westernblot原理及步驟

1、westernblot 原理及步驟蛋白免疫印跡即 Werstern blot ，是將印跡技術(shù)與抗原 - 抗體反應(yīng)的特異性相 結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)， 用于分離和檢測(cè)生物標(biāo)本中的某一特定蛋白。 其基本原理實(shí)混 合蛋白質(zhì)樣本通過凝膠電泳分離后，通過特殊虹吸或電場(chǎng)裝置印跡至固相介質(zhì) （ NC 膜或 PVDF 膜）上，將針對(duì)待測(cè)蛋白的特異性抗體作用于濾膜上， 利用抗 體上偶聯(lián)的酶降解底物在濾膜上生成有色沉淀物或化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物， 從而顯示出待 測(cè)蛋白的存在及量。Western blot 原理 通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體） 作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，蛋白質(zhì)的 Western

2、印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的 高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至15ng （最低可到 10100pg ）中等大小的靶蛋白。Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟一、樣本制備1 、樣本的來源：細(xì)胞培養(yǎng)上清；細(xì)胞（胞漿蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）； 組織勻漿2、不同樣本有不同的提取方式：蛋白完全裂解液、RIPA、胞核/胞漿3 、蛋白的提取：裂解前加入蛋白酶抑制劑、 磷酸酶抑制劑使其終濃度為 1mM4、蛋白定量：BCA檢測(cè)法（靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，常用）Bradford 檢測(cè)法、Lowry 檢測(cè)法、 UV 測(cè)量、電泳檢測(cè)5、 樣本上樣前的處理：蛋白提取液和SDS上樣緩沖液（Loading

3、buffer ） 以一定的比例上樣6、蛋白變性：95-100 C變性5分鐘（為了能使抗體接觸到抗原表位，必須將蛋白的三維結(jié)構(gòu)打開， 因此需要將蛋白變性， 核蛋白要增加裂解液體積和超聲 破碎次數(shù)，煮樣時(shí)間延長(zhǎng)至 10-15min ）二、上樣與電泳原理：裂解后的蛋白質(zhì)樣本經(jīng)過高速離心去除不溶物后，再經(jīng) SDS 上樣緩 沖液95-100 C變性5分鐘，使帶有強(qiáng)負(fù)電荷的 SDS與帶有弱電荷的蛋白質(zhì)結(jié) 合，大量的 SDS 可掩蓋蛋白質(zhì)本身的電荷量，只顯示 SDS 的負(fù)電荷，在 pH8.6pH8.8 的Tris-甘氨酸不連續(xù)SDS-PAGE （聚丙烯酰胺凝膠）系統(tǒng)中，蛋 白質(zhì)的電泳與自身電荷量無關(guān)， 只和

4、其分子大小有關(guān)， 從而將蛋白質(zhì)按分子量大 小順序分離。在進(jìn)行上樣之前我們需要先配置適合濃度的凝膠。制膠過程注意：1 、玻璃板對(duì)齊后放入架中，把兩側(cè)的夾子卡緊。要使短玻璃靠外，長(zhǎng)玻璃 靠?jī)?nèi)。2 然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。 操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊， 以免漏膠 ,灌膠前 加水檢漏。3 配膠時(shí)最后一步加入 TEMED 后立即搖勻馬上灌膠， 灌膠時(shí)槍頭沿著角加 入，以免產(chǎn)生氣泡。灌膠距離短玻璃板 1-2cm 高度即可。加水 / 無水乙醇封膠速 度要慢，否則膠會(huì)被沖變型。4 當(dāng)水和膠之間有一條明顯的分界線時(shí)，說明膠已凝了。再等 3min 使膠充 分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。5 按照前面方法制

5、備濃縮膠，插入梳子，待膠凝固即可。注意：使梳子處于 潤(rùn)濕狀態(tài)，輕輕插入梳子，以免后續(xù)步驟梳子不易拔出而使膠孔變形無法上樣。 插梳子時(shí)要使梳子保持水平。上樣：一般每孔上樣 20-50ug 總蛋白， 100ng 純蛋白。 根據(jù)膠的厚度不同， 上樣總體積也不同：一般來說， 10mm 的膠最多可上樣 20ul ；15mm 膠最多上 樣 30ul 。電泳：濃縮膠 80V ；分離膠 120V （100V 也可），電壓越大分離越快，電 泳時(shí)間一般 1-2 h ，電泳至溴酚蘭即將跑出膠即可終止電泳。三、轉(zhuǎn)膜一般分為：濕式電印跡 -最佳的轉(zhuǎn)膜方法，半干式電印跡 - 可選的替代轉(zhuǎn)膜方 法，干式電印跡 -有限靈敏度

6、的轉(zhuǎn)膜方法。轉(zhuǎn)膜時(shí)間的確定：蛋白從膠到膜上的濕轉(zhuǎn)是指夾子的黑面 -海綿墊 -濾紙-膠-膜-濾紙-海綿墊 - 夾子的白面的三明治結(jié)構(gòu)全部沉浸在緩沖液里。 在此種方法里， 電轉(zhuǎn) PVDF 膜是 在淹沒于含20%甲醇的緩沖液及冷卻（冰浴）的條件下，70-100V 恒壓 /250-350mA 恒流左右進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。蛋白分子量越大電壓 / 電流越大，所需轉(zhuǎn)模時(shí) 間越長(zhǎng)。轉(zhuǎn)模注意事項(xiàng)：1 采用 PVDF 膜時(shí)，必須先經(jīng)甲醇激活后才能使用， 最好將 PVDF 膜放置在 少量甲醇中浸透 1min ，再用電轉(zhuǎn)印液漂洗 5min ，最后浸在電轉(zhuǎn)印液中約 30 分 鐘，即可用于轉(zhuǎn)膜。2 接觸硝酸纖維素膜、膠和濾紙時(shí)，必

7、須戴手套。3 轉(zhuǎn)膜時(shí)間不易過長(zhǎng)，否則蛋白可能會(huì)移出硝酸纖維素膜。4 大電流轉(zhuǎn)印時(shí)，常常導(dǎo)致電泳液過熱現(xiàn)象。故電泳應(yīng)在具有冷卻水循環(huán)電 泳槽或冰浴內(nèi)進(jìn)行。5 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。四、封閉對(duì)轉(zhuǎn)印膜空白位點(diǎn)的封閉，一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑封閉整張膜，常 用 5%脫脂奶粉、 0.5%-2%BSA 、10% 血清（馬/羊）和 0.2%Tween20 等。脫 脂奶粉是常用的封閉劑， 通常使用 TBST+5% 的脫脂奶粉但不能與生物素化的抗 體一起使用，此時(shí)可以用 BSA。使用辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)， 封閉液后續(xù)不加疊氮鈉（抑制 H R P ） 。在含有封閉液的平皿中，接觸膠的那面 膜要朝上。五、抗體孵育與檢測(cè)孵育一抗：按要求用TBST/PBS稀釋抗體，室溫：1.5-2h，