植物組織培養(yǎng)實驗基本步驟

1、植物組織培養(yǎng)實驗基本步驟一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制將大量元素配制成 10 倍的母液，使用時再稀 釋 10 倍。按照配方表中用量依次分別稱取擴(kuò)大 10 倍的： NH4NO3 、KN03 、KH2PO4 、 MgSO4 7H2O 、 CaCI2 2H2O，所有藥品稱取完畢后用蒸餾水逐個溶解， 待全部溶解后，最后定容至 500ml，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶 中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制 人姓名，置于4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、MS微量元素母液的配制將微量元素配制成 100倍的母液，使用時再稀 釋100倍。按照配方表中用量分別依次稱?。?MnSO4 4H2O 、 Zn

2、S04 7H2O 、H3BO3 、KI 、CuSO4- 5H2O、 CoCI2 6H2O，用蒸餾水逐個溶解，待全部溶解后，用容 量瓶定容至500ml，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽， 注明母液名稱、 放大倍數(shù)、 配制日期、 配制人姓名， 置于 4C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?、MS鐵鹽母液配制將鐵鹽配制成 100倍的母液，使用時再稀釋 100 倍。 按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大 100 倍的： 稱FeS04 7H2O 和 Na2 EDTA ,把 FeS04 7H2O 和 Na2 EDTA 2H2O分別置于200ml蒸餾水中，加熱并不斷攪 拌使之溶解（磁力攪拌器，邊加熱，邊攪拌）。保持加熱， 把F

3、eS04溶液慢慢倒入Na2 EDTA溶液中并不斷攪拌，接近 沸騰時停止加熱， 待溶液冷卻后加蒸餾水到最終容積 500ml， 置于棕色細(xì)口瓶中，用力振蕩12min，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名。在室溫下避光 保存一段時間令其充分反應(yīng)后， 再置于4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、MS有機(jī)化合物母液的配制將有機(jī)化合物配制成 100 倍的母液，使用時再 稀釋 100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大 100倍的：肌 醇 、維生素 B1 、煙酸 、甘氨酸 、維生素 B6 、 蔗糖 ，用蒸餾水依次溶解并定容至 500ml 后，轉(zhuǎn)入 500ml 細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、配制日期、

4、配制 人姓名，置于4C冰箱中保存?zhèn)溆?。二、植物激素的配置常見激素：二氯苯氧乙酸?,4-D）、萘乙酸（NAA、 吲哚乙酸（IAA）、吲哚一3 丁酸（IBA）、激動素（6-糠 氨基嘌呤、KT）、6芐氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3、1 、生長素類：（ 1 ）、生長素類在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘 導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織（ 2）、常見生長素：二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA、吲哚乙酸（IAA）、吲哚一3 丁酸（IBA）。 NAA、 IAA、 IBA 被廣泛用于生根， 2，4D 有利于愈傷組織 的誘導(dǎo)和生長。 IAA 容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保 存時間不要太久。（3

5、）、溶解方法：稱 25mg吲哚乙酸（IAA），用 少量 1mol/L NaOH 或 95酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容至 25ml，搖勻。（ 4）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存2、細(xì)胞分裂素 組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和 由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長 素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器 官形成。（ 1）、常用的細(xì)胞分裂素有：6 芐氨基嘌呤（ 6BA、激動素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、玉米素（ZT）、 噻二唑苯基脲（ TDZ ）（ 2）、溶解方法：稱 25mg 6 芐氨基嘌呤（ 6 BA，用少量（1ml） 1mol/L HCL預(yù)溶解，再加蒸

6、餾水定容 25ml，搖勻。（ 3）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素（ GA3）（ 1）、溶解方法：用少量 95酒精預(yù)溶解，再加 蒸餾水定容。（ 2）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存（ 3）、赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容 易分解（ 4）、滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌4、脫落酸（1）、溶解：易溶于 NaHCO溶液、氯仿或丙酮。（ 2）、保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存三、培養(yǎng)基的制備與滅菌（一）、培養(yǎng)基的制備1 、將所需的各種母液和植物激素按順序放好，將潔凈的各 種玻璃器皿等放在指定位置。2、取燒杯一個內(nèi)盛 200ml 蒸餾水，按照培養(yǎng)基配

7、方所需量 依次取母液加入燒杯， 攪拌，按相應(yīng)培養(yǎng)基稱量蔗糖和瓊脂， 并添加到燒杯中，在電爐上加熱待瓊脂完全融化后加蒸餾水 定容至所需體積。3、充分混合后，用 1mol/LNaOH和1mol/LHCI調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 為（可將其調(diào)為），趁熱把培養(yǎng)基分裝到廣口瓶中，封好 瓶口，待滅菌。二）、培養(yǎng)基的滅菌 滅菌溫度及滅菌時間：121 C（ cm2）下滅菌20分鐘。（如 是實驗所用菌材滅菌，如無菌水及器械，則是 121 C（ cm2） 下滅菌 30 分鐘），此時可將需要滅菌的實驗儀器一起滅菌。1 、檢查滅菌鍋外層鍋內(nèi)水位，水量過少時應(yīng)加水。把分裝 好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋的消毒桶內(nèi)。2、蓋上鍋蓋，注意按照

8、說明操作并確定已蓋好，設(shè)置好溫 度和時間參數(shù)，開啟電源加熱滅菌。3、滅菌時間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降， 待滅菌鍋壓力表指針降到 0 時，打開排氣閥，旋松螺栓，開 啟鍋蓋，取出已滅菌的培養(yǎng)基。4、在培養(yǎng)基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口， 放置在水平桌面上自然冷卻。四、無菌操作技術(shù)和接種1 、接種前，用 75%酒精棉球擦拭超凈工作臺臺面，將培養(yǎng)基 及接種用具放入超凈工作臺臺面，打開超凈工作臺紫外燈及 接種房間紫外燈，照射約 30min，然后關(guān)閉紫外燈。打開房 間換氣扇及微開超凈工作臺的玻璃擋板，通風(fēng) 20min 后，即 可進(jìn)行無菌操作。（此步由專人統(tǒng)一負(fù)責(zé)）2、接種室滅菌過

9、程中同時對外植體進(jìn)行表面滅菌。先將接 種材料在流動的自來水下涮洗干凈，吸干水份后切成大約70mm長的片段放進(jìn)500ml燒杯中，用蒸餾水沖洗2次，倒掉蒸餾水后倒入 %的升汞水消毒， 將材料淹沒浸泡約 10分鐘（期 間用鑷子攪拌幾次）。3、把在消毒液中的接種材料轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上。用無菌 鑷子將已完成滅菌的接種材料轉(zhuǎn)移到燒杯中，用無菌水清洗3 次，每次不少于 1 分鐘，洗時不斷搖動燒杯以確保完全除 去消毒液。最后一次清洗后轉(zhuǎn)移到無菌托碟上，將接種材料 切成一定大?。ɑㄍ?、莖段）。4、取下培養(yǎng)瓶的蓋子用火燒灼瓶口。用鑷子將外植體輕輕 插入到瓊脂上，立即蓋上蓋子。5、操作完后將鑷子等器械浸入75%酒精中。 操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是將浸于酒精中的器械取出后置 于酒精燈火焰上充分灼燒，待冷卻后方可使用。6、將培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)箱里，在要求溫度下培養(yǎng)，觀察記錄五、所需實驗儀器及額外藥品電子分析天平、PH測試儀器、電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、 藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、移液槍、燒