《獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)》PPT課件

1、抗菌藥物最小抑菌濃度（抗菌藥物最小抑菌濃度（MICMIC）的測定）的測定 獸醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物MIC 的基本步驟，能準(zhǔn)確測出各種抗菌藥物的的基本步驟，能準(zhǔn)確測出各種抗菌藥物的 MIC值，了解單藥的抗菌活性；值，了解單藥的抗菌活性； 為后面棋盤法設(shè)計棋盤做準(zhǔn)備，求取棋盤法為后面棋盤法設(shè)計棋盤做準(zhǔn)備，求取棋盤法 的中心濃度。的中心濃度。 最小抑菌濃度（最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）：）：藥物在培養(yǎng)基中通藥物在培養(yǎng)基中通 過連續(xù)兩倍稀釋，眼觀可見待檢測細(xì)菌在培過連續(xù)兩倍稀釋

2、，眼觀可見待檢測細(xì)菌在培 養(yǎng)基中生長受到抑制的最低濃度即為該藥的養(yǎng)基中生長受到抑制的最低濃度即為該藥的 最小抑菌濃度。最小抑菌濃度。 【實(shí)驗(yàn)藥品及菌株實(shí)驗(yàn)藥品及菌株】 1.1.藥品藥品 氨芐西林（中國藥品生物制品檢定所，含量：氨芐西林（中國藥品生物制品檢定所，含量：86） 阿米卡星（齊魯制藥有限公司，阿米卡星（齊魯制藥有限公司， 效價：效價：650u/mg） 四環(huán)素（中國藥品生物制品檢定所，含量：四環(huán)素（中國藥品生物制品檢定所，含量：95%） 粘菌素（中國藥品生物制品檢定所，含量：）粘菌素（中國藥品生物制品檢定所，含量：） 【實(shí)驗(yàn)藥品及菌株實(shí)驗(yàn)藥品及菌株】 2.2.培養(yǎng)基培養(yǎng)基 MH營養(yǎng)肉湯、

3、營養(yǎng)肉湯、LB營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂 生理鹽水生理鹽水 3. 菌株菌株 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，由中國獸，由中國獸 醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。 【實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材】 96 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液槍孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液槍1mL1mL、200l 200l 各各 一支、槍頭一支、槍頭1mL1mL、200l200l、小試管、錐形瓶、小試管、錐形瓶 、試管架、酒精燈、平皿、酒精棉、試管架、酒精燈、平皿、酒精棉; ; 分析天平、自動高壓滅菌鍋、超凈工作臺、分析天平、自動高壓滅菌鍋、超凈工作臺、 3737恒溫培養(yǎng)箱。恒溫培養(yǎng)箱。 在在96孔板的前三排即孔

4、板的前三排即A/B/C三排每孔中各三排每孔中各 加入空白肉湯加入空白肉湯100L 空白肉湯空白肉湯100l 藥液藥液100l 空白肉湯空白肉湯100l 空白肉湯空白肉湯100l空白肉湯空白肉湯100l空白肉湯空白肉湯100l 取取100l 棄去棄去100l 2. 在在A/B/C三排的第三排的第1孔加配好的藥液孔加配好的藥液(濃度為濃度為512單單 位位/mL或或g/mL)100l，然后對藥物進(jìn)行二倍稀釋。，然后對藥物進(jìn)行二倍稀釋。 此時每孔藥物濃度從左到右依次為此時每孔藥物濃度從左到右依次為(單位單位:IU/mL或或 g/mL)： 256，128，64，32，16，8，4，2，1， 再在每一孔

5、中加入稀釋好的菌液再在每一孔中加入稀釋好的菌液100l,這樣這樣 就形成測定一個藥物就形成測定一個藥物MIC值的三次重復(fù)（值的三次重復(fù)（ A/B/C三排樣品）。此時每孔藥物濃度即最三排樣品）。此時每孔藥物濃度即最 終藥物濃度從左到右依次為終藥物濃度從左到右依次為(濃度濃度: 單位單位/mL 或或g/mL)： 128，64，32，16，8，4，2，1， 另外在同一塊板上做一排陰性對照（僅加另外在同一塊板上做一排陰性對照（僅加 空白肉湯不加菌液）和一排陽性對照（加空白肉湯不加菌液）和一排陽性對照（加 菌液肉湯不加藥液）；菌液肉湯不加藥液）； 將將96孔板放入孔板放入37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)

6、1620 小時后，觀察結(jié)果小時后，觀察結(jié)果。 操作完成后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時 123456789101112 A 100L肉湯 100L藥物 最后加100L菌液 100L100L100L100L100L100L100L100L100L100L100L B 同A C 同A D 步驟同A， 更換藥物 E 同D F 同D G 陽性對照100L肉湯 +100L菌液 H 陰性對照200L肉湯 無菌操作 所有用具都需經(jīng)過滅菌處理。 超凈臺使用前后都需用新潔爾滅擦拭，開紫外 燈進(jìn)行消毒；不能拿酒精棉球擦擋板。 操作前，用酒精棉球擦手。 每次槍頭過瓶口，瓶口都要經(jīng)火焰燒過；移液 槍和槍頭不準(zhǔn)在酒精燈

7、上烤！ 操作過程中盡可能不將96孔板蓋完全打開 。 移液器的使用 調(diào)刻度。 不倒立。 準(zhǔn)確吸取液體。 換槍頭。 3、其他注意事項(xiàng) 培養(yǎng)板上做好標(biāo)記（班級、姓名、時間、藥物名稱及 濃度）。 每藥做三個重復(fù)，每個板做一個陰性對照和一個陽性 對照。 超凈臺內(nèi)用過的不需要的東西都必須放到廢液缸內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)完后要收拾好臺面。 【結(jié)果判定結(jié)果判定】 以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥 物濃度為物濃度為MIC。當(dāng)陽性對照孔內(nèi)細(xì)菌明顯。當(dāng)陽性對照孔內(nèi)細(xì)菌明顯 生長試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法生長試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法 出現(xiàn)單一的跳孔時，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長出現(xiàn)單一的跳孔時，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長 的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不 應(yīng)報告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。應(yīng)報告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。 表表1 四種藥物對大腸桿菌的四種藥物對大腸桿菌的MIC值（值（g/mL或或IU/mL） 受試菌株受試菌株 藥物（藥物