板栗總苞多酚提取工藝探析

1、板栗總苞多酚提取工藝探析 作者：石恩慧 郭凱軍 李紅 谷明燦 魯琳 賈昌喜 單位：北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 1材料與方法 11材料與主要試劑板栗總苞（采自北京市懷柔區(qū)板栗實(shí)驗(yàn)站）：用粉碎機(jī)將板栗殼粉碎并過80目篩，18避光保存?zhèn)溆谩Ｖ饕噭焊Ａ址樱╢c）試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量98）和dpph購(gòu)于sigma公司；abts購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社；維生素c和維生素e購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。 12板栗總苞多酚提取工藝流程干燥板栗總苞粉碎溶劑與物料混合不同條件下水浴提?。總€(gè)樣提取2次）混合2次提

2、取液離心濃縮板栗總苞多酚提取液冷凍干燥提取物粉末。 13板栗總苞多酚提取條件的研究 131單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱取10g板栗總苞，用乙醇濃度為60，液料比為201（mlg），提取溫度為60，提取時(shí)間為120min作為進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)研究某一因素時(shí)，其他條件保持不變。乙醇濃度分別選用20、30、40、50、60和70；液料比（mlg）分別選用151、201、251、301和351；提取時(shí)間分別選用40、80、120、160和200min；提取溫度分別選用50、60、70、80和90，按上述設(shè)計(jì)分別進(jìn)行單因素不同水平的選擇試驗(yàn)，得到的提取物按照標(biāo)準(zhǔn)曲線處理方法，測(cè)定在765nm波長(zhǎng)處的吸

3、光度，并計(jì)算轉(zhuǎn)換為板栗總苞多酚提取得率，以此比較提取效果。 132正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為了綜合考慮各因素對(duì)板栗總苞多酚提取得率的影響，根據(jù)131中單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間和提取溫度為4個(gè)考察因素，利用spss160設(shè)計(jì)四因素四水平l16（44）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。 133板栗總苞多酚的測(cè)定 1331沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取5mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，定容至刻度，配成01mgml的標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取05、10、15、20和25ml沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液（01mgml）并定容至10ml，配制成質(zhì)量濃度為0005、0010、0015、0020、0025mgml的標(biāo)準(zhǔn)溶

4、液。精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液04ml于10ml離心管中，加入02mollfc試劑1ml、15na2co3溶液2ml，蒸餾水定容至8ml，25反應(yīng)2h。另精確吸取蒸餾水04ml，同法操作作為空白對(duì)照。在765nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度。繪制吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），并擬合線性回歸方程。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y4323x00166（r209998）。式中：y為吸光度；x為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mgml）。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，沒食子酸在濃度為00050030mgml區(qū)間有良好的線性關(guān)系。 1332板栗總苞多酚提取得率、多酚含量計(jì)算按照以下公式計(jì)算板栗總苞多酚提取得率、多酚含量：提取得率（）提取物質(zhì)量原

5、材料質(zhì)量x100；多酚含量（）提取多酚質(zhì)量提取物質(zhì)量x100。 14板栗總苞多酚體外抗氧化試驗(yàn) 141樣品處理板栗總苞多酚和維生素c母液的配制：分別精確稱取05g板栗總苞多酚和維生素c粉末放于燒杯中，加蒸餾水溶解，將此溶液轉(zhuǎn)移到500ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配成終濃度為1mgml的母液；維生素e母液的配制：精確稱取05g維生素e粉末于燒杯中，加體積比為10的乙醇水溶液20ml，振蕩使之溶解，轉(zhuǎn)移到500ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配成終濃度為1mgml的母液。 142dpph•清除率測(cè)定參考luo等18的方法，同時(shí)作適當(dāng)修改。取板栗總苞多酚、維生素c和維生素e母液，

6、分別稀釋成不同濃度（0025、0050、0075、0100、0125、0150、0175和0200mgml）的溶液。吸取不同濃度的板栗總苞多酚、維生素c和維生素e溶液20ml，加入20mldpph•溶液（02mmoll），搖勻，避光放置30min。以無水乙醇調(diào)零，測(cè)定517nm波長(zhǎng)處的吸光度（a樣）；分別測(cè)定20ml不同濃度的板栗總苞多酚、維生素c和維生素e溶液與20ml無水乙醇混合液的吸光度作為對(duì)照（a對(duì)照）；測(cè)定20mldpph•溶液與20ml無水乙醇混合液的吸光度作為空白（a空白）。dpph•清除率按以下公式計(jì)算：dpph•清除率（）（1a樣a對(duì)照

7、a空白）x100。 143abts•清除率測(cè)定參考re等19的方法，同時(shí)作適當(dāng)修改。取板栗總苞多酚、維生素c和維生素e母液，分別稀釋成不同濃度（0050、0100、0150、0250、0300、0400、0450和0500mgml）的溶液。abts•儲(chǔ)備液配制：配制245mmoll過硫酸鉀，用過硫酸鉀溶解abts粉末，配成7mmollabts•儲(chǔ)備液，避光、4冰箱中保存?zhèn)溆?。abts•測(cè)定液配制：將abts•儲(chǔ)備液以磷酸鹽緩沖液（10mmoll，ph74）稀釋，使其吸光度在734nm波長(zhǎng)處達(dá)到（0700±0020）。測(cè)定方法：取4

8、mlabts•測(cè)定液，加入40μl不同濃度的板栗總苞多酚、維生素c和維生素e溶液，振蕩30s，反應(yīng)10min，在734nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（a樣）。abts•清除率按以下公式計(jì)算：abts•清除率（）（1a樣0700）x100。 144豬油pov測(cè)定取板栗總苞多酚母液，分別稀釋成濃度為0（對(duì)照組）、50、100、150和200μgml的板栗總苞多酚溶液，各取4ml，分別添加到盛有4g豬油的燒杯中，混勻，放于60烘箱里20，每個(gè)濃度做3個(gè)平行試驗(yàn)，分別在0、4、8、12、16和20d時(shí)，參考gbt55382005方法測(cè)定豬油中pov。從結(jié)果中選取板栗總苞

9、多酚最佳濃度，然后，以同樣的方法和測(cè)定時(shí)間，測(cè)定板栗總苞多酚和維生素c、維生素e在此濃度下對(duì)豬油中pov的影響。15統(tǒng)計(jì)分析正交試驗(yàn)l16（44）由spss160軟件生成，采用glm程序?qū)φ辉囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，并確定提取工藝條件最優(yōu)化組合。采用anova程序?qū)Π謇蹩偘喾优c維生素c、維生素e抗氧化性進(jìn)行分析并用turkey進(jìn)行多重比較。#p#分頁標(biāo)題#e# 2結(jié)果與分析 21單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析由表2可知，隨著乙醇濃度增大，板栗總苞多酚提取得率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40時(shí)，提取得率達(dá)到最大，此后隨乙醇濃度的增大，提取得率逐漸減小，由此，初步選定的乙醇濃度為30；隨著液料比增加

10、，板栗總苞多酚提取得率呈現(xiàn)先增加后趨于水平，液料比在301（mlg）以后，提取得率趨于水平，考慮材料的節(jié)省，初步選用液料比為201（mlg）；隨著提取溫度的上升，板栗總苞多酚提取得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，到80時(shí)，提取得率達(dá)到最大，因此，初步選用的溫度為80；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，板栗總苞多酚提取得率先增加后趨于穩(wěn)定，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中操作時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)提高成本，浪費(fèi)能源，因此，初步選用的提取時(shí)間為160min。 22正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 221正交試驗(yàn)結(jié)果及其方差分析和最優(yōu)條件分析表3給出正交試驗(yàn)的結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了方差分析，由表4可知，校正模型達(dá)到極顯著水平（p001），說明模型擬合程度良好，

11、誤差小，模型是合適的；校正模型的相關(guān)系數(shù)r20992，校正決定系數(shù)r2adj0960，說明試驗(yàn)方法可靠，能較好地描述試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)的分析是可行的。根據(jù)四因素p值的大小可知，提取溫度（d）、乙醇濃度（a）和液料比（b）對(duì)板栗總苞多酚提取得率有顯著或極顯著影響（p005或p001），提取時(shí)間（c）無顯著影響（p005），因此，影響因素主次順序?yàn)椋篸abc。表5顯示了各因素不同水平的板栗總苞多酚提取得率，從結(jié)果直觀分析，各因素水平對(duì)板栗總苞多酚提取得率影響的強(qiáng)弱順序是：a30a40a50a20，b181b211b241b151，c140c110c170c80，d80d60d70d90，因此確

12、定板栗總苞多酚最優(yōu)提取工藝為：a30b181c140d80，即乙醇濃度30，液料比181（mlg），提取時(shí)間140min，提取溫度80。 222板栗總苞多酚提取得率和多酚含量取10g板栗總苞粉末，按上述正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的最佳工藝條件提取2次，濃縮、冷凍干燥得到板栗總苞多酚粉末。稱取部分板栗總苞多酚粉末，用蒸餾水溶解，定容、檢測(cè)吸光度，并換算得到板栗總苞多酚提取得率和多酚含量。計(jì)算出本試驗(yàn)條件下板栗總苞多酚提取得率為2261，其中多酚含量為5123 23板栗總苞多酚體外抗氧化性 231板栗總苞多酚對(duì)dpph•清除能力的影響由圖2可知，在00030025mgml范圍內(nèi)，隨著板栗總苞多酚和

13、維生素c溶液濃度的增加，dpph•清除率增加，并具有一定線性關(guān)系，線性方程分別為y32793x105（r209870）和y3214x18262（r209388），當(dāng)濃度達(dá)到0025mgml后，dpph•清除率趨于穩(wěn)定；隨著維生素e溶液濃度增加，dpph•清除率不斷增加并具有一定線性關(guān)系，線性方程為y10799x89083（r209523）。dpph•清除能力的大小常用半清除率（ec50）表示，ec50是當(dāng)清除率達(dá)到50時(shí)所需要的抗氧化劑濃度，因此，本試驗(yàn)中板栗總苞多酚、維生素c和維生素e的ec50分別為00120、00097和03810mgml，ec50

14、越小，清除dpph•的能力越大，則其抗氧化能力就越強(qiáng)，由此得出，板栗總苞多酚的抗氧化能力與維生素c相當(dāng)，且兩者的抗氧化能力均優(yōu)于維生素e，所以板栗總苞多酚有較強(qiáng)的抗氧化能力。 232板栗總苞多酚對(duì)abts•清除能力的影響abts經(jīng)過氧化生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色的abts•，當(dāng)有抗氧化物后，其與abts•反應(yīng)使反應(yīng)體系褪色。由圖3可知，板栗總苞多酚、維生素c和維生素e對(duì)abts•的清除能力隨板栗總苞多酚、維生素c和維生素e溶液濃度的增大而增大，維生素e很快達(dá)到平衡，在00200mgml之間它們的清除自由基的能力都具有一定的線性關(guān)系，線性方程分別為y349

15、41x95204（r209952），y33639x38379（r209775）和y61048x86888（r209838），它們的ec50分別為01160、01370和06767mgml，所以，板栗總苞多酚對(duì)abts•的清除能力優(yōu)于維生素c和維生素e。由此可知，板栗總苞多酚對(duì)abts•有很好的清除能力。 233板栗總苞多酚對(duì)豬油pov的影響由圖4可知，經(jīng)過20d的60加熱強(qiáng)化氧化作用，對(duì)照組（0μgmg）豬油的pov迅速增大，而添加板栗總苞多酚組的pov顯著小于對(duì)照組（p005），由此說明板栗總苞多酚對(duì)豬油有良好的抗氧化效果，且抗氧化作用與板栗總苞多酚溶液濃度有關(guān)，隨

16、著濃度的增加，板栗總苞多酚的抗氧化性能逐漸升高，濃度在0100μgmg之間板栗總苞多酚的抗氧化性能變化顯著（p005），而濃度在100200μgmg之間，抗氧化性能變化不顯著（p005），所以，選100μgmg作為板栗總苞多酚對(duì)豬油抗氧化的最佳濃度，此濃度下板栗總苞多酚的抗氧化效果與同濃度的維生素c相當(dāng)，且二者均優(yōu)于同濃度的維生素e（圖5）。因此，板栗總苞多酚能很好地抑制動(dòng)物油pov的升高。 3討論 31板栗總苞多酚提取工藝的優(yōu)化 李金鳳等14采用水浴法浸提板栗殼多酚，得到的最佳提取條件為：乙醇濃度597，液料比181（mlg），浸提溫度526，浸提次數(shù)3次。在此最優(yōu)工藝條件

17、下板栗殼多酚提取得率759。魯曉翔等15采用水浴振蕩法優(yōu)化板栗殼多酚的提取工藝，最終確定最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度30，液料比231（mlg），并在70水浴條件下振蕩提取170min。在此條件下，板栗殼多酚提取得率79。以上板栗殼多酚提取得率都低于本研究板栗總苞多酚提取得率，出現(xiàn)這樣結(jié)果的原因可能是板栗總苞中多酚含量高于板栗殼中的多酚含量。焦啟揚(yáng)等12和張琳等13分離并鑒定板栗總苞乙醇提取物的化學(xué)成分，并鑒定化合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)板栗總苞提取物有沒食子酸、鞣花酸、莽草酸、槲皮素、原兒茶素、齊墩果酸、烏索酸等多種多酚成分，并具有抗糖尿病作用。杜運(yùn)平等21采用醇水溶液為提取劑提取板栗苞多酚，優(yōu)化工藝為：4

18、0的乙醇濃度，液料比為201（mlg），在80提取條件下提取120min，在此條件下，多酚含量為4983，與本研究提取方法乙醇濃度為30，液料比為181（mlg），提取時(shí)間為140min，提取溫度為80相似，但其提取物中的多酚含量低于本研究所獲得的多酚含量（5123）。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)提取工藝可行，同時(shí)節(jié)省了原材料，降低了提取物中乙醇的殘留量，提高了多酚提取得率。#p#分頁標(biāo)題#e# 32板栗總苞多酚體外抗氧化性研究 板栗總苞多酚研究的最多是其抗氧化性，本研究發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的抗氧化能力，目前還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于板栗總苞多酚抗氧化性研究的文獻(xiàn)報(bào)道。但是前人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)板栗殼、花、葉和果仁等的多酚具有抗氧化能力。魯曉翔等15研究板栗殼與維生素c對(duì)dpph•溶液清除率的大小，并確定板栗殼多酚抗氧化性的大小，試驗(yàn)結(jié)果為5mgml的多酚提取液對(duì)dpph•的清除率為9149，低于維生素c的清除率（9618）。通過同樣的方法李金鳳等14研究發(fā)現(xiàn)，板栗殼提取物的濃度為200mgl時(shí)，dpph•抑制率達(dá)897，均高于同質(zhì)量濃度的2，6二叔丁基4甲基苯酚（bht），但低于同質(zhì)量濃度維生素c。但本研究表明，板栗總苞多酚與維生素c抗氧化能力相當(dāng)，與以上研究板栗殼多酚和維生素c抗氧化能力的比較結(jié)果不同，可能是由于板栗總苞中多酚的含量高于板栗殼所致。