第13章-檸檬酸發(fā)酵

1、第十三章第十三章檸檬酸發(fā)酵檸檬酸發(fā)酵 檸檬酸檸檬酸 n檸檬酸(Citricacid)分子式為C6H807。外觀為白色 顆粒狀或白色結(jié)晶粉末，無臭，具有令人愉快的 強烈的酸味，相對密度為1.6550。 n檸檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等 有機溶劑。商品檸檬酸主要是無水檸檬酸和一水 檸檬酸，前者在高于36.6的水溶液中結(jié)晶析出， 后者在低于36.6水溶液中結(jié)晶析出。它天然存 在于果實中，其中以柑桔、菠蘿、檸檬、無花果 等含量較高。 n檸檬酸是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。 檸檬酸檸檬酸1784年由年由Scheels氏發(fā)現(xiàn)氏發(fā)現(xiàn) 1893年前，主要用柑橘、菠蘿、檸檬等果實提取檸檬酸年前，主要用柑

2、橘、菠蘿、檸檬等果實提取檸檬酸 1893年德國微生物學家年德國微生物學家Wehmer發(fā)現(xiàn)二種青霉菌可以生成檸檬發(fā)現(xiàn)二種青霉菌可以生成檸檬 酸酸 1917年年Currie使用黑曲霉淺盤發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸使用黑曲霉淺盤發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸 1923年美國科學家研究成功了以廢糖蜜為原料的年美國科學家研究成功了以廢糖蜜為原料的淺盤法淺盤法檸檬檸檬 酸發(fā)酵，并在比利時設(shè)廠生產(chǎn)。酸發(fā)酵，并在比利時設(shè)廠生產(chǎn)。 1938年年P(guān)erquin和和1942年年Karrow進行了檸檬酸的深層發(fā)酵研究進行了檸檬酸的深層發(fā)酵研究 1951年美國年美國Miles公司首先以淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)水解后深層發(fā)公司首先以淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)水解后深

3、層發(fā) 酵大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。酵大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。 檸檬酸檸檬酸 檸檬酸檸檬酸 n我國1953年采用淺盤法發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸， n1968年用薯干為原料采用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸 檬酸成功，由于工藝簡單、原料豐富、發(fā)酵 水平高，各地陸續(xù)辦廠投產(chǎn)，至20世紀70年 代中期，檸檬酸工業(yè)已初步形成了生產(chǎn)體系。 n我國檸檬酸行業(yè)：產(chǎn)量位居世界第一；從技 術(shù)上，處于世界領(lǐng)先水平，并遠遠領(lǐng)先于其 他國家，其優(yōu)勢優(yōu)勢在于： 1.發(fā)酵采用的菌種（黑曲霉）具有雙重功能， 當?shù)矸墼媳灰夯?，即可進行發(fā)酵，不需要 將淀粉水解成葡萄糖， n簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。 2.采用邊糖化邊發(fā)酵工藝

4、，但發(fā)酵周期只有64小 時，生產(chǎn)周期比國外要短。 3.檸檬酸的產(chǎn)酸速度大大高于國外水平。 n平均產(chǎn)酸速率是國外的平均產(chǎn)酸速率是國外的2倍。倍。 檸檬酸的消費領(lǐng)域： 飲料行業(yè)占4045 食品添加劑等占1520 洗滌劑占2030 醫(yī)藥占5 其它占10 我國有機酸行業(yè)發(fā)展的思考（2011年8月） 我國檸檬酸年產(chǎn)能已經(jīng)達到百萬噸，占世界 的70左右；年產(chǎn)量達70余萬噸，約占世界 的65； 年出口量50萬噸，超過世界貿(mào)易總量的一半。 我國是世界上最大的檸檬酸出口國，主要出 口到印度、美國、歐洲、日本等地。 但在1970年時，我國的檸檬酸年產(chǎn)僅有130噸 我國檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的回顧和展望 n我國于五十年代初

5、期開始檸檬酸淺盤發(fā)酵研 究， n1968年輕工業(yè)部發(fā)酵研究所與黑龍江和平糖 廠合作，首先完成了甜菜糖蜜淺盤表面發(fā)酵 并投入工業(yè)化生產(chǎn)。 n1965年，上海市工業(yè)微生物研究所篩選出 N558菌種，并與天津工業(yè)微生物研究所，南 通發(fā)酵廠等合作，使之用于工業(yè)化生產(chǎn)，并 在全國推廣，形成我國獨特的薯干直接深層 發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸。 我國檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的回顧和展望我國檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的回顧和展望 n從七十年代到九十年代，我國一直致力于檸 檬酸生產(chǎn)菌種的改進， n1990年，上海市工業(yè)微生物研究所完成國家 七五攻關(guān)項目篩選出860菌種，發(fā)酵產(chǎn)酸達 20， n上海市工業(yè)微生物研究所開始以薯渣為主原 料，以黑曲霉

6、為菌種，固體發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬 酸鈣的研究。并于1977年中試成功并投入生 產(chǎn)，現(xiàn)在全國已有四十余個工廠，采用固體 發(fā)酵法由薯渣生產(chǎn)檸檬酸及檸檬酸鈣產(chǎn)品。 n我國以石油原料發(fā)酵檸檬酸開始于1970年， 先后在天津、上海、沈陽等地進行研究，并 一度投入小規(guī)模試驗生產(chǎn)，是用正烷烴為原 料，以解脂假絲酵母為菌種，發(fā)酵產(chǎn)酸達13 以上，轉(zhuǎn)化率140以上，但因檸檬酸只 占總酸的50%（另一半為異檸檬酸）而且由 于成本較高及石油原料緊缺和食用安全性等 原因，未能堅持研究和生產(chǎn)。 n我國的發(fā)酵技木及生產(chǎn)水平，特別是菌種 及發(fā)酵工藝均為世界領(lǐng)先水平。 n薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直 接深層發(fā)酵技術(shù)為我國所

7、獨有。 n國外發(fā)酵罐容積通常在200m3，并較早實現(xiàn) 自動控制；我國的最大檸檬酸發(fā)酵罐為 150m3 一、檸檬酸在食品中的應用 1)飲料與冰淇淋 n檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲料以及 軟飲料 n檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦 于飲料水果風味，而且具有增溶、緩沖、抗 氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素 等成分交融協(xié)調(diào)，形成適宜的口味和風味； 添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳 化穩(wěn)定性，防止氧化作用。 2)果醬與釀造酒 n檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進風味， 并使產(chǎn)品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝 膠性質(zhì)需要一定范圍的pH值，添加一定量的 檸檬酸可以滿足這一要求。 n當葡萄

8、或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足 時，可以用檸檬酸調(diào)節(jié)，以防止所釀造的酒 口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧 化和保護色素的作用，以保護果汁的新鮮感 和防止變色。 n3)腌制品 各種肉類和蔬菜在腌制加工時，加入或涂 上檸檬酸可以改善風味，除腥去臭，抗氧 化。 n4)罐頭食品 加入檸檬酸除了調(diào)酸作用之外，還有螯合 金屬離子的作用，保護其中的抗壞血酸， 使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植 物油中也有類似的作用。 n5)豆制品及調(diào)味品 用含有檸檬酸的水浸漬大豆，可以脫腥并便 于后續(xù)加工。檸檬酸可以用于大豆等豆類蛋 白、葵花子蛋白的水解，生產(chǎn)出風味別致的 調(diào)味品。它也可以用于成熟調(diào)味品（醬油等）

9、 的調(diào)味。 n6)其它 檸檬酸在醫(yī)藥、化學等其它工業(yè)中也有一定 的作用。檸檬酸鐵胺可以用作補血劑；檸檬 酸鈉可用作輸血劑；檸檬酸可制造食品包裝 用薄膜及無公害洗滌劑。 二、檸檬酸發(fā)酵微生物 n1)黑曲霉（Aspergillusniger）的形態(tài)特征 目前生產(chǎn)上常用產(chǎn)酸能力強的黑曲霉作為生產(chǎn) 菌。 n在固體培養(yǎng)基上，菌落由白色逐漸變至棕色。 孢子區(qū)域為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。 菌絲有隔膜和分枝，是多細胞的菌絲體，無色 或有色，有足細胞，頂囊生成一層或兩層小梗， 小梗頂端產(chǎn)生一串串分生孢子。 二、檸檬酸發(fā)酵微生物 n2)黑曲霉（Aspergillusniger）的生理特征 n黑曲霉生產(chǎn)菌可

10、在薯干粉、玉米粉、可溶性 淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培 養(yǎng)基上生長、產(chǎn)酸。 n生長最適pH因菌種而異，一般為pH37；產(chǎn) 酸最適pH為1.82.5。 n生長最適溫度為3337，產(chǎn)酸最適溫度在 2837，溫度過高易形成雜酸； n斜面培養(yǎng)：麥芽汁4Be的培養(yǎng)基。 二、檸檬酸發(fā)酵微生物 n黑曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種 活力較強的酶系，能利用淀粉類物質(zhì)，并 且對蛋白質(zhì)、單寧、纖維素、果膠等具有 一定的分解能力。 二、檸檬酸發(fā)酵微生物 n黑曲霉可以邊長菌、邊糖化、 邊發(fā)酵產(chǎn)酸的方式生產(chǎn)檸檬 酸。 三、檸檬酸發(fā)酵機理 n關(guān)于檸檬酸發(fā)酵的機制有多種理論， 目前大多數(shù)學者認為它與三羧酸循環(huán)

11、有密切的關(guān)系。 n糖經(jīng)糖酵解途徑(EMP途徑)，形成丙酮 酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮 酸脫羧形成C2化合物，兩者縮合形成 檸檬酸。 檸檬酸的溢出代謝檸檬酸的溢出代謝： 多種微生物均能因受刺激而過量合成檸檬 酸。研究檸檬酸溢出代謝的最好的例子無疑是 黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定環(huán)境條件下累 積檸檬酸，是因為在這種環(huán)境條件下代謝途徑 前段的運轉(zhuǎn)速率大于后段的運轉(zhuǎn)速率。 檸檬酸的溢出代謝是黑曲霉特有的遺傳和生 化機制與培養(yǎng)條件共同起作用的結(jié)果。 引起溢出代謝的原因原因包括以下三個方面三個方面： 高水平的檸檬酸合成能力。 這個能力由3個因素構(gòu)成。 第一：是在有高濃度草酰乙酸（OAA）的情況 下

12、對AcCoA具有高度親和力的組成型的檸檬 酸合成酶（CS）的存在； 第二：是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草 酰乙酸反應的高水平的組成型的丙酮酸羧化酶 （PC）的存在； 第三：是在缺少錳的條件下，蛋白質(zhì)分解或 蛋白質(zhì)合成受阻造成的銨的高濃度能解除檸 檬酸（CTA）對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。 此外，檸檬酸的分泌，降低其胞內(nèi)濃度。 較低的降解檸檬酸的能力。 這能力由兩個因素構(gòu)成。 第一：是低水平的-酮戊二酸脫氫酶（KD） 影響TCA環(huán)運行的暢通程度，使TCA環(huán)前半 部的中間產(chǎn)物積壓； 第二：在錳缺乏的條件下，順烏頭酸酶（AE） 和異檸檬酸脫氫酶（ID）的活性降低，從而 使檸檬酸的累積比其

13、它幾種酸（順烏頭酸、 異檸檬酸和-酮戊二酸）更明顯。 在檸檬酸過量合成階段，培養(yǎng)基的pH值 顯然會影響細胞膜對目的產(chǎn)物檸檬酸的跨膜 輸送； 檸檬酸的分泌也會影響培養(yǎng)基的pH值。 錳與鐵的缺乏有利于檸檬酸的排出。 黑曲霉中檸檬酸的代謝溢出黑曲霉中檸檬酸的代謝溢出 GG-6-P (磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶) 檸檬酸檸檬酸,NH4I + A 1.6二磷酸果糖二磷酸果糖 丙酮酸丙酮酸 草酰乙酸草酰乙酸 乙酰乙酰CoA 檸檬酸檸檬酸 順烏頭酸順烏頭酸 異檸檬酸異檸檬酸 -酮戊二酸酮戊二酸 (丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶) (檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶 ) -酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸

14、脫氫酶 順烏頭酸酶順烏頭酸酶 順烏頭酸酶順烏頭酸酶 TCA循環(huán)在檸檬酸積累中的調(diào)節(jié) n1)大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關(guān)鍵； n2)丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受 代謝調(diào)節(jié)的控制或極微弱; n3)TCA循環(huán)的阻斷或微弱(即順烏頭酸酶、異 檸檬酸脫氫酶和酮戊二酸脫氫酶活力降 低)，導致檸檬酸積累。而且，當檸檬酸濃 度超過一定水平，就抑制異檸檬酸脫氫酶活 力來提高自身的積累。 回補途徑回補途徑 TCA循環(huán)重要功能除產(chǎn)能外，為一些氨基酸循環(huán)重要功能除產(chǎn)能外，為一些氨基酸 和其它化合物的合成提供了中間產(chǎn)物；和其它化合物的合成提供了中間產(chǎn)物； 生物合成中所消耗的中間產(chǎn)物若得不到補充，生物合成中所

15、消耗的中間產(chǎn)物若得不到補充， 循環(huán)就會中斷；循環(huán)就會中斷； 回補方式：回補方式：通過某些化合物的通過某些化合物的CO2固定作固定作 用，用， 一些轉(zhuǎn)氨基酶所催化的反應也一些轉(zhuǎn)氨基酶所催化的反應也 能合成草酰乙酸和能合成草酰乙酸和 -酮戊二酸，酮戊二酸， 通過乙醛酸循環(huán)通過乙醛酸循環(huán) 通過某些化合物的通過某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循環(huán)的中固定作用使三羧酸循環(huán)的中 間產(chǎn)物得到回補：間產(chǎn)物得到回補： 丙酮酸羧化酶：丙酮酸羧化酶： CO2+丙酮酸丙酮酸+ATP+H2O Mg+ 草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶: CO2 +PEP+ H2O 草酰乙酸草

16、酰乙酸+H3PO4 蘋果酸酶蘋果酸酶: CO2 +丙酮酸丙酮酸+NADPH+H+ 蘋果酸蘋果酸+ NADP+ 為了能夠在己糖或戊糖的中間代謝物上進行好氧生長，為了能夠在己糖或戊糖的中間代謝物上進行好氧生長， 異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物至少要具備上述幾種酶之種的一個酶。至少要具備上述幾種酶之種的一個酶。 CO2固定作用補充TCA環(huán)的中間產(chǎn)物 轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用 n定義：定義：-氨基酸的氨基通過酶的催化， 轉(zhuǎn)移到-酮酸的酮基上，生成相應的 氨基酸；原來的-氨基酸則轉(zhuǎn)變成相 應的-酮酸。 R1 CHNH2 + COOH R2 C=O COOH R1 C=O + COOH R2 CHNH2 COOH 轉(zhuǎn)氨

17、酶轉(zhuǎn)氨酶 轉(zhuǎn)氨基作用幾點說明：轉(zhuǎn)氨基作用幾點說明： （1 1）可逆反應，）可逆反應， （2 2）轉(zhuǎn)氨酶的輔酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆）轉(zhuǎn)氨酶的輔酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆 胺胺 （3 3）重要的轉(zhuǎn)氨酶：）重要的轉(zhuǎn)氨酶： 丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALTALT）/ /谷丙轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPTGPT） 天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（ASTAST）/ /谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)(GOT) ALTALT常用于肝疾患（肝炎等）輔助診斷、常用于肝疾患（肝炎等）輔助診斷、 AST AST 用于心肌疾患（心肌梗塞等的輔助診斷）用于心肌疾患（心肌梗塞等的輔助診斷） CH3 H-C-NH2 + CO

18、OH COOH （CH2）2 C=O COOH 丙氨酸丙氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 谷氨酸谷氨酸 ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶，急性肝炎時血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，急性肝炎時血清ALT 活性顯著增高?；钚燥@著增高。 ALT CH3 C=O + COOH COOH （CH2）2 H- C-NH2 COOH COOH CH2 + H-C-NH2 COOH COOH （CH2）2 C=O COOH AST 天冬氨酸天冬氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸 谷氨酸谷氨酸 AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶，心肌梗塞時血清含量明顯增高谷草轉(zhuǎn)氨酶，心肌梗塞時血清含量明顯增高. COOH CH2 + C=O COOH COO

19、H （CH2）2 H-C-NH2 COOH 乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán) 草酰乙酸草酰乙酸 檸檬酸檸檬酸 琥珀酸琥珀酸 異檸檬酸異檸檬酸 蘋果酸蘋果酸 延胡索酸延胡索酸 乙醛酸乙醛酸 乙酰乙酰CoA 乙酰乙酰CoA乙酸乙酸 乙酸乙酸 乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán) 能夠利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶， 它使乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴oA； 然后在異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶的作 用下進入乙醛酸循環(huán)。 乙醛酸循環(huán)的主要反應乙醛酸循環(huán)的主要反應： 異檸檬酸異檸檬酸 琥珀酸琥珀酸 +乙醛酸乙醛酸 乙醛酸乙醛酸 + 乙酸乙酸 蘋果酸蘋果酸 琥珀酸琥珀酸 + 乙酸乙酸 異檸檬酸異檸檬酸 凈反應：凈反應：2乙酸乙酸 蘋果酸蘋果

20、酸 檸檬酸發(fā)酵機理 n大量的胞內(nèi)NH4+和呼吸活性提高，使通過糖 酵解途徑的代謝得到加強。葡萄糖經(jīng)EMP通 路分解成為丙酮酸，進入三羧酸循環(huán)，在丙 酮酸脫氫酶復合物作用下氧化成為乙酰CoA 及CO2，然后在檸檬酸合成酶作用下與草酰乙 酸縮合而形成檸檬酸，而異檸檬酸脫氫酶、 烏頭酸酶因受到抑制，而使檸檬酸得以積累。 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸 丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸 乙酰輔酶乙酰輔酶A(CH3CO-CoA) CO2固定反應固定反應 +草酰乙酸草酰乙酸 順烏頭酸酶順烏頭酸酶檸檬酸檸檬酸 異檸檬酸異檸檬酸 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶 琥珀酸琥珀酸 KGA （檸檬酸合成酶）（檸檬酸合成酶） 檸檬酸發(fā)酵機

21、理檸檬酸發(fā)酵機理 n按照正常的微生物菌體的代謝規(guī)律，上述途按照正常的微生物菌體的代謝規(guī)律，上述途 徑并不能夠積累檸檬酸，而是進入徑并不能夠積累檸檬酸，而是進入TCA循環(huán)，循環(huán)， 被徹底氧化，檸檬酸產(chǎn)生菌之所以能夠大量被徹底氧化，檸檬酸產(chǎn)生菌之所以能夠大量 積累檸檬酸，其產(chǎn)生菌菌種必須具備一定的積累檸檬酸，其產(chǎn)生菌菌種必須具備一定的 內(nèi)在因素，也就是：檸檬酸后述的各種酶，內(nèi)在因素，也就是：檸檬酸后述的各種酶， 主要是，主要是，順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶 的的 活性喪失或非常微弱，否則，合成的檸檬酸活性喪失或非常微弱，否則，合成的檸檬酸 迅速被降解成其他物質(zhì)。迅速被降

22、解成其他物質(zhì)。 檸檬酸生物合成中的代謝調(diào)節(jié)與 控制追求檸檬酸的高產(chǎn)率 n檸檬酸是微生物生長代謝過程中的一個 中間性產(chǎn)物，在正常的微生物體內(nèi)不能 夠積累的，如果有積累的話，與檸檬酸 合成有關(guān)的各種酶的活性，則會受到抑 制或阻遏，那么，檸檬酸發(fā)酵過程中， 這種抑制或阻遏是如何被克服的呢？ 1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié) n從葡萄糖檸檬酸的合成過程中，PFK是 一種調(diào)節(jié)酶或者稱之為關(guān)鍵酶，其酶活性受 到檸檬酸的強烈抑制，這種抑制必須解除， 否則，檸檬酸合成的途徑就會因為該酶活性 的抑制而被阻斷，停止檸檬酸的合成， n研究表明，微生物體內(nèi)的NH4+，可以解除檸 檬酸對PFK的這種反饋抑制作用，在

23、較高的 NH4+的濃度下，細胞可以大量形成檸檬酸， 那么NH4+濃度是如何升高的呢？ 在正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激 酶有抑制作用，而AMP、無機磷、銨離子對該酶 則有激活作用，特別是 還能解除檸檬酸、ATP 對磷酸果糖激酶的抑制作用。 銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關(guān)系， 正是由于細胞內(nèi)銨離子濃度升高，使磷酸果糖 激酶對細胞內(nèi)積累的大量檸檬酸不敏感。 1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié) n研究表明，檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉如 果生長在Mn+缺乏的培養(yǎng)基中，NH4+ 濃度異常的高，可達到25mmol/L，顯 然，由于Mn+的缺乏，使得微生物體內(nèi) NH4+濃度升高，進而解除了檸檬酸對 P

24、FK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源 不斷的合成大量的檸檬酸。 Mn+ 缺乏如何會使缺乏如何會使NH4+濃度升高呢濃度升高呢？ n當培養(yǎng)基中Mn+缺乏時，NH4+濃度升高， 同時微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA谷氨酸、 Arg、Gin谷氨酰胺等），這些氨基酸的積累， 意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋 白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+ 的消耗下降，NH4+濃度就會升高，微生物 體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝關(guān)系可以使用 下圖示之： 氨基酸氨基酸 合成合成 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 分解分解 氨基酸氨基酸 氨基化合成氨基酸氨基化合成氨基酸 2.順烏頭酸酶活性的控制 n該酶的喪失或失活是阻斷TCA循環(huán)，大量生

25、成 檸檬酸的必要條件。通常檸檬酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該 酶的活性本身就要求很弱，但在發(fā)酵過程中仍 需要控制它的活性。由于該酶的活性受到Fe2+ 的影響，控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度，可以使 該酶失活。因此，檸檬酸發(fā)酵要求采用不銹鋼 反應器，目的就是控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度。 但是在檸檬酸發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的Fe2+的 濃度又要求不能夠低于0.1mg/L，原因目前尚 沒有搞清楚。 隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時，使順 烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活(順烏頭酸酶、 異檸檬酸酶在pH2.0時失活)，更有利于檸檬酸 的積累及排出細胞外。 順烏頭酸酶的活性：從理論上推測，順烏頭酸酶 失活，三羧酸循環(huán)阻斷

26、是累積檸檬酸的必要條件。 許多實驗指出順烏頭酸酶活力變化與檸檬酸累 積有密切關(guān)系。 。 添加順烏頭酸酶抑制劑可促進檸檬酸積累。 鐵為順烏頭酸酶的激活劑，用亞鐵氰化鉀除鐵， 可以握高檸檬酸產(chǎn)率。 n那么，解決了檸檬酸發(fā)酵過程中的上述幾 個問題：，是不是就意味著可以將葡是不是就意味著可以將葡 萄糖源源不斷的轉(zhuǎn)化成檸檬酸呢萄糖源源不斷的轉(zhuǎn)化成檸檬酸呢？ n提問：根據(jù)微生物代謝調(diào)節(jié)的基本理論， 還需要解決什么問題？ n菌體要大量合成檸檬酸，從葡萄糖經(jīng)過EMP 到檸檬酸整個代謝途徑需要暢通，在這個過 程中：丙酮酸氧化脫羧，每分子丙酮酸可產(chǎn) 生一分子的NADH，在有氧的條件下，每分 子的NADH經(jīng)過呼吸鏈

27、徹底氧化成H2O，并氧 化磷酸化產(chǎn)生3分子的ATP，造成了微生物體 內(nèi)能荷能荷的增加，能荷增加則抑制PFK等關(guān)鍵 酶的酶活性，使得從葡萄糖到檸檬酸的代謝 停止，怎么能夠大量合成檸檬酸呢？ 3.能荷能荷調(diào)節(jié)對檸檬酸發(fā)酵的影響 n如果NADH（還原型）不能夠快速 的被氧化轉(zhuǎn)變成NAD（氧化型）， 則整個反應就會因為缺乏作為推動 力的氧化型的NAD而停止，仍然不 能夠合成檸檬酸。 n檸檬酸產(chǎn)生菌可在有氧的條件下大量生成檸 檬酸，也就是說，NADH即被氧化了，又沒 有產(chǎn)生ATP。 n為了解釋這種現(xiàn)象，有人提出了一種假設(shè)： 該菌體內(nèi)存在一條側(cè)系呼吸鏈，NAD(P)H經(jīng) 過該呼吸鏈，可以正常的傳遞H+，將

28、其氧化 為H2O，但是并沒有氧化磷酸化生成ATP， 能夠正常產(chǎn)生ATP的呼吸鏈稱之為標準呼吸 鏈。 解偶聯(lián)劑（解偶聯(lián)劑（uncoupler）? n使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進行，而磷酸化不能使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進行，而磷酸化不能 進行，解偶聯(lián)劑為離子載體或通道，能增大線粒體內(nèi)膜對進行，解偶聯(lián)劑為離子載體或通道，能增大線粒體內(nèi)膜對 H+的通透性，消除的通透性，消除H+梯度，因而無梯度，因而無ATP生成，使氧化釋放生成，使氧化釋放 出來的能量全部以熱的形式散發(fā)。動物棕色脂肪組織和肌出來的能量全部以熱的形式散發(fā)。動物棕色脂肪組織和肌 肉線粒體中有獨特的解偶聯(lián)蛋白肉線粒體中有獨特的解

29、偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins， UCPs)，與維持體溫有關(guān)。常用解偶聯(lián)劑主要有：，與維持體溫有關(guān)。常用解偶聯(lián)劑主要有： n質(zhì)子載體：質(zhì)子載體： 2，4-二硝基酚二硝基酚(DNP，圖，圖)，羰基，羰基-氰氰-對對-三氟甲三氟甲 氧基苯肼氧基苯肼(FCCP)。 n質(zhì)子通道：增溫素（質(zhì)子通道：增溫素（thermogenin）。）。 n其它離子載體：如纈氨霉素。其它離子載體：如纈氨霉素。 n某些藥物：如過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯(lián)，某些藥物：如過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯(lián)， 從而使體溫升高。從而使體溫升高。 n實驗證明，在某些微生物體內(nèi)確實存在側(cè)系呼吸 鏈，該側(cè)

30、系呼吸鏈中的酶系強烈需氧，如在檸檬 酸的發(fā)酵中，發(fā)酵液的溶氧濃度在很低水平維持 一段時間，或中斷供氧一段時間（20分鐘），則 這一側(cè)系呼吸鏈不可逆的失活不可逆的失活，其結(jié)果是菌體不 再產(chǎn)酸，而是產(chǎn)生了大量的菌體。 n標準呼吸鏈的存在使得菌體在代謝過程中產(chǎn)生了 大量的ATP，用于菌體自身的生長上，這種現(xiàn)象， 在生產(chǎn)上通常稱之為：只長菌不產(chǎn)酸只長菌不產(chǎn)酸，大量的 葡萄糖被消耗了，卻沒有生產(chǎn)出檸檬酸，是一種 失敗，（大型檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)需要自己備用的發(fā) 電系統(tǒng)）。 n 理論可以指導實踐，反過來，通過實踐理論可以指導實踐，反過來，通過實踐 可以推動理論研究，豐富理論研究成果?？梢酝苿永碚撗芯?，豐富理論研

31、究成果。 科學研究過程中的許多基本規(guī)律是相同科學研究過程中的許多基本規(guī)律是相同 的，今天，我們在大學的學習，更多的的，今天，我們在大學的學習，更多的 是學習一種方法或者說一種思維。通過是學習一種方法或者說一種思維。通過 這個例子，我們可以學習到許多專業(yè)以這個例子，我們可以學習到許多專業(yè)以 外的知識外的知識首先為了解釋一種客觀想首先為了解釋一種客觀想 象，提出一種假設(shè)，然后通過實驗來證象，提出一種假設(shè)，然后通過實驗來證 明這種假設(shè)明這種假設(shè) CO2固定反應 n通過CO2固定反應提供C4二羧酸 n（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙 酸（C4二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 n（2）丙酮酸+

32、CO2=草酰乙酸（C4二 羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶 n以上兩種CO2固定反應所需要的輔酶都是 生物素。 檸檬酸發(fā)酵中，三個控制點檸檬酸發(fā)酵中，三個控制點 C6H12O6 控制Mn+ NH4+濃度，解 除檸檬酸對PFK的抑制 （1）點：EMP暢通無阻 控制溶氧，防止側(cè)系 呼吸鏈失活 丙酮酸 + 丙酮酸 （2）點：通過CO2固定反應生成C4二羧酸 乙酰輔酶A + C4二羧酸 檸檬酸 （3）點：檸檬酸后述的酶活性喪失或很低， 控制培養(yǎng)基中的Fe2+ 的濃度 檸檬酸發(fā)酵中，三個控制點檸檬酸發(fā)酵中，三個控制點 第一個調(diào)節(jié)酶是磷酸果糖激酶（PFK） 檸檬酸和ATP對該酶有抑制 生產(chǎn)菌需要解除該抑制作用 A

33、MP、無機磷以及NH4+對該酶有活化作用 NH4+有效解除檸檬酸和ATP對該酶有 抑制 ，故生產(chǎn)上通過添加銨鹽來 提高檸檬酸產(chǎn)量 Mn2+的影響： Mn2+缺乏 菌體的TCA酶活下降 Mn2+缺乏 可能干擾蛋白質(zhì)合成， 導致蛋白質(zhì)分解 NH4+水平升高 減少檸檬酸對 該酶的抑制 第二個調(diào)節(jié)點：CO2固定的酶活力高，保證草酰乙酸的供應 第三個調(diào)節(jié)點：TCA環(huán)上調(diào)節(jié) 檸檬酸合成酶： 許多細胞中該酶是TCA的調(diào)節(jié)酶， 但在黑曲霉中此酶無調(diào)節(jié)作用 順烏頭酸 水合酶： 理論上此酶失活 TCA環(huán)阻斷積累檸檬酸 順烏頭酸水合酶需要Fe2+ 故在發(fā)酵液中添加黃血鹽絡(luò)合Fe2+阻斷TCA環(huán)，積累檸檬酸 檸檬酸生

34、物合成途徑 10ATPO2HOHCO 2 3 OHC 9ATPO3HO 2 3 )H.3(NADH SH-CoAOHCOHCOOHHOOCCOCHSCoA-CO.CH COOHHOOCCOCHATPCOOH.C )H(NADHCOSCoA-COCHSH-CoAOHC . )H2(NADH2ATPOH2COHC . 278626126 22 786223 22343 23343 343 EMP 6126 總反應式： 電子傳遞鏈 檸檬酸合成酶 丙酮酸羧化酶 丙酮酸脫氫酶 檸檬酸的積累機制總結(jié) n1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白質(zhì)合成，導致細 胞內(nèi)NH4濃度升高和有一條呼吸活力強的不 產(chǎn)生ATP的側(cè)系呼

35、吸鏈，這兩方面的原因分別 解除了對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促進 了EMP途徑的暢通； n2)由于丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控 制，就源源不斷地提供草酰乙酸（CO2固定）。 丙酮酸氧化脫酸生成乙酰-CoA和CO2固定兩個 反應的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增 強了合成檸檬酸能力。 檸檬酸的積累機制總結(jié) n3)順烏頭酸水合酶在催化時建立以下平衡：檸 檬酸 順烏頭酸 異檸檬酸90 3 7； n4)控制Fe2+含量，順烏頭酸酶活力低，使檸檬 酸積累； n5)一旦檸檬酸濃度升高到某一水平就抑制異檸 檬酸脫氫酶活力，從而進一步促進了檸檬酸自 身積累； n6)檸檬酸積累使pH值降低，在低pH

36、值下，順 烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，就更有利于 檸檬酸的積累并排出體外。 檸檬酸積累的理想條件：檸檬酸積累的理想條件： 1 1、提高磷酸果糖激酶的活性、提高磷酸果糖激酶的活性 2 2、提高丙酮酸羧化酶的活性、提高丙酮酸羧化酶的活性 3 3、提高檸檬酸合成酶的活性、提高檸檬酸合成酶的活性 4 4、抑制順烏頭酸酶的活性、抑制順烏頭酸酶的活性 5 5、抑制異檸檬酸脫氫酶的活性、抑制異檸檬酸脫氫酶的活性 6 6、抑制、抑制 - -酮戊二酸脫氫酶的活性酮戊二酸脫氫酶的活性 7 7、抑制異檸檬酸裂解酶的活性、抑制異檸檬酸裂解酶的活性 檸檬酸發(fā)酵需要下述檸檬酸發(fā)酵需要下述環(huán)境條件環(huán)境條件 n(1)磷酸鹽

37、濃度低； n(2)氮源用NH4+鹽； n(3)pH值低（3.0）； n(4)溶氧量高； n(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量極低。 檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率 n1.無CO2固定反應的產(chǎn)率 192/(1801.5)=71.1% n2.通過CO2固定反應提供C4二羧酸（無碳原子 損失） 192/180=106.6% C6H12O6C6H8O7(C沒有增加) 可見，CO2固定反應與檸檬酸發(fā)酵的重要性 C6H8O7H2O理論轉(zhuǎn)化率：116.7% 檸檬酸發(fā)酵實驗檸檬酸發(fā)酵實驗 檸檬酸發(fā)酵檸檬酸發(fā)酵 一、一、菌種菌種：產(chǎn)生檸檬酸的菌種很多，以：產(chǎn)生檸檬酸的菌種很多，以霉菌霉菌為為 主，又以主，又以黑曲霉黑曲霉

38、產(chǎn)生檸檬酸的能力較強，并能產(chǎn)生檸檬酸的能力較強，并能 利用多種碳源，故常是生產(chǎn)上使用的菌種。利用多種碳源，故常是生產(chǎn)上使用的菌種。 二、發(fā)酵二、發(fā)酵機理機理：細胞內(nèi)有三羧酸循環(huán)和乙醛酸：細胞內(nèi)有三羧酸循環(huán)和乙醛酸 循環(huán)；檸檬酸合成酶活力較高，而烏頭酸酶或循環(huán)；檸檬酸合成酶活力較高，而烏頭酸酶或 異檸檬酸脫氫酶可被某些因素，如金屬離子的異檸檬酸脫氫酶可被某些因素，如金屬離子的 缺乏，受到抑制，這有利于檸檬酸的積累。缺乏，受到抑制，這有利于檸檬酸的積累。 檸檬酸發(fā)酵檸檬酸發(fā)酵 三、三、工藝流程工藝流程： 發(fā)酵液的發(fā)酵液的pHpH值值對檸檬酸生成影響很大；對檸檬酸生成影響很大； pH23pH23時，

39、發(fā)酵產(chǎn)物主要是檸檬酸；時，發(fā)酵產(chǎn)物主要是檸檬酸； pHpH值中值中 性或堿性時，會產(chǎn)生較多草酸和葡萄糖酸；性或堿性時，會產(chǎn)生較多草酸和葡萄糖酸； 可往培養(yǎng)基中加入可往培養(yǎng)基中加入亞鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀或采取或采取育種育種 手段手段改造菌種改造菌種，使，使烏頭酸酶烏頭酸酶或或異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶 缺失或盡量降低活性，以缺失或盡量降低活性，以阻礙阻礙TCATCA循環(huán)循環(huán)的正常的正常 進行，從而增加檸檬酸的積累。進行，從而增加檸檬酸的積累。 四、檸檬酸發(fā)酵用原料 n檸檬酸發(fā)酵的原料有三大類 1.糖質(zhì)原料(甘蔗廢糖蜜、甜菜廢糖蜜)、 2.淀粉質(zhì)原料(主要是番薯、馬鈴薯、木 薯等) 3.正烷烴類原

40、料。 營養(yǎng)物濃度對發(fā)酵的影響 n對生成量和組成都有影響 n黑曲霉檸檬酸發(fā)酵 n蔗糖濃度15%18%，蔗糖同化率97% n蔗糖濃度20%，只同化92% n蔗糖濃度低于10%，產(chǎn)檸檬酸少，積累 草酸 n蔗糖濃度低于2.5%，不產(chǎn)檸檬酸 五、檸檬酸發(fā)酵工藝 1)試管斜面菌種培養(yǎng) n察氏瓊脂培養(yǎng)基：NaNO33g，蔗糖 20 g， K2HPO41 g，KCl0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，F(xiàn)eSO40.01g， 瓊脂20g，用水定溶至1000ml，pH自然。 察氏-多氏瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖30g， NaNO32 g， MgSO4.7H2O0.5 g，KH2PO41g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4.7

41、H2O0.01g，溴 甲分綠0.4g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH自然。 1)試管斜面菌種培養(yǎng) 蔗糖合成瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖140g，NH4NO32g， KH2PO42 g， MgSO4.7H2O0.25 g，F(xiàn)eCl3.6H2O0.02g，MnSO4.4H2O0.02g，麥芽汁 20ml，瓊脂20g，用水定溶至1000ml。 米曲汁瓊脂培養(yǎng)基：一份米曲加四倍質(zhì)量的水， 于55保溫糖化34小時后煮沸，濾液用水調(diào)整濃度 至10Bx，并用堿液將pH調(diào)制到6.0，接著添加瓊脂 2%。確認所制成的斜面無雜菌污染后，接入黑曲霉 孢子懸液0.1ml，于32培養(yǎng)45d。 2)種子擴大培養(yǎng) 二級擴大培養(yǎng)

42、na培養(yǎng)基 有瓊脂固體培養(yǎng)和液體表面培養(yǎng)兩種方 法，前者的培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基相同， 后者的組成如下：麥芽汁7BX，氯化銨2%， 尿素0.1%， 2)種子擴大培養(yǎng) 二級擴大培養(yǎng) nb培養(yǎng) 固體培養(yǎng)時，500ml茄子瓶裝80ml瓊脂培養(yǎng)基， 250ml茄子瓶裝50ml瓊脂培養(yǎng)基。滅菌后擺成 斜面，凝固后的斜面至37下培養(yǎng)24h。確認 無雜菌污染即可使用。 液體培養(yǎng)時，將液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中， 使液層深度達45cm，于0.1MPa下濕熱滅菌 15min。按無菌操作接種。培養(yǎng)溫度32。液 體表面需710d，瓊脂固體培養(yǎng)需67d。 三級擴大培養(yǎng) n可采用麩曲固體培養(yǎng)、液體表面培養(yǎng)或瓊脂 固體培養(yǎng)。

43、 所用培養(yǎng)基如下： na麩曲培養(yǎng)基： 新鮮小麥麩皮1kg，加水1.11.3L。液體培 養(yǎng)基與第二級擴大培養(yǎng)基所用液體培養(yǎng)基相 同。 nb瓊脂固體培養(yǎng)基： 與斜面培養(yǎng)基相同。 n現(xiàn)代工業(yè)化大生產(chǎn)主要采用深層通風發(fā)酵 法。 n日本約15的檸檬酸產(chǎn)品是利用固態(tài)發(fā)酵 法生產(chǎn)的， n淺盤發(fā)酵法在前蘇聯(lián)、印度、捷克波蘭、 保加利亞、阿根廷等國家主要使用， n我國、美國及西歐共同體國家則主要采用 液體深層發(fā)酵法進行生產(chǎn) 3） 發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn) 工藝流程工藝流程 n以薯干粉為原料的液體深層發(fā)酵工藝流程以薯干粉為原料的液體深層發(fā)酵工藝流程： 斜面菌種斜面菌種麩曲瓶麩曲瓶種子種子 薯干粉薯干粉調(diào)漿調(diào)漿滅菌滅菌(間

44、歇或連續(xù)式間歇或連續(xù)式)冷卻冷卻發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵液發(fā)酵液提取提取 成品成品 無菌空氣無菌空氣 n薯渣為原料的固體發(fā)酵工藝流程薯渣為原料的固體發(fā)酵工藝流程： 試管斜面試管斜面三角瓶菌種三角瓶菌種種曲種曲 薯渣薯渣粉碎粉碎蒸煮蒸煮攤涼接種攤涼接種裝盤裝盤發(fā)酵發(fā)酵出曲出曲提取提取成品成品 米糠米糠 3） 發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn) 工藝流程工藝流程 檸檬酸的深層液體發(fā)酵工藝 薯干原料檸檬酸深層發(fā)酵工藝 米曲汁斜面米曲汁斜面 茄子瓶茄子瓶 種子罐菌絲培養(yǎng)（也可以孢子接種）種子罐菌絲培養(yǎng)（也可以孢子接種） 發(fā)酵培養(yǎng)（發(fā)酵培養(yǎng)（3232，5 55.55.5天）天） 成熟的發(fā)酵液成熟的發(fā)酵液 （或（或10102020 麥

45、芽汁麥芽汁 0.1%KH0.1%KH2 2POPO4 4） 1616的薯干粉，的薯干粉， -淀粉酶液化淀粉酶液化 液體發(fā)酵 a不置換法 n培養(yǎng)液一次加入，發(fā)酵結(jié)束后棄去菌蓋， 發(fā)酵液用來提取檸檬酸。 n具體操作：接種后，培養(yǎng)溫度維持在35， 這是黑曲霉的適宜生長溫度，需維持72h左右， 以促進孢子發(fā)芽及菌體發(fā)育。當溫度逐漸下 降時，必須通人約50的空氣以維持35的 培養(yǎng)溫度，通風量為35m3/m2.h。接種后20h 左右可出現(xiàn)灰白色、很薄的菌膜，72h時菌膜 已完全形成，菌膜相當厚且有皺褶。 n48h起由于菌體耗氧增加，可開動另一組風管 向盤層之間通汽，進汽溫度為40左右，風 量為7m3/m2

46、.h，進汽濕度為75%以上，以防培 養(yǎng)液水分蒸發(fā)過快。 n接種后72h起進入產(chǎn)酸期，這時菌體代謝速 率高，耗糖快，發(fā)酵液酸度急劇升高，并釋 放出大量熱，最高時可達1000kJ/(m2.h)，此 時應加強通風措施，嚴格將發(fā)酵溫度控制在 2628，以利檸檬酸的形成。 n因此，一般在進入產(chǎn)酸期前8h左右需增大風 量至1518m3/m2.h，且降低進汽溫度在25 以下，濕度仍在75%以上。160h以后發(fā)酵結(jié) 束。 b置換法 n置換法一般是采用糖濃度低而營養(yǎng)較豐富 的培養(yǎng)液先培養(yǎng)菌蓋，待菌蓋形成之后再 更換發(fā)酵培養(yǎng)基。可更換1次也可數(shù)次， 發(fā)酵液用來提取檸檬酸。 n培養(yǎng)菌蓋，一般使用5%的糖液，視糖蜜質(zhì)

47、量 再補充少量NH4NO3、K2HPO4等鹽類。接種孢 子后，室溫保持在3436，培養(yǎng)液品溫為 3234，使孢子發(fā)芽，正常情況下40h即可形 成緊密有皺的菌蓋。菌蓋形成后，放掉培養(yǎng)基， 更換發(fā)酵培養(yǎng)基(即第1次置換)，并將室溫降 至3032，待發(fā)酵4860h后再放掉發(fā)酵液， 加入新培養(yǎng)液即進行第2次置換。如此重復， 一般可置換培養(yǎng)基810次，總發(fā)酵周期為 1420d， n收集起來的發(fā)酵液，用來提取檸檬酸。 n置換法的優(yōu)點是節(jié)省了大量培菌時間，發(fā) 酵速度快，而且原本不適宜長菌的原料都 可用作發(fā)酵培養(yǎng)基。 n但為了保持菌蓋的高活性，不能將發(fā)酵液 殘?zhí)强刂频煤艿?，這樣一來就造成替換出 來的發(fā)酵液其殘

48、糖量較高，給后道提取檸 檬酸帶來困難。 c不置換法影響表面發(fā)酵的因素 na)培養(yǎng)液層厚度 培養(yǎng)基液層厚度大，發(fā)酵產(chǎn)物總的生成量就 大。如果原料質(zhì)量好，預處理方法得當，曲 霉菌絲體活力強，那末可適當增加液層厚度; 相反，就應減少液層厚度。 c不置換法影響表面發(fā)酵的因素 nb)糖濃度 用于表面發(fā)酵的糖蜜濃度，質(zhì)優(yōu)的糖蜜濃度 (以蔗糖濃度計)為18%22%較適宜，而質(zhì)劣 的糖蜜一般采用14%。 n在表面發(fā)酵中，大約80%的糖被用于合成檸 檬酸，菌體生長增殖耗糖8%左右，菌體進行 呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%2%的糖 用于合成副產(chǎn)物。 nc)溫度 n黑曲霉生長最適溫度33-37，積累檸檬酸 的最

49、適溫度在32 n黑曲霉適宜產(chǎn)酸溫度是2628。溫度高， 容易形成雜酸等副產(chǎn)物且菌體易衰老；溫度 低，發(fā)酵周期被延長。 nd)pH值 黑曲霉長菌的最適pH為中性，而產(chǎn)酸的最適 pH在2.52.0。因此，應該注意的是：菌蓋形 成之后，只是在菌蓋下面有一個低pH區(qū)域， 菌體合成檸檬酸的活動都是在這低pH區(qū)域內(nèi) 進行的，所以不應該攪動發(fā)酵液，避免低值 區(qū)域的pH值上升而長菌不產(chǎn)酸。 n黑曲霉發(fā)酵檸檬酸， pH3.0以下積累檸檬酸， pH3.0以上積累草酸， pH5.0容易積累葡萄糖酸 n與不同碳源有關(guān)，黑曲霉在合成培養(yǎng)基 上產(chǎn)檸檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯 干粉4.5 ne)通風 表面發(fā)酵是氣

50、相傳氧，因此傳氧效率較高， 所以只要保持發(fā)酵室內(nèi)有適當空氣流通就可 以滿足霉菌對氧的需要。較高度的CO2會影 響菌體的生長和降低產(chǎn)酸能力。一般將CO2 控制在3%以下。 固體發(fā)酵 a淺盤發(fā)酵 n將曲置于曲室內(nèi)培養(yǎng)，室溫可按需要調(diào)節(jié)。 在孢子發(fā)芽和菌絲生長期，由于產(chǎn)生的熱量 少，品溫會逐漸下降，在入室后自18h內(nèi)，應 維持品溫在2731。培養(yǎng)1848h期間，由于 發(fā)酵熱的大量釋放，品溫上升很快，應采取 措施，不得讓品溫超過43 n菌體活力下降，所以品溫會下降，此時應維 持在35左右，直至發(fā)酵結(jié)束。 固體發(fā)酵 a淺盤發(fā)酵 n為了克服上、下曲盤的溫差，在發(fā)酵40h左右 時應將曲盤上下對調(diào)。整個發(fā)酵期

51、間不必翻 曲。曲室相對濕度在85%90%。 n發(fā)酵終點根據(jù)酸度來判定，從48h開始測量酸 度，以后每隔12h測定1次，自72h以后則每隔 4h測定1次，在酸度達到最高時即出料，否則 時間延長，檸檬酸反而被菌體消化。 b 厚層通風發(fā)酵厚層通風發(fā)酵 n與淺盤發(fā)酵明顯不同的是，在物料鋪攤厚度 上，厚層發(fā)酵的曲醅厚度在50cm左右，比淺 盤發(fā)酵的1520cm要大出許多。 n為了給曲霉菌提供氧，在培養(yǎng)過程中需要進 行機械通風。 b 厚層通風發(fā)酵厚層通風發(fā)酵 n培養(yǎng)過程中的溫度控制與淺盤發(fā)酵的溫度管 理相似，但最高品溫不能超過40。溫度和 濕度主要靠通風來調(diào)節(jié)，因為物料厚度大， 所以培養(yǎng)過程中需要翻料。 n厚層發(fā)酵比淺盤發(fā)酵優(yōu)越之處在于：占地面 積少，污染雜菌可能性小，機械化程度高。 六、固定化黑曲霉發(fā)酵玉米生產(chǎn) 檸檬酸 n用固定化黑曲霉細胞發(fā)酵玉米生產(chǎn)檸檬 酸的最適溫度是35,玉米糖液濃度 10Bx。在最適條件下檸檬酸產(chǎn)量可達 到96g/L,一般穩(wěn)定在89g/L。 六、固定化黑曲霉發(fā)酵玉米生產(chǎn) 檸檬酸 n固定化黑曲霉可連續(xù)使用24d(約8批次)。黑曲霉細胞固 定化后,產(chǎn)酸活力與降糖能力均與游離細胞水平相近。 但在連續(xù)分批發(fā)酵中,固定化黑曲霉細胞顯示出明顯的 優(yōu)勢,即:游離細胞