抗抑郁藥R-托莫西汀中間體S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成課件

1、抗抑郁藥R-托莫西汀中間體S-3-氯- 1-苯丙醇的生物合成 1 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 研究背景研究背景 論文創(chuàng)新點論文創(chuàng)新點 實驗結(jié)果實驗結(jié)果 主要結(jié)論與建議主要結(jié)論與建議 1 2 3 4 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 研究背景研究背景 生物法制備手性藥物中間體具有反應(yīng)條件溫和、 選擇性好的優(yōu)點。而且使用微生物全細胞作為催 化劑還可省去酶純化與輔酶添加費用。 因此，利用生物法進行(S)-3-氯-1-苯丙醇的制備， 具有重要的現(xiàn)實意義。 抗抑郁

2、藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 研究背景研究背景 u目前對于(S)-3-氯-1-苯丙醇的制備多采用 化學法不對稱還原或生物化學方法拆分 外消旋醇；對于生物法不對稱還原前手 性酮制備手性醇研究較少。 u當前生物法制備手性醇最佳成果為：植 物細胞作為催化劑還原3-氯-1-苯丙酮， 20 mmol/L底物濃度下，反應(yīng)48 h，產(chǎn)率 達到78%，e.e.達到98% 。 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 論文創(chuàng)新點論文創(chuàng)新點 u1、篩選出一株催化性能優(yōu)異的酵母，與其它 相關(guān)

3、研究進行比較，本研究可以在實現(xiàn)同等對映 體過量率的情況下，得到更高的時空產(chǎn)率； u2、在水/有機溶劑體系和含離子液體的水/有 機溶劑體系中不對稱還原得到(S)-3-氯-1-苯丙醇， 未見報道； u3、研究了單一水相體系和兩相體系不同條件 對還原過程中細胞膜流動性、完整性等的影響， 初步探索了細胞生物學特性與不對稱還原反應(yīng)的 關(guān)系。 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 實驗結(jié)果與討論實驗結(jié)果與討論 1、菌株的篩選與鑒定 2、單一水相體系中的不對稱還原 3、水/有機溶劑兩相體系中的不對 稱還原 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫

4、西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 1、菌株的篩選與鑒定、菌株的篩選與鑒定 u菌株的篩選 菌株 產(chǎn)率(%)e.e. (%) 優(yōu)勢產(chǎn)物 漢遜德巴利酵母14.8253.31S Sigma面包酵母49.2790.09S 畢赤酵母NANA- 酵母FU572.4396.22S 高活性干酵母70.8594.12S 釀酒高活性干酵母30.2985.31S 表1 不對稱還原酵母菌株的篩選 由表1可知，同等條件下，酵母FU5菌株對底物3-氯-1-苯丙酮具有最佳 的還原產(chǎn)率和對映體過量率。因此，選擇其做為后續(xù)實驗菌株。 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1

5、-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 1、菌株的篩選與鑒定、菌株的篩選與鑒定 u菌株鑒定 采用ITS全長序列分析對菌株進行鑒定。 圖1 酵母基因組電泳圖 圖2 酵母ITS序列電泳圖 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 1、菌株的篩選與鑒定、菌株的篩選與鑒定 u構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 進化樹的構(gòu)建以剛果錐蟲（Trypanosoma congolense）ITS序列 作為外類群，以擔子 酵母（ Basidiomycete yeast ）ITS序列作為 參照，使用NJ算法，并對進化樹進行1000次可信度檢驗。 FU5 W37 Saccharom

6、yces cerevisiae strain NBRC 2114 Saccharomyces cerevisiae M01614 Saccharomyces cerevisiae strain isolate ZY9 Saccharomyces cerevisiae CHY1011 Saccharomyces cerevisiae strain DX2006P Basidiomycete yeast sp. DX2006Q Basidiomycete yeast sp. Trypanosoma congolense 62 99 86 0.1 圖3 基于ITS 序列和Neighbor-Joini

7、ng 算法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 2、單一水相體系中的不對稱還原、單一水相體系中的不對稱還原 表2 有氧無氧條件對不對稱還原的影響 圖4 底物濃度對不對稱還原的影響 0510152025 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Final product concentration(mmol/L) or Initial reaction rate(mmol/(L.h) Yield or e.e.(%) Substrate concentration (mmol/L) Yield

8、e.e. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 Initial reaction rate Final product concentration 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 2、單一水相體系中的不對稱還原、單一水相體系中的不對稱還原 圖5 細胞濃度對不對稱還原的影響 圖6 不對稱還原的時間進程 產(chǎn)率維持恒定的原因：（1）反應(yīng)達 到平衡；（2）體系中細胞死亡，反 應(yīng)不再進行；（3）底物或產(chǎn)物的毒 性導致細胞失去催化能力；（4）體 系中存在產(chǎn)物抑制。 04080120160200240 0.0 20.

9、0 40.0 60.0 80.0 100.0 Average specific production rate(mmol/(L.h.g) Yield or e.e.(%) Cell concentration(g/L) Yield e.e. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Average specific production rate 010203040506070 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Time (h) e.e. Yield 100 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯-

10、 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 2、單一水相體系中的不對稱還原、單一水相體系中的不對稱還原 C產(chǎn)物OD260OD280RGlcViability 空白 0.5010.223100.0100.0 30.5120.29595.497.6 60.5830.32591.693.4 90.6220.33678.982.1 120.7050.32852.065.5 150.7900.39223.338.7 u在反應(yīng)體系中加入產(chǎn)物對可能存在的產(chǎn)物毒性 進行考察。 圖7 不同濃度的產(chǎn)物對還原的影響 表3 不同濃度的產(chǎn)物對酵母的影響 說明體系中存在產(chǎn)物毒性。 03691215 0.0 20.0 40.0

11、 60.0 80.0 100.0 Yield (%) Product concentration(mmol/L) Yield 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Initial reaction rate Initial reaction rate(mmol/(L.h) 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 2、單一水相體系中的不對稱還原、單一水相體系中的不對稱還原 u在體系中加入環(huán)糊精、表面活性劑等添加物降 低體系中的產(chǎn)物濃度，并考察加入這些物質(zhì)對 反應(yīng)的影響。 0.02.55.07.510.012.

12、5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Cyclodextrin concentration(mmol/L) Yield e.e. 圖8 不同濃度的環(huán)糊精對還原的影響圖9 不同濃度的表面活性劑對還原的影響 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield(%) Surfactant concentration (mmol/L) Tween 80 SDS CTAB 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 2、單一水相體

13、系中的不對稱還原、單一水相體系中的不對稱還原 圖10 不同濃度的表面活性劑對酵母細胞的影響 -0.50.00.51.01.52.02.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 OD260 or OD280 Surfactant concentration (mmol/L) 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Viability(%) Surfactant concentration (mmol/L) CTAB SDS Tween 80 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 1

14、00.0 RGlc(%) Surfactant concentration (mmol/L) CTAB SDS Tween 80 Circle: CTAB Square: SDS Triangle:Tween 80 Open shape: OD260 Solid shape: OD280 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 Organic solvent log PYield (%)e.e. (%) 1-DMF-1.02.1589.44 2-乙酸乙酯0.6

15、80.2599.00 3-甲苯2.50.8382.20 4-正己烷3.555.4596.68 5-正辛烷4.546.8395.01 6-DBP5.46.9484.66 7-正十二烷6.637.4192.62 表4 兩相體系有機溶劑的選擇 圖11 兩相體系有機溶劑的選擇 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 圖12 兩相體系底物濃度對還原 的影響 圖13 兩相體系相體積比對還原 的影響 051015202530 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0

16、100.0 Yield or e.e.(%) Substrate concentration (mmol/L) Yield e.e. 012345678910 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Volume of n-hexane(mL) Yield e.e. 1.5 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 u單一水相體系和兩相體系的細胞膜流動性研究 （熒光分光光度計測定細胞熒光各向異性）： Ex 3

17、58 nm，Em 430 nm ，DPH標記時間：60min。 Entry r A:Control0.216 B:Control+1.5 mL 正已烷0.140 C: Control+20 mmol/L底物+1.5 mL 正已烷0.194 D :Control+20 mmol/L底物+1.5 mL 正已烷0.236 表5 不同條件處理酵母細胞的熒光各向異性 Control:10mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0),100 g/L酵母濕 菌體,30 g/L葡萄糖。 四種體系均在32 ，150 r/min下處理20 h。 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體

18、S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 u PI對酵母細胞染色，流式細胞儀檢測顯強熒光 和弱熒光的酵母個數(shù)，衡量酵母細胞膜完整性。 如膜流動性研究中四種方式處理酵母處于強熒光區(qū)的酵母細胞 占細胞數(shù)量比值都極低，其原因在于此種酵母細胞膜完整性難以被 破壞，四種處理方式可能對酵母細胞膜完整性影響較小。 圖14 酵母細胞流式圖 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 圖15 兩相

19、體系中底物的分配圖16 不同體系水相中的產(chǎn)物濃度 020406080100 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Substrate concentration in n-hexane(mmol/L) Substrate concentration in aqueous(mmol/L) Total concentration of substrate(mmol/L) 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 0510152025 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 Product concentration

20、in aqueous phase(mmol/L) Product concentration (mmol/L) monophasic aqueous system biphasic system 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 0102030405060708090 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Glucose concentration (g/L) Yield e.e. 輔助底物Yiel

21、d (%)e.e. (%) 甲醇24.0398.34 乙醇21.9398.41 丙三醇33.9697.21 異丙醇17.6897.98 正丁醇1.14100.00 葡萄糖62.0398.00 020406080100120140 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Cell concentration(g/L) Yield e.e. 0.00 0.10 0.20 0.30 Average specific production rate Average specific production rate(mmol/(L.h.g) 圖17

22、不同細胞濃度對還原的影響 表6 兩相體系輔助底物的選擇 圖18 不同葡萄糖濃度對還原的影響 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 圖20 不同pH對還原的影響圖19 不同反應(yīng)溫度對還原的影響 2426283032343638 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Temperature( 0C) Yield or e.e.(%) Yield e.e. 345678910 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yie

23、ld or e.e.(%) pH Yield e.e. 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 圖21 不同緩沖液濃度對還原的影響 BufferYield(%)e.e.(%) Control49.0297.52 Tris-鹽酸82.0198.12 Tris-乙酸78.9498.27 Tris-硼酸77.3098.01 Tris-磷酸81.8298.10 Tris-甘氨酸80.9098.29 表7 緩沖體系的選擇 050100150200 0.0 20.0 40

24、.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Buffer concentration (mmol/L) Yield e.e. 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 圖22 不同振搖速度對還原的影響 100150200250300 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Shaking rate (r/min) Yield e.e. 抗抑郁藥抗抑郁藥R-托莫西汀中間體托莫西汀中間

25、體S-3-氯氯- 1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成 3、水、水/有機溶劑兩相體系中的不對稱還原有機溶劑兩相體系中的不對稱還原 圖23 兩相體系不對稱還原的時間進程 在水/正己烷兩相體系中，酵母細胞的催化活性保持時間較 長；但相比與單一水相體系，即使在較高的底物濃度下，兩相 體系中的催化速率仍較低。 01020304050607080 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Time (h) e.e. in biphasic system yield in biphasic system yield in monophasic aqueous