銨、中間體？、中間體？、中間體？的檢測限分別為0.2ng、0.5ng、 0.3ng、 0.8ng。1.2.6 檢查結(jié)果取本品三批進行檢查，結(jié)果見表 8，HPLC圖譜見圖32,37。表 8 甘草

11、酸二銨有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果批 號 031225 031226 031227總雜質(zhì) （%）2. 酸度取本品0.1g，加水10ml使溶解，依法測定（中國藥典2000年版二部附錄？H），pH應(yīng)為 4.0,5.0。表 11 甘草酸二銨酸度檢查結(jié)果批號4.3 4.4 4.3 酸度結(jié)果表明，本品三批均符合規(guī)定。3. 溶液的澄清度與顏色取本品1.0g，加水10ml，加熱使溶解后，溶液應(yīng)澄清無色；如顯色，與黃色3 號標準比色液 （中國藥典 2000年版二部附錄 ? A） 比較，不得5更深。表 9 甘草酸二銨溶液的澄清度與顏色檢查結(jié)果批號溶液的澄清度 符合規(guī)定 符合規(guī)定 符合規(guī)定溶液的顏色 符合規(guī)定 符合規(guī)定 符合

12、規(guī)定 結(jié)果表明，本品三批均符合規(guī)定。4. 干燥失重取本品，在 80?減壓干燥至恒重，減濕重量不得過 5.0%（中國藥典2000年版二部附錄 ? I）表 10 甘草酸二銨干燥失重檢查結(jié)果批號3.6 2.9 3.1 干燥失重 （%）結(jié)果表明，本品三批均小于 5.0%5. 熾灼殘渣取本品1.0g，依法檢查(中國藥典2000年版二部附錄？ N)，遺留殘渣不得過 0.2%。取本品三批進行檢查，結(jié)果見表 12。表 12 甘草酸二銨熾灼殘渣檢查結(jié)果批號熾灼殘渣 (%) 0.06 0.08 0.07 結(jié)果表明，本品三批均符合規(guī)定。6. 重金屬取熾灼殘渣項下遺留的殘渣，依法檢查 (中國藥典 2000年版二部附錄

13、? H 第二法) ，含重金屬不得過百萬分之十。取本品三批進行檢查，結(jié)果見表 13。6表 13 甘草酸二銨重金屬檢查結(jié)果批號重金屬(ppm) 10 10 10結(jié)果表明，本品三批均符合規(guī)定。7. 硫酸鹽取本品0.5g，加稀鹽酸5ml與水10ml，加熱10分鐘，放冷濾過，殘渣用少量 水洗滌二次，合并洗滌液和濾液，用氨試液中和，濾液如顯色，加過氧化氫試液 1ml，水浴加熱10分鐘，濾過，濾液用少量水洗滌二次，合并洗液和濾液，至 50ml納氏比色管中，依法檢查(中國藥典2000年版二部附錄？ B)，如發(fā)生渾濁， 與標準硫酸鉀溶液 1.0ml 制成的對比液比較，不得更濃 (0.02%)。表 13 甘草酸二

14、銨重金屬檢查結(jié)果批號硫酸鹽 0.02% 0.02% 0.02%結(jié)果表明，本品三批均符合規(guī)定。8. 砷鹽取無水碳酸鈉1g,鋪于坩堝底部與四周，再取本品1.0g，置無水碳酸鈉上， 用少量水濕潤，干燥后，先用小火灼燒使炭化，再在500,600? 熾灼使完全灰化，放冷，小心滴加稀鹽酸5ml，使殘渣溶解，蒸干，加水 5ml溶解，加鹽酸5ml與水 18ml，依法檢查(中國藥典2000年版二附錄？ J第一法)，應(yīng)符合規(guī)定(0.0002%)。7表 13 甘草酸二銨砷鹽檢查結(jié)果批號砷鹽 符合規(guī)定 符合規(guī)定 符合規(guī)定9. 細菌內(nèi)毒素9.1 方法:中國藥典 2000年版二部附錄 ? E。9.2 供試品細菌內(nèi)毒素限值

15、 (L) 的確定臨床劑量為每次30ml，用10%葡萄糖注射液250ml稀釋后。靜脈滴注M=30/(1.5 x 50)=0.40ml/kg/hr ，貝U L=K/M=5/0.40=12.5EU/ml。9.3 干擾試驗9.3.1 試驗材料9.3.1.1 鱟試劑Lot No 0310210入=0.125EU/ml規(guī)格:0.1ml/支 湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)Lot No 031018入=0.125EU/ml規(guī)格:0.1ml/支 湛江海洋生物制品廠9.3.1.2 細菌內(nèi)毒素工作標準品Lot No 0310010效價:10EU/支 湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)9.3.1.3 細菌內(nèi)毒素檢查用水Lot N

16、o 20031031 規(guī)格 :5ml/ 支 湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)9.3.1.4 其他玻璃實驗用具均在 250?滅菌 2 小時后使用。932實驗條件：水浴溫度（37?1）?保溫時間（60?2）min。9.3.3 鱟試劑靈敏度復核試驗按照中國藥典 2000 年版二部附錄 ? E 細菌內(nèi)毒素檢查法，對所用鱟8試劑的靈敏度進行復核，結(jié)果見表 14。表14 鱟試劑靈敏度復核試驗結(jié)果內(nèi)毒素濃度 （EU/ml）TAL批號 標示靈敏度（入）入c0.25 0.125 0.0625 0.03125 NC031018 0.125EU/ml + + + 0.125EU/ml 03102100.125EU/ml

17、+ + + - 0. 1 25EU/ml從試驗結(jié)果可以看出，我們所選用的鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。9.4 干擾預試驗甘草酸二銨最小有效稀釋濃度（縮寫MVC按公式MVC= /L ,入為鱟試劑標示靈 敏度，L為甘草酸二銨的細菌內(nèi)毒素限值，目前市售鱟試劑靈敏度入最低在0.03EU/ml，則甘草酸二銨的最低有效稀釋濃度為 0.012mg/ml，將甘草酸二銨用內(nèi) 毒素檢查用水分別稀釋最終濃度為:10、2、0.5、0.1、0.012mg/ml，將此系列溶液 記為NPC同時在上述試驗液中加入標準細菌內(nèi)毒素溶液，使每一濃度試驗液中均 含有2入濃度的細菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC取標示靈敏度為0.125EU/m

18、l的不同廠家的鱟試劑，分別與上述 NPC和PPC進行反應(yīng)，每一濃度重復2管，并設(shè)陽性和陰性對照。其中NPC出現(xiàn)陽性或PPC出現(xiàn)陰性則表示有干擾影響，結(jié)果見表15、表 16。表 15 甘草酸二銨干擾預試驗 （ 安度斯）2 0.5 0.1 干擾濃度 10 0.012 NCNPC 反應(yīng)結(jié)果PPC - - + + + +表 16 甘草酸二銨干擾預試驗 （海洋生物 ）2 0.5 0.1 干擾濃度 10 0.012 NCNPC 反應(yīng)結(jié)果PPC - - + + + +由以上預干擾試驗結(jié)果可以初步了解 : 甘草酸二銨對內(nèi)毒素與鱟試9劑反應(yīng)存在干擾，當甘草酸二銨濃度在 0.5mg/ml 以下可排除干擾作用，且不

19、 同廠家的鱟試劑反應(yīng)結(jié)果完全一致。9.5 正式干擾試驗 為了最終確認是否存在抑制因素的影響，特進行如下正式干擾試驗。取甘草酸 二銨用細菌內(nèi)毒素檢查用水進行稀釋，使其最終干擾試驗濃度為 0.5mg/ml ，按中 國藥典 2000年版二部附錄中的細菌內(nèi)毒素供試品干擾試驗進行，結(jié)果見表17、表18。表 17 甘草酸二銨干擾試驗 （安度斯 ）內(nèi)毒素濃度 （EU/ml）樣品批號0.25 0.125 0.0625 0.03125 NC Et Es 030109 + + -0.125EU/ml 030115 + + - 0.125EU/ml 030121 + + - - 0.125EU/ml 水溶液 + +

20、 - 0.125EU/ml表 18 甘草酸二銨干擾試驗 （海洋生物 ）內(nèi)毒素濃度 （EU/ml）樣品批號0.25 0.125 0.0625 0.03125 NC Et Es 030109 + + -0.125EU/ml 030115 + + - 0.125EU/ml 030121 + + - - 0.125EU/ml 水溶液 + + - 0.125EU/ml正式干擾試驗結(jié)果可以再次確認 : 甘草酸二銨用鱟試劑檢測在稀釋濃度0.5mg/ml 時無干擾因素的影響。取樣品三批進行測定，結(jié)果均符合規(guī)定。四、含量測定（ 一 ） 分光光度法1. 方法照分光光度法 （中國藥典 2000年版二部附錄 ? A）

21、 測定。10測定法 取本品，精密稱定加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含40俱 的溶液，照分光光度法（中國藥典2000年版二部附錄？ A）測定，在252nm的波長處測定 吸收度。另取經(jīng) 105?干燥至恒重的煙酰胺對照品，精密稱定，加水溶解并定量稀 釋制成每1ml中約含20 g的溶液，在261 nm的波長處測定吸收度，乘以1.898。 即得甘草酸二銨含量。 2. 方法學研究2.1 精密度試驗取煙酰胺對照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成 1ml 中約含煙酰胺20 yg的溶液，依法測定，重復6次，結(jié)果見表21。表 21 含量測定精密度試驗結(jié)果濃度 吸光度 A?SD RSD(%)1 0.4962

22、0.4923 0.5040.495?0.01 2.024 0.4895 0.4976 0.490結(jié)果表明，本方法的精密度良好。2.2 溶液的穩(wěn)定性考察22。取上述供試品溶液，于不同時間取樣，依法測定，結(jié)果見表表 22 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD(%) 時間 (小時 ) 吸光度 A?SD0 0.4882 0.4920.493?0.01 4 2.03 0.4986 0.5028 0.487由表可見，供試品溶液的穩(wěn)定性符合測定要求。2.3 線性范圍的測定11精密稱取煙酰胺對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成每 1ml 中約含煙酰胺0.4mg的溶液，精密量取 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml，分

23、別置于100ml量瓶中， 加流動相稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄？ A)，記 錄吸光度，繪制工作曲線，結(jié)果見表 23，工作曲線見圖 68。表 23 含量測定方法線性范圍測定結(jié)果序號濃度(卩g/ml)吸光度A1 0.395 16.032 0.446 18.043 0.494 20.044 0.546 22.045 0.598 24.05以濃度C(卩g/ml)對峰面積,進行線性回歸，得回歸方程為：,0.0252,-0.0102 r,0.9999結(jié)果表明：煙酰胺的濃度在16,24卩g/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。說明本方法 線性范圍符合測定要求。2.4 回收試驗取甘草酸二

24、銨約32mg 40mg 48mg精密稱定，用水溶解并稀釋制成每1ml中約含0.32mg、0.40mg、0.48mg的溶液，精密量取各溶液 10ml分別置于100ml量瓶 中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié) 果見表 19。12表19注射用頭抱尼西鈉含量測定方法的回收試驗結(jié)果比例加入量(mg)測得量(mg)回收率(%) ?SD XRSD(%)32.88 32.55 99.00 31.42 31.36 99.78 99.51?0.42 80, 0.42 32.37 32.1099.1632.69 32.70 100.0133.25 32.77 98.5641.3

25、2 40.89 98.9641.46 41.19 99.35 99.52?0.43 0.43 100, 40.65 40.44 99.4840.95 40.81 99.6741.36 41.41 100.1348.98 48.78 99.6148.22 48.34 100.25 0.46 99.60?0.46 120, 48.67 48.41 99.4648.54 48.04 98.9747.75 47.59 99.68結(jié)果表明，甘草酸二銨濃度在 32,40卩g/ml范圍內(nèi)，回收率好，可作為本品的含量測定方法。3. 測定結(jié)果取本品三批依法測定，見結(jié)果見表 24。表 24 甘草酸二銨含量測定結(jié)果

26、批號 030109 030115 030121含量（%） （ 二） 高效液相色譜法1. 方法照高效液相色譜法（中國藥典2000年二部附錄？ D）測定 色譜條件及系統(tǒng)適用性 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 ; 以0.02mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.5)-乙腈(75:25)為流動相;檢測波長為252nm理論板數(shù)按甘草酸二銨峰計算應(yīng)不低于1500。甘草酸二銨峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。測定法 取本品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每 1ml13中約含0.2mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成每1ml 中約含2俱 的溶液，作為對照溶液。取對照溶液 10卩1注入液相色譜儀進行預 試，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為記錄儀滿量程的20%,25%；再取供試品溶液10卩1注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍，供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的總和不得大于對照溶液主峰面積的 10 倍 (10%)。2. 方法學研究2.1 精密度試驗取甘草酸二銨對照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成1ml中約含甘草酸二銨0.2mg的溶液，依法測定，重復6次，結(jié)果見表21。表 21 含量測定精密度試驗結(jié)果濃度 峰面積 A?SD RSD(%)1