對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的保健品課件

1、對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 1 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 2 化學(xué)性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類 化學(xué)毒物損傷肝臟的機(jī)理 具有保肝作用的功能食品 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù) 作用檢驗(yàn)方法 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 3 化學(xué)性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類 定義：是由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷。 分類：根據(jù)毒性的強(qiáng)弱, 這些親肝毒物可分為三 類： 1. 劇毒類：包括磷、三硝基甲苯、四氯化碳、 氯奈、丙烯醛等。 2.高毒類：砷、汞、銻、苯胺、氯仿、呻化 氫、二甲基甲酰胺等。 3.低毒類：二硝基酚、乙醛、有機(jī)磷、丙烯 晴、鉛等。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保

2、健品 4 化學(xué)毒物損傷肝臟的機(jī)理 1.脂肪變性。四氯化碳、黃磷等可干擾脂蛋白的 合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，形成脂肪肝。 2.脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，這是中毒性肝損傷的特殊表 現(xiàn)形式，如四氯化碳在體內(nèi)代謝產(chǎn)生一種氧化能 力很強(qiáng)的中間產(chǎn)物，導(dǎo)致生物膜上的脂質(zhì)過氧化， 破壞膜的磷脂，改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。 3.膽汁郁積反應(yīng)，主要與肝細(xì)胞膜和微絨毛受損， 引起膽汁酸排泄障礙有關(guān)。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 5 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 6 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 7 具有保肝作用的功能食品 目前我國(guó)已經(jīng)研制開發(fā)的, 經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān) 督管理局批準(zhǔn)的對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用的保 健

3、食品共有322種, 最新批準(zhǔn)的對(duì)化學(xué)性肝損傷有 保護(hù)作用的保健品是北京世紀(jì)合輝醫(yī)藥科技有限 公司開發(fā)的合輝牌和泰粉。主要原料葛根提取物、 黨參提取物、枳椇子提取物、紅景天提取物、葡 萄糖。 標(biāo)志性成分是葛根素。批準(zhǔn)日期 是2012 年9月18 日，批準(zhǔn)文號(hào)是國(guó)食健字G20120362 。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 8 我國(guó)具有保肝作用的功能食品的分類 根據(jù)主要功效成分和保健作用, 大致分為以 下四類。 1.由中草藥或其提取物研制而成。 如靈芝、大豆、枸杞、茶、黃芪、蘆筍、當(dāng) 歸、山楂、銀杏、香菇等。這類植物具有活血化 瘀的、清肝解毒、強(qiáng)肝益肝的作用, 從有效成分來(lái) 看, 這些保健

4、食品中含有多糖、黃酮類、甙類及萜 類化合物,如大豆皂甙、銀杏黃酮類、香菇多糖、 黃芪多糖等, 具有提高免疫能力、抗脂質(zhì)過氧化、 抗腫瘤、抗衰老等生物功能。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 9 2.目前公認(rèn)的具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增 殖、提高免疫能力的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 如牛磺酸、硒、維生素E、維生素C 等; 維生素E 和硒都是自由基清除劑,大劑量Vc能 減輕細(xì)胞脂肪性病變, 促進(jìn)肝細(xì)胞再生及肝糖元的 合成, 增強(qiáng)肝臟的解毒功能。因此, 對(duì)肝炎或肝性 昏迷者, 大劑量V c確有治療作用。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 10 3.由一些特殊動(dòng)物如牡蠣、毛蟲甘苦參、 甲魚、螞蟻等研制而成。 4

5、.一些特殊生物因子如胎盤因子、多 肽等。 谷胱甘肽( GSH) 能與進(jìn)入體內(nèi)的有毒 化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合, 并促其排出體外, 起到中和解毒的作用。 GSH 還可抑制乙醇侵害肝臟產(chǎn)生脂肪肝。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 11 名稱名稱功效成分功效成分批準(zhǔn)日期批準(zhǔn)日期批準(zhǔn)文號(hào)批準(zhǔn)文號(hào) 占熺牌克瑞地森膠 囊 銀杏葉黃酮 、紅 景天苷 2012-02-17國(guó)食健字 G20120139 合輝牌和泰粉葛根素2012-09-18國(guó)食健字 G20120362 九都圣方牌景天歸 芪顆粒 粗多糖 、紅景天 苷 2012-03-29國(guó)食健字 G20120204 亞和信牌和信茶總皂苷 、茶

6、多酚2012-03-14國(guó)食健字 G20120159 瑞養(yǎng)牌源生膠囊多糖 、總黃酮 2012-01-06國(guó)食健字 G20120055 五峰慧果牌沙棘油 軟膠囊 總黃酮 、維生素E 2012-01-06國(guó)食健字 G20120054 林洋牌石斛葛根杜 仲葉膠囊 粗多糖 、葛根素 、 綠原酸 2012-01-13國(guó)食健字 G20120100 合輝牌靈芝松花粉粗多糖2012-08-28國(guó)食健字 G20120336 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 12 名稱功能成分批準(zhǔn)日期批準(zhǔn)文號(hào) 健安豐牌椇杞丹參 片 粗多糖 、總黃酮 2012-03-07國(guó)食健字 G20120154 俊客小子牌苦丁茶 膠囊

7、苦丁茶總苷2012-05-14國(guó)食健字 G20120271 和治牌愛康九亨口 服液 甘草酸2012-06-01國(guó)食健字 G20120292 合輝牌葛根西洋參 顆粒（葡萄味） 紅景天甙 、葛根 素 2012-01-20國(guó)食健字 G20120105 合輝牌靈芝松花粉 片（草莓味） 粗多糖2012-01-20國(guó)食健字 G20120109 合輝牌靈芝松花粉 片（葡萄味） 粗多糖2012-01-13國(guó)食健字 G20120088 合輝牌靈芝松花粉 片（香橙味） 粗多糖2012-01-13國(guó)食健字 G20120089 博眾牌清新膠囊葛根素 、總皂苷 、 總黃酮 2012-01-13國(guó)食健字 G2012008

8、1 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 13 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 14 酒前酒后舒肝片 【功效成份及含量】: 粗多 糖 190mg ，梔子甙 461.54mg 【主要原料】枸杞子、梔子、 茯苓、丹參 【適宜人群】有化學(xué)性肝損 傷危險(xiǎn)者 【不適宜人群】少年兒童 【衛(wèi)生許可證】GD.FDA健 證字2006第5100S0267號(hào) 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 15 【品名】同仁堂牌警醒片 【主要原料】L-谷氨酰胺、 牛磺酸、維生素C、;-肉堿 酒石酸鹽、葡萄糖酸鋅、 碳酸鎂、維生素B1、葡萄 糖、硬脂酸鎂 【標(biāo)志性成分及含量】每 100g含：?；撬?0.1g、 維生

9、素C6.86g、L-肉堿 4.58g 【保健功能】對(duì)化學(xué)性肝 損傷有輔助保護(hù)作用 【適宜人群】有化學(xué)性肝 損傷危險(xiǎn)者 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 16 產(chǎn)品成分 牛磺酸-保護(hù)肝細(xì)胞、降低血清轉(zhuǎn)氨酶； L-谷氨酰胺-減少和對(duì)抗自由基對(duì)肝臟的損害； L-肉堿酒石酸鹽(BT)-補(bǔ)充酒精影響肝臟后合成 不足，并修復(fù)損傷肝細(xì)胞； 維生素B1-預(yù)防酒精性腦?。?碳酸鎂-能改善酒精引起的精神障礙； 維生素-C抗氧化、參與肉堿生物合成保護(hù)肝細(xì) 胞； 葡萄糖酸鋅-拮抗肝細(xì)胞凋亡； 葡萄糖-加快體內(nèi)酒精的分解速度，避免造成酒 精中毒。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 17 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助

10、保護(hù)功能食品評(píng) 價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定 1.試驗(yàn)項(xiàng)目 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為方案一（四氯化碳肝損傷模型） 和方案二（酒精肝損傷模型）兩種。 方案一（四氯化碳肝損傷模型） 體重 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT） 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 肝組織病理學(xué)檢查 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 18 方案二（酒精肝損傷模型） 體重 丙二醛（MDA） 還原型谷胱甘肽（GSH） 甘油三酯（TG） 肝組織病理學(xué)檢查 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 19 2.試驗(yàn)原則 （1）所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。 （2）根據(jù)受試樣品作用原理的不同，方 案一和方案二任選其一進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 2

11、0 3.結(jié)果判定 方案一（四氯化碳肝損傷模型）:病理結(jié)果陽(yáng) 性，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶二指標(biāo)中任一項(xiàng)指 標(biāo)陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有對(duì)化學(xué)性肝損傷 有輔助保護(hù)功能作用。 方案二（酒精肝損傷模型）:肝臟MDA、 GSH、TG三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品 對(duì)乙醇引起的肝損傷有輔助保護(hù)功能， 肝臟 MDA、GSH、TG三指標(biāo)中任二項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性，且 肝臟病理結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有對(duì)乙 醇引起的肝損傷有輔助保護(hù)功能作用。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 21 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方 法 方案一：四氯化碳肝損傷模型 1.原理 四氯化碳(CCl4)受到肝微粒體酶活化成為三 氯

12、甲烷自由基(CCl3)與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致蛋白 合成障礙、脂質(zhì)分解代謝紊亂，引起肝細(xì)胞內(nèi)甘 油三酯(TG)蓄積。CCl3也能迅速與O2結(jié)合轉(zhuǎn)化為 過氧化三氯甲烷自由基(CCl3O2)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化， 從而引起細(xì)胞膜的變性損傷,致使酶滲漏以及各種 類型的細(xì)胞病變，甚至壞死。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 22 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年大鼠或小鼠，單一性別，大鼠（180 220克），每組8-12只，小鼠（1822克），每組 10-15只。 3.實(shí)驗(yàn)方法和步驟 3.1 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間 實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè) 模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍（小鼠）或5倍 （大鼠）為其

13、中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組。 用CCl4（分析純）造成肝損傷模型，造模方式可 以灌胃或腹腔注射。小鼠CCl4灌胃濃度為1，以 食用植物油稀釋，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑 量為80 mg/kgBW)，大鼠CCl4灌胃濃度為23%， 灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為160240 mg/kgBW)。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 23 灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為80 mg/kgBW)， 大鼠CCl4灌胃濃度為23%，灌胃量5mL/kgBW(折 合CCl4的劑量為160240 mg/kgBW).必要時(shí)設(shè)陽(yáng) 性對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間

14、30天， 必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天. 3.2 給予受試樣品的途徑 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無(wú)法灌胃時(shí)將受試 樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動(dòng)物的飼 料攝入量或飲水量。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 24 3.3實(shí)驗(yàn)步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對(duì)照組和模 型對(duì)照組給予蒸餾水。將動(dòng)物每周稱重兩次，以 調(diào)整受試樣品劑量。于實(shí)驗(yàn)第30天將各組動(dòng)物隔 夜禁食16小時(shí)，模型組及各樣品組一次灌胃給予 CCl4，空白對(duì)照組給植物油，受試組繼續(xù)給予受 試樣品至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（與CCl4灌胃間隔4小時(shí)以上）。 給予CCl4 后，根據(jù)實(shí)際情況于 24或48小時(shí)處死 動(dòng)物，取血分離血清，測(cè)定ALT、AST，

15、并取肝臟 進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 25 3.4 檢測(cè)指標(biāo) 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST），肝臟病理組織檢查 4. 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）,谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 的測(cè)定 4.1 測(cè)定方法 可選用全自動(dòng)生化分析儀或賴氏法（試劑盒） 測(cè)定。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 26 4.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn) 行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05, 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值 F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間 均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差 不齊的

16、數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或 方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩 和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 受試樣品組的ALT、AST與模型對(duì)照組比較，差異 有顯著性，可分別判定ALT、AST結(jié)果陽(yáng)性。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 27 5. 肝臟病理組織學(xué)變化、診斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判定 5.1 實(shí)驗(yàn)材料 取大鼠肝臟左葉用10%福爾馬林固定，從肝左 葉中部做橫切面取材，常規(guī)病理制片（石蠟包埋， H.E染色）。 5.2 鏡檢 從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化， 用40倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片。可見小葉中 心性肝細(xì)胞的退行性病變和少數(shù)細(xì)胞壞死。主要

17、 病變類型有肝細(xì)胞氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝 聚、肝細(xì)胞水樣變性和細(xì)胞壞死等。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 28 5.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 分別記錄每個(gè)視野中的各種病變所占視野的 面積，并累計(jì)所觀察視野的病變總分。 肝細(xì)胞氣球樣變,（細(xì)胞腫大,胞漿殘留少許） 大致正常0分 氣球樣變的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/41分 氣球樣變的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/22分 氣球樣變的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的3/43分 氣球樣變的肝細(xì)胞占整個(gè)視野4分 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 29 肝細(xì)胞脂肪變性：（肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)界限清晰 脂滴空泡） 大致正常0分 脂肪變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/41分 脂肪變性的肝

18、細(xì)胞占整個(gè)視野的1/22分 脂肪變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的3/43分 脂肪變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野4分 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 30 胞漿凝聚：（胞漿嗜伊紅增強(qiáng)） 大致正常0分 胞漿凝聚的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/41分 胞漿凝聚肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/22分 胞漿凝聚的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的3/43分 胞漿凝聚的肝細(xì)胞占整個(gè)視野4分 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 31 水樣變性： 未見水樣變性的肝細(xì)胞0分 水樣變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/41分 水樣變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的1/22分 水樣變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野的3/43分 水樣變性的肝細(xì)胞占整個(gè)視野4分 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)

19、功能的 保健品 32 肝細(xì)胞壞死：（胞漿嗜伊紅變，凝固性壞死） 未見壞死細(xì)胞0分 散在個(gè)別細(xì)胞占整個(gè)視野的1/41分 壞死細(xì)胞占整個(gè)視野的2/42分 壞死細(xì)胞占整個(gè)視野的3/43分 壞死細(xì)胞彌漫性存在占整個(gè)視野4分 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 33 5.4 數(shù)據(jù)處理和病理結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn) 行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05, 結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值 F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間 均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差 不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或 方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

20、；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩 和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 34 （1）受試樣品任何一個(gè)劑量組與模型對(duì)照組之 間，氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性 或肝細(xì)胞壞死等肝細(xì)胞病變中，肝細(xì)胞壞死程度 減輕，差異有顯著性，而其它病變類型與模型對(duì) 照組比較明顯減輕或無(wú)明顯差異，可判斷動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)病理結(jié)果陽(yáng)性。 （2）受試樣品任何一個(gè)劑量組與模型對(duì)照組之 間，氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性 這四種肝細(xì)胞病變類型加重和減輕同時(shí)存在，差 異有顯著性，且肝細(xì)胞壞死程度減輕，差異有顯 著性，則可將其各種病理變化的得分相加，肝細(xì) 胞壞死評(píng)分2倍計(jì)入，以總分

21、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若差 異有顯著性，可判斷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果陽(yáng)性。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 35 6 結(jié)果判斷 在模型成立的前提下，ALT、AST兩項(xiàng)血液生 化指標(biāo)果為中任何一項(xiàng)和病理結(jié)陽(yáng)性，可判定受 試樣品對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用。 方案二：酒精肝損傷模型 1.原理 機(jī)體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化 下大量脫氫氧化，使三羧循環(huán)障礙和脂肪酸氧化 減弱而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。 同時(shí)乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì) 胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 36 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年小鼠或大鼠，單一性別，大鼠 （

22、180220克），每組8-12只，小鼠（18 22克），每組10-15只。 3. 實(shí)驗(yàn)方法和步驟 3.1 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間 實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組 和一個(gè)模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍 （小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個(gè)劑量 組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照 組。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 37 用無(wú)水乙醇（分析純）造成肝損傷模型，無(wú)水乙 醇濃度為50（以蒸餾水稀釋），小鼠灌胃量12 14mL/kgBW (折合乙醇的劑量為60007000 mg/kgBW)。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延 長(zhǎng)至45天。 3.2 給予受試樣品的途徑 經(jīng)口灌胃給予受試樣品

23、，無(wú)法灌胃時(shí)將受試 樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動(dòng)物的飼 料攝入量或飲水量。 3.3 檢測(cè)指標(biāo) 肝組織中丙二醛（MDA） 還原型谷胱甘肽（GSH） 甘油三酯（TG）的含量。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 38 3.4 實(shí)驗(yàn)步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對(duì)照組和 模型對(duì)照組給予蒸餾水。將動(dòng)物每周稱重兩次， 以調(diào)整受試樣品劑量。給予受試樣品結(jié)束時(shí)將模 型對(duì)照組及各樣品組一次灌胃給予50%乙醇 12mL/kgBW，空白對(duì)照組給蒸餾水，禁食16小時(shí)處 死動(dòng)物，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 39 4 肝勻漿中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（

24、MDA）測(cè) 定方法 4.1 原理 MDA (malondiadehycle) 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧 化的終產(chǎn)物之一，檢測(cè)其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過 氧化的程度。MDA與硫代巴比妥酸在酸性條件下共 熱，形成粉紅色復(fù)合物，吸收峰在535nm,具此可 測(cè)得MDA的含量 4.2 儀器與試劑 儀器 721分光光度計(jì)、微量加樣器、恒溫水浴鍋、 普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 40 試劑 0.2M乙酸鹽緩沖液 PH3.5 0.2M乙酸溶液 185mL 0.2M乙酸鈉溶 15mL 1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4保存3個(gè)月）， 臨用前用水稀釋成40nmol/m

25、L 8.1%十二烷基硫酸鈉SDS 0.8%硫代巴比妥酸TBA 0.2M磷酸鹽緩沖液 PH7.4 0.2M磷酸氫二鈉 1920mL 0.2M 磷酸二氫鉀 480mL 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 41 4.3 實(shí)驗(yàn)步驟 4.3.1 樣品制備 組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理 鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加 入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間 歇30s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成5組織勻漿（W/V）， 3000r/min離心510min，取上清液待測(cè)。 4.3.2樣品測(cè)定(見下一頁(yè)表) 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 42 試劑試劑空白管空白管

26、樣品管樣品管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管 5組織勻漿0.1mL 40nmol/mL四乙氧基丙烷0.1mL 8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL 0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL 0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mL H2O0.8mL0.7mL0.7mL 混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 43 4.3.3計(jì)算 過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mg組織）= 過氧化脂質(zhì)含量(nmol/100mg蛋白質(zhì))= A: 空白管吸光度 B：樣品熒吸光度 F：四乙氧基丙烷吸光度 C：四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL) K：稀釋倍數(shù) 1

27、00005. 0 1 40 AF AB KC AF AB 100 1 05. 0 1 40 ）每克組織蛋白（mgAF AB KC AF AB 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 44 4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序 先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值 F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間 均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差 不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或 方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩 和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)

28、果判定 在模型成立的前提下，受試樣品組的MDA含量 與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性，判定該指標(biāo) 結(jié)果陽(yáng)性。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 45 5 肝勻漿還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定方法 5.1 原理 GSH和5,5-二硫?qū)ο趸姿幔―TNB）反應(yīng)在 GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰 離子，于423nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，測(cè)定該離子濃 度，即可計(jì)算GSH的含量。 5.2 試劑 5.2.1 0.9生理鹽水 5.2.2 4磺基水楊酸溶液 5.2.3 0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0)： Na2HPO4 13.452g KH2PO4 0.722g 加蒸餾水至10

29、00mL。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 46 5.2.4 0.004DTNB溶液： 稱取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶 液(pH=8.0)中。 5.2.5 疊氮納緩沖液 NaN3 16.25 mg EDTA-Na2 7.44 mg Na2HPO4 1.732 g NaH2PO4 1.076 g 加蒸餾水至1000mL，用少量HCl、NaOH調(diào) pH7.0，4保存。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 47 5.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取還原型GSH 15.4mg，加疊氮納緩沖液至 50mL，終濃度為 1mmol/L，臨用前配制。 5.3 方法 5.

30、3.1 樣品測(cè)定： 取肝臟0.5g加生理鹽水5mL充分研磨成細(xì)漿 （10%肝勻漿），混勻后取漿液0.5mL加4%磺基水 楊酸0.5mL混勻，室溫下3000rpm離心10分鐘，取 上清液即為樣品。樣品測(cè)定管中加4.5mLDTNB，空 白管加0.5mL4%磺基水和4.5mLDTNB混勻，室溫放 置10 分鐘后，412nm處測(cè)定吸光度。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 48 5.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 123456 1mmol/L GSH(mL) 00.050.100.150.200.25 生理鹽水 (mL) 0.500.450.400.350.300.25 DTNB(mL)4.504.504.5

31、04.504.504.50 GSH量 (mol/L) 0100200300400500 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 49 5.3.3 計(jì)算 樣品GSH含量 (mol /g肝重) = 對(duì)應(yīng)曲線濃度值 (mol/L) 50g/L 5.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方 差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組 均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn) 組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正 態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或 方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后 仍未達(dá)到正

32、態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果判定 在模型成立的前提下，受試樣品組的還原型GSH含量與 模型對(duì)照組比較，差異有顯著性，判定該指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 50 2.6 肝勻漿中甘油三酯（TG）測(cè)定方法 2.6.1 測(cè)定方法：采用甘油三酯測(cè)定試劑盒（甘油磷酸氧 化酶過氧化物酶法）測(cè)定10%肝勻漿中的甘油三酯含量。 與血清甘油三酯測(cè)定方法相同，以等量10%肝勻漿替代血 清按操作說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定結(jié)果以mmol/g肝重表示。 2.6.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方 差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論

33、：各組 均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn) 組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正 態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或 方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后 仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 51 在模型成立的前提下，受試樣品組的TG與模 型對(duì)照組比較，差異有顯著性，判定該指標(biāo)結(jié)果 陽(yáng)性。 7 肝臟病理組織學(xué)變化、診斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判定 7.1 實(shí)驗(yàn)材料：從肝左葉中部做橫切面取材，冰 凍切片，蘇丹染色，。 7.2 鏡檢：從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病 理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片。主 要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積。 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 52 7.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在，稀少。肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在，稀少。0 0分分 含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/41分 含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/22分 含脂滴的肝細(xì)胞不超過3/43分 肝組織幾乎被脂滴代替4分 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的 保健品 53 7.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)