實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶顯示PPT文檔

1、組織化學(xué)（histochemistry）和細(xì)胞化學(xué)（cytochemistry）n是在組織切片上或被檢材料上，加一定試劑，使它與組織或細(xì)胞中待檢物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)成為有色沉淀物，以用光鏡觀察，若為重金屬沉淀，可以用電鏡觀察，稱(chēng)電鏡組織化學(xué)（electron microscope histochemistry)。這種方法可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的酶類(lèi)、糖類(lèi)、脂類(lèi)、核酸與某些金屬元素等。如進(jìn)一步應(yīng)用顯微分光光度計(jì)等測(cè)定標(biāo)本中沉淀物的強(qiáng)度，則能較精確地進(jìn)行定量研究。1. 糖類(lèi)顯示法n最常用的顯示方法是過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)（periodic acid schiff，pas反應(yīng))。n基本原理是：糖被強(qiáng)氧化劑過(guò)碘酸（h

2、io4)氧化后，形成2-醛基；后者與schiff試劑中的無(wú)色品紅亞硫酸復(fù)合物結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物,pas反應(yīng)陽(yáng)性部位即表示多糖的存在。2. 酶類(lèi)顯示 n酶的顯示法是通過(guò)顯示酶的活性來(lái)表明酶的存在，而不是酶的本身。n將具有酶活性的組織放人含有一定底物的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用形成初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應(yīng)，形成顯微鏡下可視性沉淀，即最終反應(yīng)產(chǎn)物。3脂類(lèi)顯示 n脂類(lèi)物質(zhì)包括脂肪與類(lèi)脂。n標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹、蘇丹、蘇丹黑b、尼羅藍(lán)等脂溶性染料染色；亦可用鋨酸固定兼染色，脂類(lèi)呈黑色。 4核酸顯示法n顯示dna的傳統(tǒng)方法為feulgen反應(yīng)。n切片dna經(jīng)弱酸(1m

3、ol/lhcl)水解,其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開(kāi),使脫氧核糖的一端形成游離的醛基,這些醛基在原位與schiff試劑(無(wú)色品紅亞硫酸鈉溶液)反應(yīng),形成紫紅色的化合物,使細(xì)胞內(nèi)含有dna的部位呈紫紅色陽(yáng)性反應(yīng).紫紅色的產(chǎn)生,是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基,醌基是發(fā)色團(tuán),因此具有顏色. n如用甲基綠-派若寧反應(yīng)，可同時(shí)顯示細(xì)胞內(nèi)的dna和rna。n甲基綠與細(xì)胞核中的dna結(jié)合呈藍(lán)綠色，派若寧與核仁及胞質(zhì)內(nèi)的rna結(jié)合呈紅色。 酸性磷酸酶顯示實(shí)驗(yàn)原理 n酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用-甘油磷酸鈉）而釋放出磷酸基。在ph50的環(huán)境中，磷酸基能與鉛鹽（硝酸鉛，捕捉劑）反應(yīng)形成無(wú)色的磷酸鉛（微細(xì)沉淀，

4、可在電鏡下觀察），再經(jīng)過(guò)與硫化銨作用，形成棕黑色的硫化鉛沉淀（可在光鏡下觀察），以此顯示酸性磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的存在與分布。 實(shí)驗(yàn)材料： n小鼠腹腔液涂片（重點(diǎn)觀察巨噬細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)試劑及用品 1、6淀粉肉湯 牛肉膏 03g 蛋白胨 1.0g 氯化鈉 05g 可溶性淀粉 6g 蒸餾水 100ml 高壓滅菌99104pa(15磅)20min 2、10中性福爾馬林(ph6871) 甲醛 10ml 蒸餾水 90ml 醋酸鈉 2g 3、酸性磷酸酶作用液 配方配方： 蒸餾水 90ml 02moll醋酸緩沖液(ph46) 12ml 5硝酸鉛 2ml 3.2甘油磷酸鈉 4ml 配法配法：先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合

5、，隨后分成大致相等的兩份，一份中加硝酸鉛溶液，另一份加甘油磷酸鈉溶液，然后再將兩者緩緩混合，邊混邊攪勻。 若ph不到50，可加少量醋酸的調(diào)整。注意：配好后的作用液應(yīng)透明無(wú)絮狀懸浮物和沉淀；注意：配好后的作用液應(yīng)透明無(wú)絮狀懸浮物和沉淀； 最好在臨用最好在臨用前配制，不能貯存。前配制，不能貯存。附：02moll醋酸緩沖液（ph46）配制方法 0.2mol/l醋酸（ml） 25.5 0.2mol/l醋酸鈉（ml）24.54、1硫化銨溶液 硫化胺 1ml 蒸餾水 9ml 5、姬姆薩染液（1：30） 姬姆薩原液 3滴 磷酸鹽緩沖液（ph68） 5ml 實(shí)驗(yàn)方法1、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)：實(shí)驗(yàn)前2天開(kāi)始，每日向小鼠

6、腹腔注射6淀粉肉湯1ml，連續(xù)注射3天。2、收集巨噬細(xì)胞： 在第三天注射后34h，再向腹腔注射生理鹽水1ml，過(guò)3min后抽取腹腔液。3、粘附：將腹腔液滴在預(yù)冷的載玻片上，每人2片，每片23滴，將玻片水平放到冰箱內(nèi)（4），讓細(xì)胞自行鋪展、粘附30min。 將其中1片樣品置濕盒內(nèi)放50溫箱中30min，使酶失活4、固定：將玻片插入盛有10中性福爾馬林（已預(yù)冷）的染色缸內(nèi)，冰箱內(nèi)4固定30min。5、自來(lái)水漂洗5min，將水甩干。 6、加足量酸性磷酸酶作用液覆蓋樣品，放37水浴箱中反應(yīng)30min。 7、自來(lái)水漂洗片刻。 9、在通風(fēng)櫥中加硫化銨反應(yīng)10min。10、自來(lái)水沖洗，甩干。11、直接加pbs封片（或用1 30的giemsa染液染色15min再封片）。