354微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、山東步長制藥股份有限公司操作規(guī)程編號：zsd-qa-354密級：秘密微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程版本號：04執(zhí)行日期：2013.06.01下次修訂時(shí)間：2018.05.31文件內(nèi)容：1、目的12、范圍13、職責(zé)14、內(nèi)容15、附錄186、變更記載和原因187、相關(guān)文件和記錄19發(fā)放范圍：質(zhì)量部 質(zhì)量控制科修訂人審核人審核人批準(zhǔn)人部門質(zhì)量控制科質(zhì)量控制科質(zhì)量保證科質(zhì)量部姓名劉鳳榮郝松王愛杰黃桂福簽名日期第1頁 （共19頁）山東步長制藥股份有限公司操作規(guī)程編號：zsd-qa-354密級：秘密微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程版本號：04執(zhí)行日期：2013.10.01下次修訂時(shí)間：2018.09.301.目的

2、：建立微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范檢驗(yàn)人員的操作。2.范圍：適用于檢品的微生物限度檢查。3.職責(zé)：質(zhì)量控制科全體人員。4.內(nèi)容：4.1概述:微生物限度檢查法系指用于判斷非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受 到微生物污染程度的一種檢查方法，其檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌 數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌數(shù)的檢查。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度c級下的局部潔凈度a級下的單向 流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止污染， 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、 工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游 菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。供試品檢查時(shí)，

3、如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑應(yīng)證明其 有效性及對微生物無毒性。除另有規(guī)定外，本規(guī)程中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為3035；霉菌、 酵母菌培養(yǎng)溫度為2328。檢查結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2為單位報(bào)告，特殊品種 可以最小包裝單位報(bào)告。人員資質(zhì)及培訓(xùn)要求 從事藥品微生物試驗(yàn)工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識的 教育背景。試驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)所在崗位和職責(zé)接受相應(yīng)的培訓(xùn)，在確 認(rèn)它們可以承擔(dān)某一試驗(yàn)前，他們不能獨(dú)立從事該項(xiàng)微生物試驗(yàn)。 應(yīng)保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必須的設(shè)備操作、微生物 檢驗(yàn)技術(shù)和試驗(yàn)室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗。4.2設(shè)備、儀器及用具4.

4、2.1設(shè)備微生物限度室 結(jié)構(gòu)和要求：微生物限度室應(yīng)采光良好、避免潮濕、遠(yuǎn)離廁所及污 染區(qū)（面積不超過10m2，高度不超過2.4m）由緩沖間（2個(gè)）、操作 間組成。操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞箱，出入操作間和緩沖 間的門不應(yīng)直對。溫度應(yīng)控制在1826，相對濕度4565%。操作間 潔凈度不應(yīng)低于c級，局部凈化度為a級，或放置同等級 凈化工作臺。緩沖間 緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物。操作臺或凈化工作臺要定期檢測其潔凈度，應(yīng)達(dá)到a級。凈化工作 臺中的高效及中效過濾器應(yīng)根據(jù)檢測情況，必要時(shí)予以更換處理。消毒處理 微生物限度室應(yīng)在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴銨（新潔爾滅）溶液或其他消毒液擦拭操作

5、臺及可能污染的死角。開動 層流凈化裝置，同時(shí)用紫外燈照射30min。設(shè)備 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、spx-250b生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、勻 漿儀、電熱恒溫干燥箱、冰箱、 空調(diào)、ldzx-50kbs型立式壓力蒸汽 滅菌器。4.2.2儀器及器皿菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡、ph系列比色計(jì)、電子天平或藥物天平（感量 0.1g）。玻璃器皿 錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管。玻璃 器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞 入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量 筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿均于160 干熱滅菌2h或高壓蒸汽121滅菌30mi

6、n，烘干備用。4.2.3用具大、小橡皮膠頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%75% 乙醇溶液浸泡）。無菌工作服、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌， 備用。接種環(huán)、酒精燈、75%酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、滅菌稱樣 紙、不銹鋼藥匙、試管架、打火機(jī)、記號筆、不銹鋼盆。4.3試液4.3.1消毒液：75%乙醇溶液、0.1%新潔爾滅溶液、3%來蘇水溶液、5% 碘伏溶液或其他消毒液。4.3.2稀釋劑和試液：配制所需稀釋劑、試液。 ph 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、二鹽酸 二甲基對苯二胺試液、亞碲酸鈉試液、無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶 液、過氧化氫試液、靛基質(zhì)

7、試液、三氯甲烷、1mol/l鹽酸試液。4.4培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程配制檢驗(yàn)所需培養(yǎng)基。 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培 養(yǎng)基（mug）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（macc）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅 亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、四硫 磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、沙門、志賀菌屬瓊脂培 養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、卵黃 氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、pdp瓊脂培養(yǎng)基、亞 碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基、含慶大霉素的哥倫比亞 瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、1%聚山梨酯80玉米瓊脂培 養(yǎng)基

8、。4.5供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量4.5.1抽樣一般采用隨機(jī)抽樣方法，抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝 單位）的3倍量（以備復(fù)試）。抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠罚瑧?yīng)選取有疑問的樣品，但機(jī) 械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長螨、發(fā)霉、 蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗(yàn)。4.5.2保存供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供 試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的 樣品不得作為供試品。4.5.3檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量( g、

9、ml、cm2)。除另有規(guī)定外，一般供試品檢驗(yàn)量為10g或10 ml；膜劑為100 cm2； 貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢驗(yàn)沙門菌的供 試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10 g或10ml用于陽性對 照試驗(yàn)）。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得 少于4丸，膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍 量供試品。4.6操作方法4.6.1試驗(yàn)前準(zhǔn)備將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1ml、 10ml）、量筒、稀釋劑等移至微生物限度檢查室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用 物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中

10、出入操作間。編號 后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。開啟微生物限度檢查室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置，并使其工作時(shí) 間為30min。操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。 再用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用75%酒精棉球擦手， 穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。操作前先用75%酒精棉球擦手，再用75%酒精棉球擦拭供試品瓶、 盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或手術(shù)剪刀將供試 品啟封。4.6.2供試液的制備液體供試品 取供試品10ml，加ph 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚 山梨酯80使供試品分散均勻。水溶

11、性液體制劑也可用混合的供試 品原液供作為試液。固體、半固體或粘稠供試品 取供試品10g，加入ph 7.0無菌氯化 鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時(shí)加入適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴適當(dāng)加溫 使供試品分散均勻。4.6.3供試液的稀釋（10倍遞增稀釋法）取23支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑（此時(shí)操作一般為： 左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量，注意：勿 在酒精燈火焰正上方操作，以免火焰將供試液中菌細(xì)胞殺滅）。加 完稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。另取1支1ml滅菌吸管吸1：10均勻供試液1ml，加入裝有9ml滅 菌稀釋劑的試

12、管中混勻，即為1：100供試液。以此類推，根據(jù)供 試品污染程度，可稀釋至1：102、1：103、1：104等適宜稀釋級（至 少共3級）。每遞增1稀釋級，必須另換一支吸管。在作10倍遞增稀釋時(shí)，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm， 反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然 后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，再沿第2級稀釋管的 內(nèi)壁靠近液面（勿接觸液面）緩慢地吹出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無 粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。4.6.4注平皿 在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級吸管，吸取 各級稀釋液各1ml至每個(gè)滅菌平皿中（從高稀釋級至低稀釋級吸液 時(shí)可用1

13、支吸管），每一稀釋級注23個(gè)平皿（此時(shí)，一般為左手 執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時(shí)，將1ml供試液慢慢 全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。同時(shí) 作陰性對照（待各級稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取釋稀 劑各1ml，分別注入4個(gè)平皿中。其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對照；另 2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照，如另有ypd瓊脂測定酵母菌數(shù)時(shí)， 則再增加2個(gè)平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。4.6.5傾注培養(yǎng)基 將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基熔化,冷至約45時(shí)傾注 上述各個(gè)平皿15ml20ml，以順時(shí)針或反時(shí)針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿混 勻。注意:混勻時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上，置操作臺上待凝。4.6

14、.6薄膜過濾法：采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um，直徑一般為50mm,濾 器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。操作：取出檢查用集菌培養(yǎng)器，檢查包裝是否完好無損，將培養(yǎng)器 逐一插放在濾液槽座上，將其塑料軟管裝入集菌儀的蠕動泵的管槽 內(nèi)，注意定位準(zhǔn)確，軟管走勢順暢。其進(jìn)液軟管的雙芯針頭插入供 試液容器的塞上，開啟集菌儀，將集菌儀倒置，使藥液均勻通過濾 器，待藥液濾凈后，關(guān)閉電源，將雙芯針頭取下，插至裝有適宜沖 洗液容器的塞上，沖洗培養(yǎng)基濾膜（取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1ml 供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每 1g或1ml所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液1

15、ml，過濾。 用ph7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜， 每張濾膜每次沖洗量為100ml）。按照經(jīng)驗(yàn)證的沖洗次數(shù)及沖洗量試 驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)證無抑菌作用的供試品，薄膜過濾后，無需沖洗）。過濾， 濾干后關(guān)閉電源。取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰 紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每 種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作 為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。4.6.7培養(yǎng) 細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；霉菌、 酵母菌計(jì)數(shù)平板于2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。4.6.8菌落計(jì)數(shù)一般將平板置菌落計(jì)數(shù)

16、器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透 射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察，勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣 生長的菌落。注意:細(xì)菌菌落與霉菌菌落及酵母菌菌落以及它們與 供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的鑒別。必要時(shí)用放大鏡或用 低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生 沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多且難與菌落肉眼相鑒別的有 形物。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級的供試液多 增加注皿，注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計(jì)數(shù)菌 落數(shù)時(shí)作為對照?；蛴脿I養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細(xì)菌菌落與其 他的有形物區(qū)別開來。若平板上有2個(gè)或2個(gè)

17、以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)或2 個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界線，一 條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌 落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落， 一般不宜作為計(jì)數(shù)用。記錄各稀釋級平板的菌落數(shù)，求出各稀釋級2或3個(gè)平板菌落的平 均數(shù)。當(dāng)菌落數(shù)在15以上的同稀釋級二平板菌落數(shù)相差1倍時(shí),該 稀釋級菌落數(shù)不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)；當(dāng)2個(gè)平板菌落數(shù)均在15（含 15）以下時(shí)，兩個(gè)平板菌落數(shù)的差值允許范圍為04，17，2 9，310，412，514，615。超出以上范圍即視為操作誤差， 不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)。在下列情況下、點(diǎn)計(jì)菌落時(shí)間需提前

18、或延長培養(yǎng)時(shí)間： 菌落生長呈蔓延趨勢者，細(xì)菌點(diǎn)計(jì)需在24h，霉菌點(diǎn)計(jì)需在48h作 初步點(diǎn)計(jì)（點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，動作宜輕，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板或造成震 動，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌 落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差）。在48h點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，72h點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，菌落極小不易辨認(rèn)，需延長培 養(yǎng)時(shí)間47天，再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。對有異議的供試品以ypd培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再 點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。供試品按營養(yǎng)瓊脂平板點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)；固體供試品按玫瑰紅鈉瓊 脂平板點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，一般液體供試品按玫瑰紅鈉瓊脂平板點(diǎn)計(jì)霉菌 及酵母菌總數(shù)。4.6.9菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu，霉菌宜選取

19、平均菌落 數(shù)小于100cfu的稀釋級,作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。最高的平均菌落數(shù) 乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2 供試品中所含的菌數(shù)。每 片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。如各稀釋級的平板(濾膜上)均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板 有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過 濾1g或1ml供試品），或1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)， 用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計(jì)數(shù)。4.6.10結(jié)果報(bào)告菌落數(shù)在100cfu以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告；菌落數(shù)大于100cfu時(shí)， 取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約

20、規(guī)則處理。復(fù)試 供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合 格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩份，以三次 檢驗(yàn)結(jié)果的均值報(bào)告。4.6.11培養(yǎng)基稀釋法測定培養(yǎng)基稀釋法： 取低稀釋級供試液（原液1：10供試液）3份，每 份各1ml，分別注入5個(gè)或5個(gè)以上平皿中（每皿中0.2ml或103102n10310n10210表3 可能的大腸菌群數(shù)注：+代表檢出大腸菌群；代表未檢出大腸菌群。4.8.3乙型副傷寒沙門菌 取供試品10g或10ml,直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)1824小時(shí)。取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫

21、磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 24小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂） 培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 1824小時(shí)（必要時(shí)延長至4048小時(shí)）。若平板上無菌落生長或 生長的菌落不同于表6所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。若平板上生長的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接 種針挑選23個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行穿接 種，培養(yǎng)1824小時(shí)，如斜面 未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃 色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培 養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。表4 沙門菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)

22、基 菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色。沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色。曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落。麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色。4.8.4金黃色葡萄球菌 取供試品10ml（相當(dāng)于供試品1g、1 ml、10 cm2） ，直接或處理 后接種至適量（不少于100ml ）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉 湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂 培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時(shí)。若平板上無菌

23、落生長或生長的 菌落不同于表5所列的特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表5 金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征 培養(yǎng)基菌落形態(tài) 甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，園形凸起，邊緣整齊，外緣有黃色環(huán)，菌落直徑0.71mm。 卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，園形凸起，邊緣整齊，外緣有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑12mm。若平板上生長的菌落與上表所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選 23個(gè)菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小 時(shí)。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，作血漿凝固酶試驗(yàn).血漿凝固酶試驗(yàn) 取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌混合液 (1:1)0.5ml，再加入

24、可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、 營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗(yàn)管、陽性對照管 和陰性對照管。將3管同時(shí)培養(yǎng)，3小時(shí)候觀察直至24小時(shí)。陰性 對照管的血漿應(yīng)流動自如，陽性對照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿 凝固為血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對 照管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品 未檢出金黃色葡萄球菌。4.8.5白色念珠菌 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品

25、1g、1ml、10cm2）直接或處理后接 種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 72小時(shí)。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上， 培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長至72小時(shí)）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，偶見 淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色 變深，質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上 述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長 的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接 種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長至 72小時(shí)）。若平板上無綠色或翠

26、綠色的菌落生長，判供試品未檢出 白色念珠菌。若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種 于1%聚山梨酯80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時(shí)。取培養(yǎng)物 進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。芽管試驗(yàn) 挑取1%聚山梨酯80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種 于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，于35 37培養(yǎng)13小時(shí)，置顯微鏡下觀察孢子上有否長出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲和 芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。 4.9結(jié)果判斷：4.9.1供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不 再抽樣復(fù)試，即判供試品不合格。4.9.2供試品的細(xì)

27、菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品 種項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)從同一批號樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3 次結(jié)果的平均值報(bào)告。4.9.3若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)、控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)均符 合該品種項(xiàng)下規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；其中任何一項(xiàng)不符合該品 種項(xiàng)下規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。4.10微生物限度標(biāo)準(zhǔn)4.10.1.口服給藥制劑不含藥材原粉的制劑 細(xì)菌數(shù) 每1g不得過800cfu。每1ml不得過80cfu。 霉菌和酵母菌數(shù) 每1g或1ml不得過80cfu。 大腸埃希菌 每1g或1ml不得檢出。含藥材原粉的制劑 細(xì)菌數(shù) 每1g不得過8000 cfu（丸劑每1g不得過25000cfu）。 霉菌和

28、酵母菌數(shù) 每1g或1ml不得過80cfu。 大腸埃希菌 每1g或1ml不得檢出。 大腸菌群 每1g應(yīng)小于100個(gè)；每1ml應(yīng)小于10個(gè)。含動物組織（包括臟器提取物）及動物類原藥粉（蜂蜜、王漿、動 物角、阿膠除外）的口服給藥制劑 每10g或10ml還不得檢出沙 門菌。含豆豉、神曲等發(fā)酵原粉的制劑 細(xì)菌數(shù) 每1g不得過100 000cfu；每1ml不得過1000cfu。霉菌和酵母菌數(shù) 每1g不得過500cfu；每1ml不得過100cfu。大腸埃希菌 每1g或1ml不得檢出。大腸菌群 每1g應(yīng)小于100個(gè)；每1ml應(yīng)小于10個(gè)。口服液 細(xì)菌數(shù)：每1ml不得過80 cfu。 霉菌、酵母菌：每1ml不得

29、過80cfu。 大腸埃希菌：每1ml不得檢出。 沙門菌：每10ml不得檢出；活螨：不得檢出。不得有霉變.5.附錄 附錄1、微生物限度檢查原始記錄附錄2、微生物限度檢查原始臺帳6.變更記載和原因：修訂號執(zhí)行日期變更原因、依據(jù)及詳細(xì)變更內(nèi)容002004.03.01新文件。012005.10.01因執(zhí)行中國藥典2005年版一部。022008.06.01對文件內(nèi)容進(jìn)行細(xì)化。032010.10.01因執(zhí)行中國藥典2010年版一部。042013.10.01 定期修訂及公司名稱變更。7.相關(guān)文件和記錄：文件名稱文件編號隔水式恒溫培養(yǎng)箱的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-386spx-250b生化培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程z

30、sd-qa-406ldzx-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-384電熱恒溫干燥箱的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-387冰箱標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-407恒溫水浴鍋標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-429電動勻漿器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-410培養(yǎng)基配制操作規(guī)程zsd-qa-362第 21 頁（共 19 頁）附錄1 微生物限度檢查原始記錄 編號：zsd-qa-354-r-01 品 名 檢驗(yàn)證號批 號規(guī) 格類 別取樣日期 年 月 日檢品來源報(bào)告日期 年 月 日檢驗(yàn)依據(jù) 內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程zsd-qa-354儀器： 電熱恒溫干燥箱 型號： 編號：電子天平 型號： 編號

31、：全自動立式壓力蒸汽滅菌器 型號： 編號： 環(huán)境條件： 室溫： 濕度： %。稀釋劑：ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液。供試液的制備：稱取供試品10g置研缽中研磨成細(xì)粉，加稀釋劑至100ml，研勻制成1：10濃度的供試品溶液。檢查法：取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成110-2、110-3、110-4的稀釋級，分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入溫度不超過45的培養(yǎng)基1520ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)。每個(gè)稀釋級兩個(gè)平皿。同時(shí)取4個(gè)無菌平皿分別作細(xì)菌和霉菌陰性對照（各2個(gè)）。 附錄1 微生物限度檢查原始記錄品名： 批號： 編號：zsd-qa-354-r-01細(xì)

32、菌：儀器： 生化培養(yǎng)箱 型號： 編號： 生化培養(yǎng)箱 型號： 編號： 培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 配制批號：放入時(shí)間： 取出時(shí)間:稀釋級10-110-210-310-4陰性對照觀察溫度、時(shí)間24h平皿1248h平皿1272h平皿1272h平均數(shù)總 數(shù)結(jié) 果cfu/g結(jié)論：檢驗(yàn)者/日期： 復(fù)核者/日期： 附錄1 微生物限度檢查原始記錄 品名： 批號： 編號：zsd-qa-354-r-01 霉菌、酵母菌： 儀器：隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 型號： 編號： 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 型號： 編號： 霉菌、酵母菌培養(yǎng)基：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 配制批號： 放入時(shí)間： 取出時(shí)間：稀釋級10-110-210-31

33、0-4陰性對照觀察溫度、時(shí)間24h平皿1248h平皿1272h平皿1296h平皿12120h平皿12120h平均數(shù)總 數(shù)結(jié) 果cfu/g 結(jié)論： 檢驗(yàn)者/日期： 復(fù)核者/日期：附錄1 微生物限度檢查原始記錄 品名： 批號： 編號：zsd-qa-354-r-01大腸埃希菌：儀器：三用紫外分析儀 型號： 編號 生化培養(yǎng)箱 型號： 編號：大腸埃希菌培養(yǎng)基：膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基（bl) 配制批號： 署紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（emb) 配制批號： 4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸(mug)培養(yǎng)基 配制批號： 試液： 靛基質(zhì) 配制批號：大腸埃希菌對照菌：大腸埃希菌cmcc（b）44 102：編號 第 代 。檢驗(yàn)項(xiàng)目供試品陰性對照陽性對照bl增菌mug366nm靛基質(zhì)emb平板g氏染色乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基imvic結(jié) 果放入時(shí)間： 取出時(shí)間：活 螨 結(jié)論： 檢驗(yàn)者/日期： 復(fù)核者/日期：附錄1 微生物限度檢查原始記錄 品名： 批號：