cDNA第一鏈合成試劑盒

1、cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法1、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(1) 在無(wú)菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA0.5-1.0 (dN)9 or oligo(dT) 18100pmol(2) 混勻后，70C變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻，然后依次加入以下成份：5X M-MLV Buffer4JdNTPs( 10mM each1dRNasi n10U100mM DTT2JM-MLV Reverse Tran scriptase100UDEPC-treated waterup to 20 d(3) 混勻后短暫離心，使用 oligo(dT)偲引物時(shí)在42C，使用隨機(jī)引物(dN)9 時(shí)在37C下溫育1小時(shí)

2、。(4) 94 C 5min終止反應(yīng)后，冰上冷卻。(5) 合成的cDNA第一鏈可直接用于PCR擴(kuò)增或進(jìn)行其它下游操作。2、PCRT 增(1)在PCR薄壁管中加入以下試劑Sy nthesized cDNA10X PCR BufferUpper primerLower primerdNTPs (10mM eachTaq DNA PolymeraseddHO(2)混勻后短暫離心，然后進(jìn)行94C預(yù)變性2.5min。進(jìn)入下列2-5 d2d10pmol10pmol0.5 d1.5Uup to 20 dPCR擴(kuò)增。3040個(gè)循環(huán)(此擴(kuò)增條件僅供參考)：94 C30s, 60 C 45s , 72 C 1mi

3、n 3min。最后 72 C 延伸 7min。注意事項(xiàng)1、確保RNA完整性及純度。RNA質(zhì)量是決定合成cDNA第一鏈成功的關(guān)鍵因素， 其純度及完整性可由OD60/OD28。比值和進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。較純的 RNA 樣品OD60/OC280比值通常為1.8-2.0，若該比值偏低，應(yīng)進(jìn)一步純化。真核生物RNA羊品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1，否則，表明有RNAt解。2、 避免RNA酶污染。進(jìn)行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須完全無(wú)菌。操 作過(guò)程始終戴手套以杜絕各種 RNA酶的污染。3、合成cDNA第一鏈的引物選擇。選擇 oligo(dT) 12-18作為反轉(zhuǎn)錄弓I物，可保證cD

4、NA具有完整的3-端，通?？傻玫浇咏L(zhǎng)的 cDNA第一鏈；若選擇隨機(jī) 寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物，弓I物在整個(gè)mRNA勺多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短 的部分長(zhǎng)度的cDNA第一鏈。這種方法經(jīng)常用于獲得5末端序列及從帶有二 級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA常見(jiàn)問(wèn)題及參考意見(jiàn)1、cDNA產(chǎn)量很低，為什么？可能的原因：(1)RNA模板質(zhì)量低；(2)對(duì)mRN濃度估計(jì)過(guò)高；(3)反應(yīng)體系中存 在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足；(4)反應(yīng)體積過(guò)大，一般不應(yīng)超過(guò) 50 d。2、合成不了長(zhǎng)鏈的cDNA為什么？(1) RNA降解。對(duì)使用的器具、試劑用DEPC干熱或濕熱滅菌處理，以杜絕RNase 污染。同時(shí)，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入 RNase抑制劑。(2) 反應(yīng)條件不合適。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最合適的反應(yīng)條件，包括酶量、鹽濃度、反應(yīng)溫度(3756C)、DTT濃度(0.510mM。(3) RNA 結(jié)構(gòu)問(wèn)題。提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，或