論文實例：透明質酸在腹膜透析中作用的機理研究

1、論文實例：透明質酸在腹膜透析中作用的機理研究 作者簡介：郭群英，女，1972年05月出生，1998年09月師從于中山大學葉任高教授，于20_年07月獲博士學位。 摘要腹膜透析,特別是持續(xù)性不臥床腹膜透析（continuousambulatoryperitonealdialysis,capd）是慢性腎功能衰竭的主要治療方法之一。超濾失敗是目前導致透析不充分乃至腹膜透析失敗的重要原因。如何預防腹膜超濾功能下降,有效地保護持續(xù)性腹膜透析中的腹膜功能,是腹膜透析研究的熱點。目前臨床尚無有效防止超濾失敗的滲透壓制劑或藥物。透明質酸是一種由雙糖單位n-乙酰葡糖胺和葡醛酸重復連接構成的多糖。我們以前的研究發(fā)

2、現(xiàn),在急性大鼠腹膜透析模型中應用透明質酸可以有效地增加超濾量，增加尿素氮的清除率,減少蛋白質丟失，而且這種作用與其分子量和其在透析液中的濃度密切相關。透明質酸的作用機理目前還不清楚。有研究表明，腹膜表面可能存在一層由腹膜間皮細胞分泌的透明質酸、磷脂所形成的表面活性層，而且這一層可能在腹膜轉運，特別是腹膜水轉運中起很重要的作用。通過振動腹腔來破壞這一液體層可增高腹膜的通透性。我們推測,長期腹透過程中，腹透液的沖刷可使這一表面活性層結構破壞，腹膜失去其表面這一極為重要的疏水層后功能發(fā)生改變，對水通透性增加，腹腔液體重吸收增加，從而導致超濾功能下降。透析液中加入的大分子量透明質酸（外源性透明質酸）在

3、腹腔靜水壓作用下，與內源性透明質酸層一起在腹膜表面形成一層保護膜（restrictfiltercake）,保護其免受非生理性腹透液損害,并有降低腹膜通透性的作用,從而減少腹腔液體吸收,增加超濾量，維護腹膜功能。 雖然透明質酸在大鼠急性腹膜透析模型中顯示了較好的效能，但其在大鼠慢性腹膜透析中的作用、持續(xù)性應用透明質酸后腹膜功能將如何變化尚不肯定。盡管國際腹透界對腹膜表面活性層有種種猜測，并通過對腹膜間皮細胞（mpcs）研究，間接證實了該層的存在，然而，至今仍未有形態(tài)學證據(jù)。 heldin的研究早已證實人間皮細胞(hmcs)能合成大量透明質酸（ha），新合成的ha在細胞外形成一環(huán)繞細胞的胞衣結構，

4、對細胞有保護作用。最近研究已證實哺乳動物有三種透明質酸合成酶基因has-1、has-2、has-3，這三個基因的產(chǎn)物透明質酸合成酶1(has-1)、has-2和has-3在氨基酸序列和分子結構特征上有很大的同源性。雖然酶學特征各有不同，這三種酶都可以在細胞膜內側面催化透明質酸鏈合成，但他們催化合成的ha鏈的長度卻各不相同。has1和has2蛋白催化合成大分子量的ha，has-3則催化合成較短的ha鏈。不同分子量的ha對細胞功能有不同的影響。不斷延長的透明質酸鏈伸出細胞膜外，成為細胞基質（胞衣樣結構）的骨架。哪一種透明質酸合成酶是人腹膜間皮細胞（hpmcs）透明質酸合成的關鍵酶？炎癥因子、各種腹

5、膜透析液滲透壓制劑對hpmcs透明質酸合成有什么影響？如前所述，透明質酸的作用與其分子量相關，不同分子量的外源性透明質酸對hpmcs內源性的透明質酸合成有什么影響？所有這些問題均未見報道。為探討這些國內外尚未解決的問題，我們設計并進行了以下研究： 一透明質酸在大鼠慢性腹膜透析模型中的作用 為了解透明質酸在大鼠慢性腹膜透析中的作用及腹膜功能變化，進行以下研究：20只雄性sd大鼠隨機分為3組。高糖組（n=8）和透明質酸組(n=6)每天分別腹腔內注射25ml的4.25葡萄糖腹膜透析液或含0.025透明質酸(分子量為1.6106道爾頓)的4.25葡萄糖腹膜透析液,共7天;正常對照組(n=6),不進行腹

6、腔注射。第8天進行4h腹膜功能實驗并于不同時點留取血和腹透液樣品進行分析。結果如下： 高糖組和透明質酸組的腹腔內容積(ipv)顯著低于正常對照組(p值均0.05）。高糖組尿素鈉總蛋白d/p值均顯著高于其他兩組(p均0.05）;對照組、l、il-1、tnf-組細胞培養(yǎng)上清液透明質酸（ha）的濃度均顯著高于對照組(p值均0.05）,甘露醇組has-3mrna表達較對照組減弱(p0.05）。對照組、高糖組、低糖組、葡聚糖組、甘露醇組細胞培養(yǎng)上清液ha的濃度均顯著高于對照組（p值均0.05）;高糖組ha濃度顯著高于低糖組、葡聚糖組和甘露醇組（p0.05）。 因此與高濃度葡萄糖相比，葡聚糖雖增強hpmc

7、shas-2mrna表達，但對hpmcs的has-3mrna無影響，提示其主要促進大分子透明質酸的合成，因而更接近hpmcs的生理狀態(tài)。這一作用與滲透壓可能無關。 3不同分子量透明質酸（ha）對人腹膜間皮細胞（hpmcs）透明質酸合成酶的調節(jié)作用 分離培養(yǎng)的第2代人腹膜間皮細胞(hpmcs)消化后傳入6孔培養(yǎng)板，將細胞隨機分為3組（每組6個樣本）：正常對照組（對照組）；高分子量透明質酸組（分子量為1，600，000道爾頓，濃度0.01,hha組）；低分子量透明質酸組（分子量為280，000道爾頓，濃度0.01,lha組）。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，提取總rna,以rt-pcr法檢測has-2mrna

8、和has-3mrna的表達;微粒排除法觀察細胞基質的面積,結果如下: lha組has-2mrna及has-3mrna表達均較對照組增強（p值均0.05。hha組has-2mrna表達較對照組增強，而has-3mrna表達與對照組無顯著差異。lha對has-3mrna表達增強作用是其對has-2mrna作用的4.8倍和1.025倍。 這提示lha和hha均促進hpmcshas-2mrna表達，lha對has-3mrna表達也有增強作用，而hha則沒有這一作用。因此，從選擇腹膜保護劑的角度分析，我們傾向于選擇更具生物相容性hmw-ha。 綜合以上結果，我們得出以下結論： 1.大鼠慢性腹膜透析模型中

9、多次重復使用透明質酸，可以防止由于長期使用以葡萄糖為滲透壓制劑的腹膜透析液所引起的腹腔吸收率增加，增加超濾量，保護腹膜功能。 2.通過電鏡研究證實(1)正常大鼠的腹膜表面覆蓋了一層假膜結構（即腹膜表面活性層）。(2)這一表面活性層中含有透明質酸，并可能含磷脂。 3.has-2是hpmcs透明質酸合成和細胞細胞衣樣結構形成的關鍵酶。正常生理狀態(tài)下，人腹膜間皮細胞以催化合成大分子量透明質酸為主。 4.炎癥因子l、tnf-、il-1均使hpmcs合成ha增加。由于其對has-3mrna表達的促進作用是主要的，故其主要促進低分子透明質酸的合成。 5.高濃度葡萄糖（90mmol/l），低濃度葡萄糖(30

10、mmol/l),葡聚糖(5)及90mmol/l甘露醇都促進人腹膜間皮細胞透明質酸合成。高濃度葡萄糖促進ha合成的作用最為明顯，其同時促進has-2和has-3mrna的表達。與高濃度葡萄糖相比，葡聚糖促進ha合成的作用較弱，其對has-3mrna沒有影響，主要促進大分子透明質酸的合成，因而更接近hpmcs的生理狀態(tài)。這一作用與各組間滲透壓差可能無關。 6.lha和hha均促進hpmcshas-2mrna表達，lha對has-3mrna表達也有增強作用，而hha則沒有這一作用。因此，從選擇腹膜保護劑的角度分析，我們傾向于選擇更具生物相容性hmw-ha。 themechanismofhyaluro

11、naninperitonealdialysis peritonealdialysis(pd)isanestablishedformofrenalreplacementtherapy.ultrafiltrationfailureisanimportantreasonofinadequacyandfailureofpdandtheresearchtopreventthedecreaseofultrafiltrationandmaintaintheperitonealfunctioninlong-termperitonealdialysisisalwaysthehototofpd.hyalurona

12、nisalongpolysaccharidechainthatismadeupofrepeatingdisaccharideunitsofn-acetylglucosamineandglucuronicacid.wehaverecentlyshownthatadditionofhyaluronaninanacuteratmodelofpdcoulddecreasetheperitonealfluidaorptionrateandimprovethene tultrafiltrationvolume.thiseffectisbothconcentrationandmolecularweightd

13、ependent.themechanismofhyaluronanisnotclear.ithasbeensuosedlongagothattherewasasurfactantlayeronperitoneumandthislayermayplayimportantroleinperitonealtraort,eeciallyonperitonealfluidtraort.vibrationcandestroythislayerandincreasetheperitonealtraortrate.wesuectinlong-termperitonealdialysisthislayermay

14、bewashedoffandtheloofthishydrophobiclayermightleadtotheincreaseoftheperitonealfluidaorptionandthedecreaseofultrafiltration.theaddedexogenoushyaluronanmightaccumulateonperitonealsurfaceandformarestrictivefilter“cake”withendogenoushyaluronan,whichmightprotecttheperitoneumfromun-physiologicaldialysatea

15、ndimproveultrafitrationthroughdecreasingperitonealtiuehydraulicconductivity.althoughapreviousshortreportshowedthatrepeateduseofhyaluronanincreaseperitonealfluidremoval,thedetailedchangeinperitonealtraortcharacteristicsafterrepeateduseofhyaluronaninperitonealcavityisstillnotknow.inaddition,althoughth

16、eperitonealsurfactantlayerwasindirectlyestablishedbytheresearchofhumanperitonealmesothelialcells(hpmcs),therewasnotanymorphologicalevidenceofit. recentstudieshaveshownthatperitonealmesothelialcellscouldsynthesizelargeamountofhyaluronanandthenewlysynthesizedpolymermayformapericellularhyaluronancoatto

17、protectthecellsfromdamage.recently,threerelatedmammaliangeneshavebeenidentifiedashasynthases,designatedhas-1,has-2andhas-3,andtheenzymesofthesethreegenesdilayhomologyinmolecularstructureandaminoacidsequence.allofthemcancatalyzethesynthesisofhyaluronanattheierfaceoftheplasmamembrane.thenewlysynthesiz

18、edpolymerextrudedthroughthemembrane,whereitcanformpericellularcoatbybindingwithotherpolymersorhyaluronanbindingprotein.whichhyaluronansynthaseisthecriticalenzymetocatalyzehyaluronanandformpericellularcoats?howdoinflammationmediatorsandosmoticagentsmodulatehyaluronansynthasesexpreioninhpmcs?asweknow,

19、hyaluronanwithdifferentmolecularweighthasdifferentfunction.howdoeshyaluronanwithdifferentweightaffectthehyaluronansynthasesexpreion?inordertosolvetheproblemswedesignedthefollowingstudies. 1.hyaluronanpreservesthemembranetraortpropertiesinchronicperitonealdialysisanimalmodelofrats twentymalesdratsrec

20、eiveddailyipinjectionof25ml4.25glucosedialysissolutionwithout(hp,n=8)orwith0.025hyaluronan(ha,n=6)foroneweek,anothersixratsdidnotreceiveanyperitonealinjection.twenty-fourhoursafterthelastinjection,a4hdwellstudyusing25ml4.25glucosedialysissolutionwithipvolumemarkerandfrequentdialysateandbloodsampling

21、swasperformedineachrat. resultipvwassignificantlyhigherinthehagroupascomparedtothehpgroup(anovarepeatedmeasurement,p0.01).theperitonealfluidaorptionrate,ke,wassignificantlyincreasedinthehpgroupascomparedtotheothergrou.thedirectlymphaticfluidaorptionrate,keb,wassignificantlyhigherinthetwodailyinfusio

22、ngrou(hpandha)ascomparedtothecontrolgroup.however,thetiueaorptionrate,ket,wassignificantlyhigherinhpgroupascomparedwithhagroupandcontrolgroup. 2.ultrastructuralidentificationofanovelmembraneonperitonealsurfaceandelectrogoldmicroscopicinvestigation. normalratperitoneumwastakenfromfoursdrats.thetiuesw

23、ereimmediatelyfixedusingoneofthefollowingfixativesfor24hoursbeforeconventionaltiueproceing:(1)2.5glutaraldehydeand2polyformaldehyde(control);(2)2.5glutaraldehydeand0.5cetylpyridinumchloridetofixmainlytheglycosaminoglycan(gag);(3)2oso4tofixthephoshpolipids(ph1);(4)4oso4(ph2)and(5)3taicacid(taicacidgr

24、oup).afterpostfixiation,dehydration,embedmentandultrathinsection,thesectiowereoervedinahitachi-600tramiionelectronmicroscope.twelvenickelgrids(200mesh)weretouchedgentlyontoperitonealsurfaceofratsfor twosecondsandthenfixedasfollowing:formaldehydevaporfor5miairdriedwith40for30miwashedwithtfor15min3.th

25、enthegridswereusedtoinvestigatehyaluronanbyelectrogoldmicroscop:sixnickelgridswereincubatedwithha-biotin,theothersixwereincubatedwithtascontrol. resultinthecontrol,theperitonealmesotheliumwascoveredwithmicrovilliwhereasnosurfacelayerwasoerved.however,inthegaggroup,thereaearedtobeadiscontinuousamorph

26、ouslayercoveringthemesothelialcells.intheph1group,acontinuousamorphouslayercoveredtheperitonealsurfaceanditsthicknedependedontheabundanceofmicrovilli.thislayerwasmuchbetterpreservedintheph2groupwiththickneupto10m.inthetaicacidgroup,notonlythisstagnantlayercouldbeeasilyseen,wecouldbutalsooervetherewe

27、realotoflamellarbodiesinthelayerandiidethemesothelialcells.theimprintshowedperitonealsurfacelayerwithlatticesstructure.hapositivesignalcouldbeoervedintheexperimentalgroup,whereasinthecontrolgroupnogoldenparticlewasoerved. 3.hyaluronansynthase(has)2ecificantiseeoligonucleotidesinhibittheformationofpe

28、ricellularcoatinhumanperitonealmesothelialcells(hpmcs) asaprerequisitestudy,theexpreionofeachhasmrnainculturedhpmcswasmeasuredbyreversetracription-polymerasechainreaction(rt-pcr).onlyhas-2andhas-3mrnaexpreionweredetected,thelevelofhas-2mrnaexpreionwasabout10foldhigherthanthatofhas-3.has-2ecificantis

29、eeoligonucleotideswerethentrafectedintoculturedhpmcs.after0,8,48and24hoursthehpmcswereoervedusingparticleexclusionaayandtheirhas-2mrnaexpreionwasdetectedagain.theresultsshowedthathas-2mrnaexpreionwasmostlyinhibitedatthe24hourasmeasuredbyrt-pcr,andthediameteroftheextracellularcoatalmostdisaearcomplet

30、ely.seeandreversehas-2showednoeffect. 4.theimpactofinflammationonhyaluronansynthesesandaemblyinhumanperitonealmesothelialcells(hpmcs) hpmcswereculturedandstimulatedwithl,il-1bortnf-a.differenthasynthesizinggeneshas-2(whichsynthesizehighmolecularweighthyaluronan),andhas3(whichsynthesizelowmolecularwe

31、ighthyaluronan),weredetectedbyrt-pcr.thepericellularhyaluronancoatwasalsovisualizedbyparticleexclusionaay.theconcentrationofhyaluronaniculturedmediumwasmeasuredbyhyaluronanradio-immunoaaykits. resultl,il-1bortnf-aallstimulatedhas-2andhas-3mrnaexpreion.theeffectsoftheseinflammatorymediatorsonhas3expr

32、eionwasmuchhigherascomparedtotheireffectsonhas-2expreion,eeciallywiththestimulationofil-1bwhichincreasedthehas-3mrnaby19times.however,thesizesofthepericelluarhyaluronancoatinhpmcsdidnotchangesignificantlyafterl,il-1bortnf-astimulation.theconcentrationofhyaluronanininflammationmediatorsgrouweresignif

33、icantlyhigherthanthecontrolgroup. 5.theeffectofosmoticagentsonhyaluronansynthasesexpreioninhumanperitonealmesothelialcells culturedhpmcswerestimulatedwith90mmol/lglucose(hg),30mmol/lglucose(lg),5polyglucose(pg)and90mmol/lmaitol(mol).extracellularcellcoatwasoervedusingparticleexclusionaay,andtheexpre

34、ionofhyaluronansynthase2and3(has-2andhas-3)mrnainhpmcswasmeasuredbyreversetracription-polymerasechainreaction(rt-pcr).theconcentrationofhyaluronaniculturedmediumwasmeasuredbyhyaluronanradio-immunoaaykits. resulthas-2mrnaexpreioninthefourexperimentgrouwassignificantlyhigherthanthatofcontrolgroup.howe

35、ver,onlyhgenhancedhas-3mrnaexpreion.thesizesoftheextracelluarcoatinthefourgrouwerenotsignificantdifferentwiththatofcontrol.inaddition,hyaluronanconcentrationwassignificantlyhigherinthefourgrouascomparedwithcontrolgroup.thehyaluronanconcentrationinhggroupwasmuchhigherthantheotherthreegrou. 6.theeffec

36、tofhyaluronanwithdifferentmolecularweightonhyaluronansynthasesexpreioninhpmcs culturedhpmcswerestimulatedwith0.01lowmolecularweighthyaluronan (280,000da,lha)and0.01highmolecularweighthyaluronan(1,600,000da,hha).extracellularcellcoatwasoervedusingparticleexclusionaay,andtheexpreionofhyaluronansynthase2and3(has2andhas3)mrnainhpmcswasmeasuredbyreversetracription-polymerasechainreaction(rt-pcr). resultlhaandhhastimulatedhas-2mrnaexpreion,however,onlylhaenhancehas-3mrnaexpreion.thesizesoftheextracelluarcoatinthetwogrouwerenotsignificantdifferentwiththatofcontrol. inconclusion: