氨基酸藥物的發(fā)酵生產(chǎn)

1、第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥物的基本概念氨基酸類藥物的基本概念 一、氨基酸類藥物的基本知識一、氨基酸類藥物的基本知識 從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有180多種多種，但是但是 參與蛋白質(zhì)組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有二參與蛋白質(zhì)組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有二 十種。十種。1986年年發(fā)現(xiàn)第21種 硒代胱氨酸硒代胱氨酸 最近發(fā)現(xiàn)第22種 遺傳基因編碼的氨基酸 吡咯賴氨酸。吡咯賴氨酸。 180多種天然氨基酸大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的， 這些氨基酸被稱為非蛋白質(zhì)氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸。 氨基酸是構(gòu)成機(jī)體蛋白質(zhì)的基本單位基本單位，且構(gòu)成生 物體蛋白質(zhì)的氨基酸都是-氨基酸

2、氨基酸，除甘氨酸甘氨酸外，- 碳原子碳原子均為不對稱碳原子不對稱碳原子，具有立體異構(gòu)現(xiàn)象立體異構(gòu)現(xiàn)象，均是 L-型氨基酸型氨基酸。 1、分類：、分類： （1）根據(jù)氨基酸在溶液中帶電狀況分為酸性、中性酸性、中性 及堿性及堿性氨基酸三類。 （2）依R基團(tuán)基團(tuán)差異亦分為： 脂肪族脂肪族氨基酸、芳香族芳香族氨基酸及雜環(huán)雜環(huán)氨基酸三類三類 其中L-組氨酸、組氨酸、L-色氨酸、色氨酸、L-脯氨酸及脯氨酸及L-羥脯氨羥脯氨 酸酸為雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸， L-酪氨酸及酪氨酸及L-苯丙氨酸苯丙氨酸為芳香族氨基酸芳香族氨基酸， 其余均為脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸。 2、性質(zhì)：、性質(zhì)： （1）物理通性：）物理通性：

3、天然氨基酸純品均為白色結(jié)晶性粉末白色結(jié)晶性粉末，熔點及分熔點及分 解點解點均在200以上以上。 在有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑中溶解度一般較小。 均為兩性電解質(zhì)均為兩性電解質(zhì)，各有一定等電點等電點。除甘氨酸外 都有旋光性旋光性。 氨基酸氨基酸能使水的介電常數(shù)增高,而一般的有機(jī)化合 物乙醇、丙酮等卻使水的介電常數(shù)降低介電常數(shù)降低。是以離子晶離子晶 格格組成，而一般的有機(jī)化合物是由分子晶格分子晶格組成的。 （2）化學(xué)通性：）化學(xué)通性： -氨基酸氨基酸共同的化學(xué)反應(yīng)有兩性解離兩性解離及林海定反應(yīng)林海定反應(yīng) (ninhyding reactiong) 、?；?、烷基化、酯化、酰氯、?；⑼榛?、酯化、酰氯 化、酰胺

4、化、疊氮化、脫羧及脫氨反應(yīng)、肽鍵結(jié)合反化、酰胺化、疊氮化、脫羧及脫氨反應(yīng)、肽鍵結(jié)合反 應(yīng)及與甲醛和亞硝酸的反應(yīng)應(yīng)及與甲醛和亞硝酸的反應(yīng)等。 特殊基團(tuán)反應(yīng)特殊基團(tuán)反應(yīng)： 酪氨酸的酚羥基酪氨酸的酚羥基可產(chǎn)生米倫反應(yīng)米倫反應(yīng)與福林達(dá)尼斯福林達(dá)尼斯反 應(yīng)； 精氨酸的胍基精氨酸的胍基產(chǎn)生坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)； 色氨酸色氨酸的吲哚基吲哚基與芳醛芳醛產(chǎn)生紅色反應(yīng)紅色反應(yīng)； 組氨酸的咪唑基組氨酸的咪唑基產(chǎn)生Pauly反應(yīng)反應(yīng)； 苯丙氨酸硝化后于堿性條件下苯丙氨酸硝化后于堿性條件下產(chǎn)生桔黃色反應(yīng)桔黃色反應(yīng)； 胱氨酸及半胱氨酸胱氨酸及半胱氨酸經(jīng)酸或堿破壞后可與醋酸鉛醋酸鉛產(chǎn) 生鉛黑反應(yīng)鉛黑反應(yīng)； 半胱氨酸半胱氨酸在堿

5、性條件下與亞硝基鐵氰化鈉（硝普亞硝基鐵氰化鈉（硝普 鹽）鹽）反應(yīng)生成紫紅色化合物紫紅色化合物。 色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸均有特征紫外吸收光紫外吸收光 譜譜，色氨酸色氨酸最大吸收波長為279nrn，苯丙氨酸苯丙氨酸為 259nm，酪氨酸酪氨酸為278nm。但構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種 氨基酸在可見光區(qū)均無吸收可見光區(qū)均無吸收。 氨基酸的上述理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)與氨基酸合成、轉(zhuǎn)合成、轉(zhuǎn) 化化、分離純化分離純化及定性定量檢測的依據(jù)定性定量檢測的依據(jù) 二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用 1、氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成單位基本組成單位，故生物體 中眾多

6、蛋白質(zhì)的生物功能生物功能，無不與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基 酸種類、數(shù)量、排列順序種類、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構(gòu)象有密空間構(gòu)象有密 切的關(guān)系切的關(guān)系。因此氨基酸對維持機(jī)體蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡維持機(jī)體蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡 有極其重要的意義。生命活動中人及動物通過消化道 吸收氨基酸 。 通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化體內(nèi)轉(zhuǎn)化而維持其動態(tài)平衡動態(tài)平衡，若其動態(tài)平衡失 調(diào)，則機(jī)體代謝紊亂代謝紊亂，甚至引起病變病變。 2、許多氨基酸尚有其特定的藥理效應(yīng)、許多氨基酸尚有其特定的藥理效應(yīng)。 （）氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)系（）氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)系 氨基酸為構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的基本單位，故蛋白質(zhì)營蛋白質(zhì)營 養(yǎng)價值養(yǎng)價

7、值實際是氨甚酸作用氨甚酸作用的反映。健康人靠膳食膳食中的 蛋白質(zhì)獲取各種氨基酸滿足機(jī)體需求。缺乏蛋白質(zhì)則 影響機(jī)體生長及正常生理功能，抗病力減弱抗病力減弱引起病變病變。 消化道功能嚴(yán)重障礙者消化道功能嚴(yán)重障礙者及手術(shù)后病人手術(shù)后病人常因禁食無法 獲得足夠蛋白質(zhì)，自身蛋白質(zhì)過量消耗，致使?fàn)I養(yǎng)不營養(yǎng)不 良而導(dǎo)致病情惡化或預(yù)后不良良而導(dǎo)致病情惡化或預(yù)后不良。 臨床上常通過直接輸入氨基酸制劑氨基酸制劑改善患者營養(yǎng) 狀況，增加治療機(jī)會，促進(jìn)康復(fù)。 賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等8種氨基酸種氨基酸

8、必需氨基酸：必需氨基酸：人及哺乳動物自身不能合成，需由 食物供應(yīng)。 半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分 別由其他氨基酸（氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)產(chǎn)生產(chǎn)生，若食物中 提供了足夠的該氨基酸（氨基酸（氨酸及酪氨酸），可減少對 其他氨基酸（氨基酸（蛋氨酸及苯丙氨酸）的需求量。 氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速度較低氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速度較低，通常 難以滿足需求，需由外界補(bǔ)充一部分。 （二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物（二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物 （三）治療肝病的氨基酸及其衍生物（三）治療肝病的氨基酸及其衍生物 （四）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)

9、疾病的氨基酸及其衍生物（四）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物 （五）用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物（五）用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物 （六）其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用（六）其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用 第二節(jié)第二節(jié) 氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法 1、 目前全世界天然氨基酸全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬噸百萬噸左 右，其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其 次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用用 于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。 2、 目前構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種氨基酸的生產(chǎn)方法

10、有天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成 法等四種。法等四種。 3、 氨基酸及其衍生物類藥物衍生物類藥物已有百種百種之多，但主 要是以以20種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；?、取代及成鹽種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；?、取代及成鹽 等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。 一、水解法一、水解法 （一）基本原理與過程（一）基本原理與過程 以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、酸、 堿或酶水解堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各 種藥用氨基酸的方法稱為水解法水解法。 目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-胱氨酸、胱氨酸、L-精氨精氨 酸、酸、

11、L-亮氨酸、亮氨酸、L-異亮氨酸、異亮氨酸、L-組氨酸、組氨酸、L-脯氨酸脯氨酸 及及L-絲氨酸絲氨酸等。 水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過程為水解、分離和結(jié)水解、分離和結(jié) 晶精制晶精制三個步驟。 1、蛋白質(zhì)水解方法、蛋白質(zhì)水解方法 目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水酸水解法、堿水解法及酶水 解法三種。解法三種。 （1）酸水解法）酸水解法 蛋白質(zhì)原料用610molL鹽酸鹽酸或 8molL硫酸硫酸于110120（回流煮沸）水解12 24h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點是水 解迅速迅速而徹底徹底，產(chǎn)物全部為L-型氨基酸型氨基酸，無消旋作消旋作 用用。缺點是色氨酸色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪

12、氨酸絲氨酸及酪氨酸部 分被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。 （2）堿水解法）堿水解法 蛋白質(zhì)原料經(jīng)6molL氫氧化鈉或氫氧化鈉或 4molL氫氧化鋇氫氧化鋇于100水解6h即得多種氨基酸混 合物。該法水解迅速而徹底，且色氨酸不被破壞，但 含羥基或巰基羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產(chǎn)生消旋作且產(chǎn)生消旋作 用用。工業(yè)上多不采用。 （3）酶水解法）酶水解法 蛋白質(zhì)原料在一定pH和溫度條件下經(jīng) 蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽氨基酸和小肽的過程稱為酶水 解法。 此法優(yōu)點為反應(yīng)條件溫和，無需特殊設(shè)備，氨基 酸不破壞，無消旋作用無消旋作用。缺點是水解不徹底水解不徹底，產(chǎn)物中 除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)

13、上很少用該法生產(chǎn) 氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨水解蛋白及蛋白胨。 2、氨基酸分離方法、氨基酸分離方法 氨基酸分離方法較多，通常有溶解度法溶解度法、等電點等電點 沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。 （1）溶解度法）溶解度法 是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑 中的溶解度差異溶解度差異而進(jìn)行分離的方法。 胱氨酸和酪氨酸胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸熱水中酪氨酸 溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合 物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。 （2）特殊試劑沉淀法）特殊試劑沉淀法 系采用某些有機(jī)或無機(jī)

14、試劑有機(jī)或無機(jī)試劑與 相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物不溶性衍生物的分離方法。 如鄰二甲苯鄰二甲苯-4-磺酸能與亮氨酸磺酸能與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀不溶性鹽沉淀， 后者與氨水反應(yīng)氨水反應(yīng)又可獲得游離亮氨酸游離亮氨酸； 組氨酸可與組氨酸可與HgC12形成不溶性汞鹽沉淀汞鹽沉淀，后者經(jīng) 處理后又可獲得游離組氨酸組氨酸； 精氨酸可與苯甲醛精氨酸可與苯甲醛生成水不溶性苯亞甲基精氨酸苯亞甲基精氨酸 沉淀，后者用鹽酸鹽酸除去苯甲醛苯甲醛即可得精氨酸。 （3）吸附法）吸附法 是利用吸附劑對不同氨基酸吸附力的差 異進(jìn)行分離的方法。如顆粒活性炭顆粒活性炭對苯丙氨酸、酪苯丙氨酸、酪 氨酸氨酸及色氨酸色氨酸的吸附力大于對

15、其它非芳香族非芳香族氨基酸的 吸附力，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸分離出 來。 （4）離子交換法）離子交換法 是利用離子交換劑對不同氨基酸吸 附能力的差異進(jìn)行分離的方法。氨基酸為兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)， 在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不 同，故同一種離子交換劑對不同氨基酸的吸附力不同。 3、氨基酸的精制方法、氨基酸的精制方法 分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質(zhì)，需進(jìn) 行精制，常用的有結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)，也可采用溶解溶解 度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)。 丙氨酸在稀乙醇或甲醇稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pI為為

16、，故 丙氨酸可在時，用50冷乙醇冷乙醇結(jié)晶或重結(jié)晶加以精制。 溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合的方法精制氨基酸。如在 沸水中苯丙氨酸苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含少 量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（wv）的熱 水中，調(diào)左右左右，經(jīng)脫色過濾可除去大部分酪氨酸；濾 液濃縮至原體積的13，加2倍體積（vv）的95 乙醇乙醇，4放置，濾取結(jié)晶， 用95%乙醇洗滌乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。 （二）用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝（二）用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝 絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法酸水解法生產(chǎn)，但目前由 于發(fā)酵方法及酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，僅有幾種氨基 酸仍采

17、用酸水解法生產(chǎn)?，F(xiàn)胱氨酸及亮氨酸生產(chǎn)為例。 1、L-胱氨酸（胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制備）的制備 （1）L-胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L-胱氨酸存在于所有蛋 白質(zhì)分子中，尤以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最多。 其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化脫氫氧化而成，結(jié)構(gòu)為： L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體六角形或六角柱形晶體，分分 解點解點258261，pI為，為，25D 為為-232。在25水 中溶解度為，在75水中為。溶于無機(jī)酸及無機(jī)堿， 在熱堿液中可被分解熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮乙醇、乙醚及丙酮?？?被還原為還原為L-半胱

18、氨酸半胱氨酸。 （2）工藝路線）工藝路線 （3）工藝過程）工藝過程 水解水解 110117水解7h（自100時計）后出料,玻 璃布過濾,收集濾液。 中和中和 直至，靜置36h，滌綸布濾取沉淀，離心甩干 得L-胱氨酸粗品。 粗制粗制 升溫至6570，攪拌半小時，加活性炭16kg， 于8090保溫半小時，濾除活性炭。調(diào)濾液至，靜 置結(jié)晶，吸出上清液后，底部沉淀經(jīng)離心甩干得胱氨 酸粗品（）。 精制精制 中和中和 升溫至70，加活性炭，85攪拌半 小時，過濾，加倍體積蒸餾水，升溫至7580，攪 拌下用12氨水氨水（化學(xué)純）中和至，析出結(jié)晶，濾 取胱氨酸結(jié)晶，蒸餾水洗至無氯離子，真空干燥得L- 胱氨酸成

19、品。 （4）檢驗）檢驗 應(yīng)為六角形或六角柱形白色結(jié)晶，含量在 以上，干燥失重小于，熾灼殘渣小于，氯化物 小于，鐵鹽小于，重金屬小于20ppm。 含量測定含量測定： （5）作用與用途）作用與用途 L-胱氨酸具有增強(qiáng)造血機(jī)能、升高 白細(xì)胞、促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)及抗輻射作用。臨床上 用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬 及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。 2、L-亮氨酸（亮氨酸（L-Leucine，L-leu）的制備）的制備 （1）L-亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L-亮氨酸存在于所有蛋 白質(zhì)中，以玉米麩質(zhì)及血粉玉米麩質(zhì)及血粉中含量最豐富，其次在角角 甲、棉籽餅和雞毛甲、棉籽餅和雞毛中含量也較

20、多。L-亮氨酸為人體必亮氨酸為人體必 需氨基酸之一需氨基酸之一，化學(xué)名稱為2-氨基-4-甲基戊酸或2-氨 基異己酸，分子式：C6H13NO2,分子量：131.17 ,結(jié)構(gòu) 式： L-Leu自水及乙醇水及乙醇中得白色片狀結(jié)晶片狀結(jié)晶，pI為為， 熔點為熔點為293，在25水水中溶解度為，乙醇中為0.017; 在75水水中為，在醋酸中為，不溶于乙醚。 （2）工藝路線：）工藝路線： （3）工藝過程：）工藝過程： 水解、趕酸水解、趕酸 取6molL HC1 500L于1噸水解罐中， 投入100kg動物血粉，110120回流水解回流水解24h后，于 7080減壓濃縮至糊狀。加50L水稀釋后，再濃縮 至糊

21、狀，如此趕酸趕酸三次，冷卻至室溫濾除殘渣。 吸附、脫色吸附、脫色 上述濾液稀釋1倍后，以每分鐘的流速 流進(jìn)顆?；钚蕴恐?0180cm）至流出液出現(xiàn)苯丙苯丙 氨酸氨酸為止，用去離子水以同樣流速洗至流出液為止， 穿柱液與洗滌液合并。 濃縮、沉淀與解析濃縮、沉淀與解析 上述流出液減壓濃縮減壓濃縮至進(jìn)柱液體 積的13，攪拌下加入110體積（vv）的鄰二甲鄰二甲 苯苯-4-磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀。濾取沉淀并用2 倍體積（wv）去離子水?dāng)嚢柘礈靸纱危闉V壓干得 亮氨酸磺酸鹽。濾餅加2倍體積（wv）去離子水?dāng)?勻，用用6mol/L 氨水中和至氨水中和至pH68，7080保溫攪

22、保溫攪 拌拌1h，冷卻過濾。沉淀用2倍體積（wv）去離子水 攪拌洗滌兩次，過濾得亮氨酸粗品。 精制精制 L-亮氨酸粗品用40倍體積（wv）去離子水 加熱溶解加熱溶解，加活性炭于70攪拌脫色1h，過濾，濾 液濃縮至原體積的14，冷卻后即析出白色片狀亮氨 酸結(jié)晶。過濾收集結(jié)晶，用少量水洗滌、抽干，70 80烘干得L-亮氨酸成品。 （4）檢驗）檢驗 應(yīng)為白色片狀結(jié)晶，含量101.5%，干 燥失重不超過，熾灼殘渣不超過，氯化物不超過 ，鐵鹽不超過0.003%，重金屬不超過，砷鹽不超 過。 含量測定含量測定 （5）作用與用途）作用與用途 L-亮氨酸為人體必需氨基酸之一， 是各種氨基酸輸液的原料之一。 二

23、、發(fā)酵法二、發(fā)酵法 （）基本原理與過程（）基本原理與過程 1、發(fā)酵的基本原理、發(fā)酵的基本原理 生物化學(xué)中稱酵母無氧呼吸無氧呼吸過程為發(fā)酵發(fā)酵，反應(yīng)過程 中電子供體與受體皆為有機(jī)物，有時電子受體為電子 供體的分解產(chǎn)物，氧化作用不完全，最終形成還原性 產(chǎn)物。 工業(yè)上，發(fā)酵發(fā)酵實質(zhì)上是利用微生物細(xì)胞中酶的作用， 將培養(yǎng)基中有機(jī)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞或其它有機(jī)物的過程。 初生氨基酸：初生氨基酸：微生物通過固氮作用固氮作用、硝酸還原硝酸還原及 自外界吸收氨使酮酸氨基化酮酸氨基化成相應(yīng)的氨基酸，或微生 物通過轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一 種酮酸酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。初生氨基酸。

24、次生氨基酸：次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸為初生氨基酸為 前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸。 大多數(shù)氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生微生 物轉(zhuǎn)化物轉(zhuǎn)化作用而產(chǎn)生。 2、發(fā)酵法的基本過程、發(fā)酵法的基本過程 發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的基本過程包括培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制與 滅菌處理滅菌處理，菌種誘變與選育菌種誘變與選育，菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)、滅菌滅菌及接種接種 發(fā)酵發(fā)酵，產(chǎn)品提取及分離純化等步驟。 現(xiàn)代生物工程采用細(xì)胞融合細(xì)胞融合技術(shù)及基因重組基因重組技術(shù) 改造微生物細(xì)胞，已獲得多種高產(chǎn)氨基酸高產(chǎn)氨基酸雜種菌株及 基因工程菌基因工程菌。 如用北京棒狀桿菌和鈍齒棒狀桿菌原生質(zhì)體融合原生質(zhì)

25、體融合 形成的雜種，其中70雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞產(chǎn)生兩親菌株所產(chǎn)生 的氨基酸氨基酸。 氨基酸發(fā)酵方式發(fā)酵方式主要是液體通風(fēng)深層培養(yǎng)法，其 過程是由菌種試管培養(yǎng)逐級放大直至數(shù)噸至數(shù)百噸發(fā) 酵罐。發(fā)酵結(jié)束，除去菌體，清液用于提取、分離純提取、分離純 化和精制化和精制有關(guān)氨基酸，其分離純化、精制方法及過程 與水解法相同。 （二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 構(gòu)成動物、植物及微生物體所有蛋白質(zhì)的氨基酸種 類與構(gòu)型均無任何差異均無任何差異，但植物體內(nèi)所有氨基酸皆由 CO2、氨和水合成、氨和水合成，動物體除8種必需氨基酸需從外 界攝取外，其余非必需氨基酸均可通過體內(nèi)氨基酸之

26、間的轉(zhuǎn)化或碳水化合物中間代謝物而合成，而微生物微生物 利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。 目前絕大部分氨基酸絕大部分氨基酸皆可通過發(fā)酵法生產(chǎn)，其缺點 是產(chǎn)物濃度低，設(shè)備投資大，工藝管理要求嚴(yán)格，生 產(chǎn)周期長，成本高。本文僅以L-異亮氨酸及L-賴氨酸 直接發(fā)酵法為例，說明發(fā)酵法的基本過程。 1、L-異亮氨酸（異亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制備）的制備 （1）L-異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：L-Ile存在子所有蛋 白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一必需氨基酸之一，分子式為C6H13NO2， 分子量為，結(jié)構(gòu)式為： L-Il

27、e在乙醇中形成菱形葉片狀或片狀晶體，分解 點為285286，L-Ile溶于熱醋酸溶于熱醋酸，在20乙醇中溶 解度為，在25水中為，在75水中為，不溶于乙醚溶于乙醚。 （2）工藝路線）工藝路線 （3）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成（種子培養(yǎng)基組成（%）為：）為： 葡萄糖 2 尿素 0.3 玉米漿 豆餅水解液（以干豆餅計） 。 二級種子培養(yǎng)基另加菜籽油，其余同一級種子培 養(yǎng)基。 一級種子培養(yǎng)：1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為 200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面菌種，搖床30培養(yǎng) （沖程7cm，頻率105次min）16h。 二級種子培養(yǎng)：接種量，培養(yǎng)8h，如此逐級 放大培養(yǎng)得足夠量

28、菌種。 滅菌、發(fā)酵滅菌、發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液組成（%）為: 硫酸銨 4.5 豆餅水解液 ，玉米漿 碳酸鈣 ，淀粉水解還原糖初糖濃 度 。 在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液，加熱至118 120，維持在1.1105Pa壓力，滅菌30min，立即通 冰鹽水冷卻至25。接入1菌種菌種（vv），維持180 轉(zhuǎn)min的攪拌速度，升溫至3031， 以（minL）通氣量發(fā)酵60h，在2450h之間不斷 補(bǔ)加尿素至，氨水至。 除菌體、酸化除菌體、酸化 發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100并維持10min，冷 卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至，過濾除沉淀。 離子交換、吸附分離離子交換、吸附分離 上述濾液每分鐘以樹脂量的流

29、速進(jìn)H十-型732離子 交換柱（40100cm），以100L去離子水洗柱，再 以60、L氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫，分部收 集洗脫液。 濃縮趕氨濃縮趕氨 合并pH312的洗脫液，7080減壓蒸餾、濃縮至 粘稠狀，加去離子水至原體積的14，再濃縮至粘稠 狀。如此重復(fù)三次。 脫色、濃縮、中和脫色、濃縮、中和 上述濃縮物加去離子水至原體積的14，攪拌均勻， 加2molL鹽酸調(diào)，加上1（wv）活性炭，70 攪拌脫色1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當(dāng)體積， 用2molL氨水調(diào)，5沉淀過夜,過濾抽千，105烘 干得：L-異亮氨酸半成品。 精制、烘干精制、烘干 每10kg L-異亮氨酸半成品加8L濃

30、鹽酸和20L去離子水， 加熱至80，攪拌溶解，加10kg氯化鈉至飽和，加工 業(yè)液堿調(diào)，過濾，濾液用堿調(diào)，5放置過夜。濾取 沉淀，用80L，去離子水加熱至80攪拌溶解，加適 量氯化鈉氯化鈉和1%（wv）活性炭，70攪拌脫色lh過 濾，濾液減壓濃縮至適當(dāng)濃度，用氨水調(diào)，5放置 結(jié)晶過夜。次日過濾收集結(jié)晶，抽干，于105烘房 中烘干得L-異亮氨酸成品。 （4）檢驗）檢驗 應(yīng)為菱形葉片狀或片狀晶體，含量應(yīng)為，干燥 失重不超過，熾灼殘渣不大于含量測定與L-亮氨酸 的規(guī)定相同。 0.3%，氯化物不超過，硫酸鹽不超過，鐵鹽不超 過,重金屬不超過，砷鹽不超過。 （5）作用與用途）作用與用途 L-Ile為必需氨

31、基酸，是復(fù)方氨基酸 輸液的重要成份之一。 2、L-賴氨酸（賴氨酸（L-Lysine，L-Lys）的制備）的制備 （1）L-賴氨酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) L-賴氨酸存在于所有蛋 白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一人體必需氨基酸之一。分子量為，結(jié)構(gòu)為： L-Lys自乙醇水溶液中得針狀結(jié)晶針狀結(jié)晶，其鹽酸鹽為單斜鹽酸鹽為單斜 晶系白色粉末晶系白色粉末，無臭、味苦，熔點熔點263264，易溶 于水，幾乎不溶于乙醇和乙醚。PI為為， （2）工藝路線）工藝路線 （3）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 菌種為北京棒狀桿菌北京棒狀桿菌（corymebacterium perkinense）。 斜面培養(yǎng)基成分（）為斜面培養(yǎng)

32、基成分（）為: 葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，。 種子培養(yǎng)基成分（種子培養(yǎng)基成分（%）為）為: 葡萄糖，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸銨，玉米漿，毛 發(fā)水解廢液，CaCO3。 1000ml三角瓶中種子培養(yǎng)基裝量200ml，接種一 環(huán)斜面培養(yǎng)菌種，30振搖（沖程，頻率108次 min），培養(yǎng)16h。 二級種子培養(yǎng)接種量，培養(yǎng)48h。如此逐級擴(kuò)大培養(yǎng)。 滅菌、發(fā)酵滅菌、發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液成分（）為發(fā)酵培養(yǎng)液成分（）為 淀粉水解糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硫酸銨，尿素， 玉米漿，毛發(fā)水解廢液，甘蔗糖蜜，滅菌前加甘油 聚醚lL（指5m3發(fā)酵罐）。在5m3發(fā)酵罐中投入培養(yǎng)液 3噸，在1.01105Pa壓力下，加熱至

33、118120滅菌 30min，立即通入冰鹽水冷卻至30，按10（vv） 比例接種，以（vv）通氣量于30發(fā)酵4251h，攪 拌速度為180轉(zhuǎn)min。 發(fā)酵液處理：離心除菌體；發(fā)酵液處理：離心除菌體；80 加熱；加熱； 離子交換：銨型離子交換：銨型732樹脂為飽和樹脂為飽和(串聯(lián)串聯(lián)) 濃縮結(jié)晶：收集洗脫液（氨水洗脫）濃縮結(jié)晶：收集洗脫液（氨水洗脫） 三、酶轉(zhuǎn)化法三、酶轉(zhuǎn)化法 （一）基本原理及過程（一）基本原理及過程 酶轉(zhuǎn)化法酶轉(zhuǎn)化法亦稱為酶工程技術(shù)酶工程技術(shù)，實際上是在特定酶特定酶 的作用下使某些化合物轉(zhuǎn)化某些化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸相應(yīng)氨基酸的技術(shù)。 酶工程法酶工程法與直接發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸之反

34、應(yīng)本質(zhì)相本質(zhì)相 同同，皆屬酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，但前者為單酶或多酶的高密度單酶或多酶的高密度 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化，而后者為多酶低密度多酶低密度轉(zhuǎn)化。 酶工程技術(shù)酶工程技術(shù)工藝簡單，產(chǎn)物濃度高產(chǎn)物濃度高，轉(zhuǎn)化率及生轉(zhuǎn)化率及生 產(chǎn)效率產(chǎn)效率較高，副產(chǎn)物少。 固定化酶或細(xì)胞固定化酶或細(xì)胞可進(jìn)行連續(xù)操作，節(jié)省能源和勞 務(wù)，并可長期反復(fù)使用。 （二）酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 目前醫(yī)藥工業(yè)中，用酶工程法生產(chǎn)的氨基酸已有十十 多種多種。 DL-蛋氨酸、DL-纈氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-色氨 酸、DL-丙氨酸及DL-蘇氨酸等分別經(jīng)氨基?；覆鸢被；覆?分分獲得了相應(yīng)的L-氨基酸，并

35、已投入了工業(yè)化生產(chǎn)。 1、L-天冬氨酸及天冬氨酸及L-丙氨酸的制備丙氨酸的制備 （1）L-天冬氨酸及天冬氨酸及L-丙氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)丙氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L天冬氨酸（天冬氨酸（L-Aspartic acid，Asp）的結(jié)構(gòu)與）的結(jié)構(gòu)與 性質(zhì)性質(zhì) L-Asp存在于所有蛋白質(zhì)分子中，含兩個羧基兩個羧基和 一個氨基，為酸性酸性氨基酸，分子式為C4H7NO4，分子 量為，結(jié)構(gòu)式為： L-Asp的化學(xué)名稱為-氨基丁二酸或氨基琥珀酸， 純品為白色菱形葉片狀結(jié)晶菱形葉片狀結(jié)晶，等電點為等電點為，熔點為 269271。溶于水及鹽酸溶于水及鹽酸，不溶于乙醇及乙醚不溶于乙醇及乙醚， 在25水中溶解度為，在水中溶解度

36、為，在75水中為水中為，在乙醇中為。 在堿性溶液中為左旋性左旋性，在酸性溶液中為右旋性右旋性。 25D 為 +5.05（C，在水中）， 25D 為 +25.4（C，在5molL HCl中）。 L-丙氨酸（丙氨酸（L-Alanine，簡稱，簡稱L-Ala）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L-Ala存在于所有蛋白質(zhì)分子中,為中性氨基酸中性氨基酸。分子 式為C3H7NO2，分子量為，結(jié)構(gòu)式為： L-Ala自水和乙醇中形成菱形結(jié)晶自水和乙醇中形成菱形結(jié)晶，等電點為等電點為，分解 點為297，在在25水中溶解度為水中溶解度為，在在75水中為水中為， 在20乙醇中為，不溶于丙酮及乙醚。25D 為 +18（C，

37、在水中）， 25D為-14.6（C ，在5molL HCl中）。 （2）L-Asp和和L-Ala的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng) （3）工藝路線）工藝路線 固定化酶固定化酶 凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)的使用 的酶都稱為固定化酶。固定化酶。 通常采用的固定化方法可大體概括為四種類型： 吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。 吸附法吸附法 這是通過載體表面和酶分子表面間的次級次級 鍵相互作用鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，又可分：物理吸物理吸 附和離子交換吸附附和離子交換吸附。 物理吸附物理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和氫鍵、疏水鍵和電子親和力電子親和力等 物理作用力

38、將酶固定于不溶性載體不溶性載體的方法。 常用的載體載體有：皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠和 微孔玻璃等無機(jī)吸附劑，纖維素、膠原、賽珞玢賽珞玢以及 火棉膠等有機(jī)吸附劑有機(jī)吸附劑。 最常用的交換劑有CM（羧甲基）纖維素、（羧甲基）纖維素、 DEAE（二乙基氨基乙基）纖維素、（二乙基氨基乙基）纖維素、DEAE葡聚葡聚 糖凝膠糖凝膠等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附 劑，約50150mg蛋白g載體。 共價偶聯(lián)法共價偶聯(lián)法 這是借助共價鍵共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載 體的功能基團(tuán)功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)以制備固定化酶的方法。 常用的載體載體有：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚 丙烯酰胺、多

39、聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐共聚物、 聚苯乙烯、尼龍等；還有無機(jī)載體如多孔玻璃等。 交聯(lián)法交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶分子與酶分子間或酶分子與 惰性蛋白間、或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以共價惰性蛋白間、或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以共價 鍵鍵制備固定化酶。 包埋法包埋法 將聚合物聚合物的單體單體和酶溶液混合后，再借助聚合促進(jìn)聚合促進(jìn) 劑（包括交聯(lián)劑）劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行聚合，將酶包埋于聚合 物中以達(dá)到固定化的目的。 （1）膠格包埋膠格包埋最常用的包埋劑是聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠， 它以丙烯酰胺丙烯酰胺為單體、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交亞甲基雙丙烯酰

40、胺為交 聯(lián)劑聯(lián)劑聚合而成。 （2）微囊型包埋微囊型包埋是用直徑幾十到幾百微米、厚約 25nm的半透膜半透膜將酶分子進(jìn)行包埋固定化的方法。 （3）脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋 脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)脂雙層結(jié)構(gòu)和一定 包裹空間的微球體微球體。 輔酶及偶聯(lián)酶輔酶及偶聯(lián)酶的固定化 輔酶物質(zhì)的固定化一般采用載體共價偶聯(lián)法載體共價偶聯(lián)法。 （4）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 大腸桿菌（大腸桿菌（Esscherichia coli）的培養(yǎng)）的培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基為 普通肉汁培養(yǎng)基普通肉汁培養(yǎng)基； 搖瓶培養(yǎng)基成分（）搖瓶培養(yǎng)基成分（）為玉米漿，反丁烯二酸， MgSO47H2，氨水調(diào)pH6.0,煮沸后

41、過濾，500ml三角燒 瓶中培養(yǎng)基裝量50100m1。 從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種于搖瓶培養(yǎng) 基中，37振搖培養(yǎng)24h，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至1000 2000L規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1molL HCl調(diào)，升溫至 45并保溫1h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)筒式高速離心機(jī)收集轉(zhuǎn)筒式高速離心機(jī)收集 菌體（含天冬氨酸酶）菌體（含天冬氨酸酶），備用。 德阿昆哈假單胞菌（德阿昆哈假單胞菌（Pseudomonas dacunhae）68變異變異 株的培養(yǎng)株的培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基組成（）為斜面培養(yǎng)基組成（）為 蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，瓊脂。 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基相同，唯不加瓊脂， 250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為4

42、0m1。 搖瓶培養(yǎng)基組成搖瓶培養(yǎng)基組成（）為L-谷氨酸，蛋白胨，酪蛋 白水解液，磷酸二氯鉀，MgSO47H2，用氨水調(diào)， 500ml三角瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。 將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中， 30振搖培養(yǎng)8h，再接種子搖瓶培養(yǎng)基中，30振蕩 培養(yǎng)24h，如此逐級擴(kuò)大至10002000L的培養(yǎng)罐培養(yǎng)。 培養(yǎng)結(jié)束后用1molLHCl調(diào)pH至，于30保溫1h， 用轉(zhuǎn)筒式高速離心機(jī)離心收集菌體（含含L-天冬氨酸天冬氨酸- 脫羧酶），備用。脫羧酶），備用。 細(xì)胞固定細(xì)胞固定Ecoli的細(xì)胞固定的細(xì)胞固定 取濕菌體20kg懸浮 于80L，生理鹽水（或離心后的培養(yǎng)清液）中，保溫保溫 至至

43、40，再加入90L保溫至保溫至40的12明膠明膠溶液及 戊二醛戊二醛溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，放置冷卻凝固，再漫于漫于 戊二醛溶液戊二醛溶液中。于5過夜后，切成35mm的立方 小塊，浸于戊二醛戊二醛溶液中5過夜、蒸餾水充分洗 滌，濾干得含天冬氨酸酶的固定化，備用。 假單胞菌體固定假單胞菌體固定 取濕菌體20kg，加生理鹽水?dāng)噭虿⑾♂屩?0L， 另取溶于生理鹽水的5角叉菜膠角叉菜膠溶液85L，兩液均保 溫至45后混合，冷卻至5成膠。浸于600L2%KCl 和和L己二胺的的磷酸緩沖液中己二胺的的磷酸緩沖液中，5下攪拌10分鐘， 加戊二醛至戊二醛至L濃度濃度，5攪拌30分鐘，取出切成3 5mm的立方小塊，

44、用2% KCl溶液充分洗滌后，濾去 洗滌液，即得含含L-天冬氨酸天冬氨酸-脫羧酶的固定化細(xì)胞脫羧酶的固定化細(xì)胞， 備用。 轉(zhuǎn)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng) 將保溫至保溫至37的lmolL延胡索酸銨延胡索酸銨（含1mmolL MgC12，）底物溶液按一定空間速度（Sv）連續(xù)流過 生物反應(yīng)堆反應(yīng)堆I，控制達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率（最大轉(zhuǎn)化率（95）為限 度，收集轉(zhuǎn)化液制備制備L-Asp或用于生物反應(yīng)堆反應(yīng)堆的再 轉(zhuǎn)化。 當(dāng)需要生產(chǎn)L-丙氨酸時，向上述轉(zhuǎn)化液中加磷酸磷酸 吡哆醛吡哆醛至L濃度濃度，調(diào)，保溫至37，按一定空間速 度流入1.515105Pa壓力下的生物反應(yīng)堆，控制達(dá) 到最大轉(zhuǎn)化率（最大轉(zhuǎn)化率（95）為限，收集轉(zhuǎn)化

45、液，用于制 取L-丙氨酸丙氨酸。 產(chǎn)品純化與精制產(chǎn)品純化與精制 生物反應(yīng)堆生物反應(yīng)堆轉(zhuǎn)化液經(jīng)過濾澄清， 攪拌下用1molL HCl調(diào)調(diào)，5結(jié)晶結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶， 用少量冷水洗滌抽干，105干燥干燥得L-Asp粗品。粗品。粗 品用稀氨水溶解（稀氨水溶解（pH5）成15溶液，加1%（wv） 活性炭，活性炭，70攪拌脫色攪拌脫色1h過濾過濾,濾液于5結(jié)晶過夜， 濾取結(jié)晶，85真空干燥得藥用藥用L-Asp。 生物反應(yīng)堆生物反應(yīng)堆轉(zhuǎn)化液過濾澄清，于于6070下減 壓濃縮至原體積的50，冷卻后加等體積甲醇甲醇，5 結(jié)晶過夜結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶并用少量冷甲醇洗滌抽干，80 真空干燥得L-Ala粗品。粗品用3

46、倍體積（倍體積（wv）去 離子水于80攪拌溶解，加0.5%（wv）藥用活性）藥用活性 炭炭于70攪拌脫色攪拌脫色1h，過濾，濾液冷后加等體積甲 醇，5結(jié)晶過夜結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，于80真空干燥得藥 用LAla。 （5）檢驗）檢驗 （6）作用與用途）作用與用途 L-Asp有助于鳥氨酸循環(huán)，促進(jìn)氨 和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2,增強(qiáng)肝功能，消 除疲勞，用于治療慢性肝炎、肝硬化及高血氨癥。同 時L-Asp和L-Ala都是復(fù)合氨基酸輸液的原料。 2，酶拆分法制備，酶拆分法制備L-苯丙氨酸苯丙氨酸 （1）L-苯丙氨酸（苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-phe）的結(jié)）的結(jié) 構(gòu)與性質(zhì)構(gòu)與

47、性質(zhì) L-phe，存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需人體必需 氨基酸之一氨基酸之一，其分子式為C9H11NO2，分子量為，結(jié)構(gòu) 為： L-Phe自水中結(jié)晶成白色葉片狀晶體葉片狀晶體，無臭，微 苦，pI為為；分解點為分解點為283284。在25水中溶解度 為，在75水中為，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。 1%水溶液水溶液pH為為。25D為-4.47（C，在 5molL HCl中），25D為-34.5（C，在水 中）。 （2）酶拆分）酶拆分DL-Phe的原理：的原理：DL-Phe與醋酸酐反應(yīng)醋酸酐反應(yīng) 生成乙酰乙酰-DL-Phe（Ac-DL-Phe），氨基?；缚蓪０被；缚蓪?一性水解一性水解Ac

48、-L-Phe的酰胺鍵生成的酰胺鍵生成L-Phe，而不水解不水解Ac- D-Phe酰胺鍵酰胺鍵，再利用利用L-Phe與與Ac-D-Phe在水中溶解在水中溶解 度的差異進(jìn)行分離度的差異進(jìn)行分離。 Ac-D-Phe又可經(jīng)消旋生成又可經(jīng)消旋生成Ac-DL-Phe，再行水解和 分離，如此反復(fù)進(jìn)行，可將DL-Phe全部轉(zhuǎn)化為L-Phe。 DL-Phe拆分的基本反應(yīng)過程如下： （3）工藝路線）工藝路線 （4）工藝過程）工藝過程 固定化氨基酰化酶的制備固定化氨基?；傅闹苽?取DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基乙基葡聚糖,G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水 值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水

49、克）于 去離子水中充分浸泡后，依次用10倍量L HCl和和L NaOH溶液攪拌處理溶液攪拌處理30min，再用去離子水洗至中性， 然后依次用0.1molL及及L的磷酸緩沖液處理的磷酸緩沖液處理12h， 濾干備用。 另取培養(yǎng)4050h的米曲擴(kuò)大曲米曲擴(kuò)大曲用6倍量去離子水分 兩次抽提，濾去殘渣濾去殘渣。濾液用2molL NaOH溶液調(diào)， 按100L酶液加1kg已處理的濕DEAE-SephadexA-50的 比例混合比例混合，于04攪拌吸附45h，濾取DEAE- Sephadex A-50，依次用去離子水、L醋酸鈉醋酸鈉、L 的磷酸緩沖液洗滌34次，濾干得固定化氨基?；腹潭ɑ被；?， 加1甲

50、苯甲苯后于冷庫中貯存，備用。 Ac-DL-Phe的制備的制備 將DL-Phe、冰醋酸及醋酸酐冰醋酸及醋酸酐按 1 7 1（wVv）的比例加入反應(yīng)釜中，90反反 應(yīng)應(yīng)45h，回收醋酸，濃縮液加一定量去離子水，再 濃縮至一定體積，冷卻結(jié)晶冷卻結(jié)晶，濾取結(jié)晶于60真空干真空干 燥得燥得AcDLPhe。 酶水解酶水解 在1000L反應(yīng)罐中加L Ac-DL-Phe鈉鹽溶液鈉鹽溶液，攪 拌下滴加6molL HCl至，加1520kg固定化氨基固定化氨基 ?；铬；?，50反應(yīng)反應(yīng)45h，過濾，濾液待分離LPhe， 固定化酶再用于轉(zhuǎn)化。 分離純化分離純化 上述濾液用6molL HCl調(diào)至，減壓 濃縮濃縮至35

51、L左右，濃縮液于0結(jié)晶結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶 并用10L冷乙醇洗滌三次，抽干,于80烘烘34h，得L Phe粗品。濾液和洗滌液合并后減壓濃縮至20L左 右，得Ac-D-Phe溶液，待消旋和再轉(zhuǎn)化。 精制精制 取50L去離子水于100L反應(yīng)罐中，加熱至 95100，投入5kg LPhe粗品粗品，攪拌溶解溶解，加藥 用活性炭活性炭，攪拌脫色3min。趁熱過濾趁熱過濾，濾液轉(zhuǎn)移至 200L結(jié)晶罐中，冷卻至40，加50 L 40 95乙乙 醇，用醇，用6molL HCl調(diào)調(diào)，于0結(jié)晶結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶， 用10L冷乙醇洗滌冷乙醇洗滌34次次，抽干，于80干燥34h。 母液濃縮回收L-Phe結(jié)晶，所得結(jié)晶如

52、上法重結(jié)晶一 次，得藥用LPhe。結(jié)晶母液及洗滌液合并,減壓濃 縮后轉(zhuǎn)入粗品母液，待消旋待消旋。 AcDPhe的消旋的消旋 上述粗品及精品粗品及精品L-Phe母液母液及 洗滌液合并后濃縮至60L,于100L反應(yīng)罐中在攪拌下 緩緩加入醋酸酐醋酸酐，在2545攪拌反應(yīng)30min，冷卻 至室溫，放置6h，用濃鹽酸調(diào)調(diào)，5結(jié)晶過夜，濾 取結(jié)晶，用去離子水洗滌35次，每次20L，抽干， 于40真空干燥得真空干燥得AcDLPhe。 （5）檢驗）檢驗 應(yīng)為白色葉片狀結(jié)晶，其含量應(yīng)在 之間，25D為-32.3+34.3，1水溶液pH 為，干燥失重應(yīng)不超過，熾灼殘渣應(yīng)不超過， 氯化物、硫酸鹽及重金屬均與異亮氨酸

53、規(guī)定相同，砷 鹽應(yīng)不超過，鐵鹽應(yīng)不超過0.003%。 含量測定含量測定： （6）作用與用途）作用與用途 L-苯丙氨酸為復(fù)合氨基注射液復(fù)合氨基注射液的重 要原料之一，也是合成苯丙氨酸 氮芥及對氟苯丙氨酸 等抗癌藥的原料。 四、化學(xué)合成法四、化學(xué)合成法 （一）基本原理與過程（一）基本原理與過程 以-鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、 乙酰氨基丙二酸二乙酯、鹵代烴、乙酰氨基丙二酸二乙酯、鹵代烴、-酮酸及某些氨基酮酸及某些氨基 酸酸為原料，經(jīng)氨解、水解、縮合、取代及氫化還原氨解、水解、縮合、取代及氫化還原 等化學(xué)反應(yīng)合成-氨基酸的方法稱為化學(xué)合成法化學(xué)合成

54、法。 一般合成法一般合成法和不對稱合成法不對稱合成法兩大類。 一般合成法一般合成法包括鹵代酸水解法、氰胺水解法、乙 酰氨基丙二酸二乙酯法、異氰酸酯（鹽）合成法及醛 縮合法等；產(chǎn)物皆為DL-型氨基酸混合物型氨基酸混合物。 不對稱合成法不對稱合成法包括直接合成、-酮酸反應(yīng)及不對稱不對稱 催化加氫等方法催化加氫等方法。產(chǎn)物為L-型氨基酸型氨基酸。 （二）化學(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）化學(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 理論上理論上所有氨基酸皆可由化學(xué)合成法制造，但在目 前，只有當(dāng)采用其它方法生產(chǎn)很不經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)時才采用化學(xué) 合成法生產(chǎn)，如甘氨酸、DL-蛋氨酸及DL-丙氨酸等 現(xiàn)僅介紹L-脯氨酸及脯

55、氨酸及L-蘇氨酸蘇氨酸的化學(xué)合成及其分 離純化工藝。 1、L-脯氨酸（脯氨酸（L-Proline，L-Pro）的制備）的制備 （1）L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)脯氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L-脯氨酸存在于所有 蛋白質(zhì)中，雞毛中含量較豐富。其化學(xué)名稱為吡咯 啶-甲酸或吡啶烷環(huán)-2-羧酸，分子式為C5H9NO2， 分子量為。 L-Pro自乙醇-乙醚中得白色粉末狀結(jié)晶，pI為為，熔 點220222。極易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。極易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。 有旋光。 （2）合成路線）合成路線 : L-Pro可采用化學(xué)合成法、發(fā)酵法及 蛋白質(zhì)原料水解分離法生產(chǎn)，合成法也有不同的原 料和工藝。以濃硫酸為脫水劑，使以

56、濃硫酸為脫水劑，使L-谷氨酸與乙醇谷氨酸與乙醇 縮合成縮合成L-谷氨酸谷氨酸-乙酯，后者經(jīng)硼氫化鉀還原即成乙酯，后者經(jīng)硼氫化鉀還原即成 L-Pro。 反應(yīng)過程反應(yīng)過程 （3）工藝路線）工藝路線 五氯酚乙醇溶液得復(fù)鹽沉淀。五氯酚乙醇溶液得復(fù)鹽沉淀。 3%氨水解析氨水解析 乙醚去雜質(zhì)。乙醚去雜質(zhì)。 含量測定含量測定： 2、L-蘇氨酸（蘇氨酸（L-Threonine，L-Thr）的制備）的制備 （1）L-蘇氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)蘇氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) L-蘇氨酸存在于所有 蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一人體必需氨基酸之一。其分子式為 C4H9NO3，分子量為， L-Thr純品為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，微甜

57、， 等電點為等電點為,熔點為255257，溶于水，不溶于乙醇、溶于水，不溶于乙醇、 乙醚及氯仿乙醚及氯仿。在堿液中不穩(wěn)定，受熱易分解為甘氨 酸和乙醛。 L-Thr分子中有兩個不對稱碳原子，故有LD Thr和LD別蘇氨酸四種異構(gòu)體四種異構(gòu)體，唯L-Thr具有生理 活性。 （2）合成路線）合成路線: L-Thr的合成原料為甘氨酸和乙醛。 甘氨酸先與堿式硫酸銅反應(yīng)生成甘氨酸銅，后者在 堿性條件下與乙醛縮合成DL-Thr銅，并以播種結(jié)晶 法（優(yōu)先結(jié)晶法）拆分得L-Thr和D-Thr。反應(yīng)過程 為： （3）工藝路線）工藝路線 拆分拆分 取72L去離子水、20kg DL-Thr精品及2.25kg D-TH

58、r于200L反應(yīng)罐中，攪拌下迅速升溫到95至全 溶，再迅速降溫至40，投入投入225g D-Thr結(jié)晶，結(jié)晶，緩緩 降溫至2930，迅速過濾，濾餅于80，烘干得D- Thr粗品。濾液再投入與已分出的D-Thr等量的DL-Thr， 余操作與拆分D-Thr相同，投入225g L-Thr結(jié)晶，最后 得L-蘇氨酸粗品。母液再投入適量D-Thr、DL-Thr及水， 令三者比例為令三者比例為。 第三節(jié)第三節(jié) 氨基酸輸液氨基酸輸液 多種結(jié)晶L-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內(nèi)輸靜脈內(nèi)輸 注液注液謂之氨基酸輸液氨基酸輸液。氨基酸輸液可直接注入進(jìn)食不 足者的血液中，促進(jìn)蛋白質(zhì)、酶及肽類激素的合成， 提高血漿蛋白濃度與組織蛋白含量，維持氮平衡，調(diào)氮平衡，調(diào) 節(jié)肌體正常代謝。節(jié)肌體正常代謝。 現(xiàn)已有含氨基酸數(shù)目為11、14、18及20種等多種輸 液類型，氨基酸濃度分別有3、5、9、10及 12等多種規(guī)格。 有些氨基酸輸液還加入山梨醇、木糖、維生素、山梨醇、木糖、維生素、 Na、K、Ca2+或Mg2+等成分，以補(bǔ)充能量，提高氨氨 基酸基酸的利用率及其營養(yǎng)價值營養(yǎng)價值，也有些氨基酸輸液與右氨基酸輸液與右 旋糖酐配伍旋糖酐配伍制成較理想的代血漿代血漿。 一、氨基酸輸