大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

1、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢 全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動子 終止子 核糖體結(jié)合

2、位點 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 P tac = 3 P trp = 11 P lac 啟動子-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 啟動子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序為： 啟動子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lac

3、Z-lacY-lacA） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 啟動子 Lac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 cAMP CAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 Lac 表達(dá)系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專一位點結(jié)合 后，能促進(jìn) RNA 聚合酶與 35、10 序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn) Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 基因工程中使用的 lac 啟動子

4、均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5 cAMP 葡萄糖代謝 cAMP濃度降低 cAMP CAP CAP Lac 表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控，因此用它 構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時比野生型 Plac 更易操作。 Lac 表達(dá)系統(tǒng) 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 在無誘導(dǎo)物情形下， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動 子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 lac

5、I Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 RNA 聚合酶 IPTG mRNA Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的雜 合啟動子。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高于 trp 和 lacUV5 啟動子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達(dá) 水平的情況下，選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越。 啟動子-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T

6、 A A C T P tacT T G A C AT A T A A T lac、tac 啟動子對宿主菌的要求 在普通大腸桿菌中， LacI 阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上 lac 操縱子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。 當(dāng)多拷貝的 lacO 隨著帶有 lacUV5、tac 啟動子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入 大腸桿菌后，LacI 阻遏蛋白與 lacO 的比例顯著下降，無法保證每一 個 lacO 都能獲得足夠的 LacI 阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘 導(dǎo)物存在的情形下， lacUV5、tac 啟動子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。 lac、tac 啟動子對宿主菌的要求 為了使以 Lac、Tac 表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄

7、的能力，一 種能產(chǎn)生過量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應(yīng)用于表 達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌 JM109 等菌株的基因型均為 lacIq ，常被選用為 Lac、Tac 表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。 但是這些菌株也只能對低拷貝的表達(dá)載體實現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控，在使用高拷 貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。 需在表達(dá)載體中插入 lacIq 基因以保證有較多的 LacI 阻遏蛋白產(chǎn)生。 lac、tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 IPTG 用于誘導(dǎo) lac、tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。從安全角度，對表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。 一些國家

8、規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用 IPTG 解決方法 lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄 lac、tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 把阻遏蛋白 LacI 的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達(dá)載體或 整合到染色體后，均能使 lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控 在較低溫度（30）時抑制，在較高溫度（42）時開放。 用乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用

9、 這一過程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化，其效率受到多種因素的影響和制約 因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于IPTG。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也 會導(dǎo)致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代 lPTG 作為誘導(dǎo)劑的研究 要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來，才能顯示其良好的前景。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 色氨酸啟動子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中 往往添加 IAA 誘導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá) 啟動子 Trp 表達(dá)系統(tǒng)

10、 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) Trp 表達(dá)系統(tǒng) Ptrp Otrp RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 高效轉(zhuǎn)錄 mRNA Ptrp Otrp 去除 色氨酸 高效轉(zhuǎn)錄 mRNA Ptrp Otrp 加入 IAA RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中， PL 、 PR 啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。 啟動子 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 由 l 噬菌體 PE 啟動子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、 PR 啟動子轉(zhuǎn)

11、錄的 阻遏物。cI 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與 噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過細(xì)胞因子來控制cI 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。 因此 PL 、 PR 表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來調(diào)控 PL 、 PR 啟動子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度（30）時以活性形式存在 在較高溫度（42）時失活脫落 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 宿主菌中沒有 cI 基因產(chǎn)物，PL、PR 啟動子的高強(qiáng)度直接轉(zhuǎn)錄，帶有PL 或 PR 啟動子的表達(dá)載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定。 對宿主菌的要求 用溶源化 l 噬菌體的大腸桿菌作 PL、PR 啟動子表達(dá)載體的

12、宿主菌 N4830-1，POP2136 等菌株已經(jīng)溶源化 cI 857(ts) l 噬菌體， 可用作表達(dá)外源基因時的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因組裝在表達(dá)載體上 宿主菌選擇范圍更大 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 由于 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾 個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用 PL 或 PR 表達(dá)系統(tǒng)。 缺陷 在熱脈沖誘導(dǎo)過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白。 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從 30 提高到 42 需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影

13、響誘導(dǎo)效 果，對重組蛋白表達(dá)量有一定的影響。 T7 表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一 體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為 T7 表達(dá)系統(tǒng)。 T7 表達(dá)系統(tǒng) T7 噬菌體基因 1 編碼的 T7 RNA 聚合酶選擇性的激活 T7 噬菌體啟 動子的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn) 錄的序列。 在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7噬 菌體啟動子控制的

14、基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。 化學(xué)誘導(dǎo)型 溫度誘導(dǎo)型 雙質(zhì)粒系統(tǒng) T7 RNA 聚合酶 T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？啟動子 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于 Lac 表達(dá) 系

15、統(tǒng)。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 啟動子 E.Coli （DE3） T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶 IPTG 誘導(dǎo) T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 溫度誘導(dǎo)型 PL 啟動子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā) T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到 很低的水平，尤其適用于表達(dá) 對大腸桿菌宿主有毒性的重組 蛋白質(zhì)。 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動子 E.Coli （CE6） T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶 熱誘導(dǎo) cI857 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 雙質(zhì)粒系統(tǒng) 一個質(zhì)粒帶有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一個質(zhì)粒帶有

16、 T7 啟 動子和目的基因 兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記 不能相同 調(diào)控方式為控制 T7 RNA 聚合 酶的啟動子調(diào)控類型 T7 RNA 聚合酶 熱誘導(dǎo) T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動子 cI857 p15A ori KanR ColE1 ori AmpR T7 表達(dá)系統(tǒng)存在的問題 T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但 也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿 菌宿主有毒性，會影響細(xì)胞的生長。 解決辦法之一 在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá) T7 溶菌酶基因。 因為 T7 溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外，還能與 T7 R

17、NA 聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。 目前 T7 溶菌酶基因都通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯 降低本底轉(zhuǎn)錄，但對誘導(dǎo)后目的基因的表達(dá)水平無明顯影響。 營養(yǎng)調(diào)控型 采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因 phoA 啟動子或甘油 3-磷酸轉(zhuǎn)移系 統(tǒng) ugp 啟動子構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機(jī)磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi5mmol/L 時抑制，Pi1mmol/L 時激活)，具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。 其他表達(dá)系統(tǒng) 糖原調(diào)控型 采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（mglBAEC) mgl 啟動子或沙門 氏菌阿拉伯糖基因 araB 啟動子構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘

18、導(dǎo)物。 其調(diào)控機(jī)理類似于 Lac 表達(dá)系統(tǒng). 其他表達(dá)系統(tǒng) pH調(diào)控型 采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因 cadA 啟動子構(gòu)建表達(dá)載體。 cadA 啟動子受培養(yǎng)基中 H+ 濃度，即 pH 值調(diào)控。（在pH8 時抑 制，pH 6時激活，pH = 6時轉(zhuǎn)錄活力最高）。 該表達(dá)系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在 27 30 之間才能使目的基 因得到穩(wěn)定的表達(dá). 其他表達(dá)系統(tǒng) 溶氧調(diào)控型 采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 啟動子，硝基還原酶基 因nirB 啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 啟動子構(gòu)建表達(dá)載 體。這些啟動子中都含有對氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子 fnr 的作用位點。 在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制，在貧氧或

19、微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活。 其他表達(dá)系統(tǒng) 溶氧調(diào)控型 大腸桿菌 GJ100 有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子控制下 的 T7 RNA 聚合酶基因表達(dá)質(zhì)粒， vgb 基因的轉(zhuǎn)錄是受環(huán)境溶氧 濃度調(diào)控的，在貧氧條件下 vgb 基因的啟動子被激活。 因此，用大腸桿菌GJ100 作為宿主時，表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧 誘導(dǎo)型， 菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量 加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程。 其他表達(dá)系統(tǒng) 生物素調(diào)控型 用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達(dá)載體，菌體生長過程 中生物素會不斷消耗，當(dāng)濃度到達(dá) 2ng/ml 以下時啟動子被激活。 能夠在沒有外界的物理

20、，化學(xué)信號的介入條件下自動誘導(dǎo)表達(dá)目的 基因是這類表達(dá)載體的特點，其缺陷是不容易精確控制自動誘導(dǎo)的 時刻。 其他表達(dá)系統(tǒng) 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑 過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長短不一的 mRNA 混合物過 長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時間就相應(yīng)增加，外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo) 記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾

21、質(zhì)粒的復(fù)制及其 它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mRNA 往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子 核糖體結(jié)合位點 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻 率，而且在很大程度上還與 mRN

22、A 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它 們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核 糖體結(jié)合位點（RBS） 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3 端區(qū)域 3 AUUCCUCC 5 并與之專一性結(jié)合 將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分

23、基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 SD 序列的影響 一般來說，mRNA 與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就 越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD （ UAAGGAGG）序列與 16S rRNA 的堿基互補(bǔ)性，其中以 GGAG 四個堿基序列尤為重要。 對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成 C 或 T，均會導(dǎo) 致翻譯效率大幅度降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 SD

24、 序列與起始密碼子之間的序列的影響 SD 序列下游的堿基若為 AAAA 或 UUUU，翻譯效率最高；而 CCCC 或 GGGG 的翻譯效率則分別是最高值的 50% 和 25%。 緊鄰 AUG 的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。 對于大腸桿菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在這個位置上最佳 的堿基組合是 UAU 或 CUU，如果用 UUC、UCA 或 AGG 取代 之，則酶的表達(dá)水平低 20 倍 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 SD 序列與起始密碼子之間的距離的影響 SD 序列與起始密碼子 AUG 之間的精確距離保證了 mRNA 在 核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AU

25、G 正好處于核糖體復(fù)合物 結(jié)構(gòu)中的 P 位，這是翻譯啟動的前提條件。 在很多情況下，SD 序列位于 AUG 之前大約七個堿基處，在此 間隔中少一個堿基或多一個堿基， 均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同 程度的降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 大腸桿菌中的起始 tRNA 分子可以同時識別 AUG、GUG 和 UUG 三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG 為 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 除此之外，從 AUG 開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至 少這一序列不能與 mRNA 的 5 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)

26、結(jié)構(gòu)，否則便 會嚴(yán)重干擾 mRNA 在核糖體上的準(zhǔn)確定位 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與 啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的。 核糖體結(jié)合位點 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子 使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT 的生物（如單鏈 DNA噬菌體X174）基因組中，密碼子 第三位上的 U 和 A 出現(xiàn)的頻率較高； 在 GC 豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G 或 C 的 簡并密碼子占 90% 以上的絕對優(yōu)勢 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強(qiáng)度規(guī)律 如

27、GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多 細(xì)胞內(nèi) tRNA 的含量 密碼子 生物體對密碼子的偏愛性 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大 的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻 譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。 一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞 中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān) tRNA 編碼基因 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對細(xì)菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛

28、使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百 甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)， 而此時正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目 的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的 不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點是： 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單； 能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞總蛋白的 20%40%。 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種： 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為

29、不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于本身的 功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最終分泌到周質(zhì)空 間，或外泌到培養(yǎng)液中。 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 分泌型異源蛋白的表達(dá) 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致 密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié) 構(gòu)稱為包涵體（Inclusion

30、 Bodies，IB）。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿 菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和 生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異 源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密

31、度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì) 菌裂解物中分離出來 能夠表達(dá)對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白 。 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達(dá)形式的缺點 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具 有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo) 產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。 經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性， 有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成

32、功率相當(dāng)?shù)停?一般不 超過 30% 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在 人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價， 但影響復(fù)性和純化 促 溶 劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜， 但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染， 后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng) 混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用， 溶解力增強(qiáng) 極 端 pH 廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng) 包涵體型異源

33、蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding） 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)： 將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊 通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來的問題， 但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往 往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二 硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的其他部位。 分泌型異源蛋白的表達(dá) 這是因為大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利于蛋白質(zhì)二硫鍵 的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須

34、的體系。一些需要通過二硫鍵的形 成來維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊。 解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因 trxB 缺陷株作為宿主菌表達(dá)目標(biāo)蛋白。研究表明trxB 缺陷株細(xì)胞質(zhì)的氧化 還原態(tài)勢發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在 trxB 缺陷株的細(xì)胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。 這一菌株對于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一個相當(dāng)重要的工具。 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通 常為編碼甲硫氨酸的 ATG。 在多數(shù)情況下，N 端附加的甲硫氨

35、酸對蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有特別的 影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活力的報道。 另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。 從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來看，這是一個需要引起重視的問題。 去除附加的甲硫氨酸有二種方法去除附加的甲硫氨酸有二種方法： 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因。 在分離純化后在體外用外肽酶處理。 但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定 要求，因此在使用上有一定的限制。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá) 與純化包涵體相比，細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式表達(dá)蛋白質(zhì)的分離純化過 程比較復(fù)雜，一般要通過親合層析才能

36、達(dá)到比較高的純度。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效 率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。 金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn) 移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白，His-tag 等是目前常用的與目標(biāo)基因融 合表達(dá)的序列。 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá) 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總 蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含最與在細(xì)胞質(zhì)中相比也少得多，因此目標(biāo) 蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。 目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過

37、程中信號肽被加工切除，有 效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標(biāo)蛋白能夠較好折疊， 維持正確的構(gòu)象。 目標(biāo)蛋白外泌表達(dá)目標(biāo)蛋白外泌表達(dá) 把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解 酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方案: （1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) （2）與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) （3）改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而 且外泌效率一般都比較低。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 t

38、RNA 基因 提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計 在各種表達(dá)載體中，啟動子和 SD序列的下游都設(shè)計了一段含有各種 限制性酶切位點的序列，用于目標(biāo)基因的插入。這一插入位點附近的 序列將成為核糖體結(jié)合位點的一部分，因此它對于構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒 是至關(guān)重要的。 由于每一個基因都具有各自獨特的 5 端結(jié)構(gòu)，最終構(gòu)建成的各種表 達(dá)質(zhì)粒所具有的核糖體結(jié)合位點是一個變量。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼 ATG 與 SD 序 列之間的距離和堿

39、基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。 核糖體結(jié)合位點序列的變化對 mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表 現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高36倍 翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 68 個堿基長度， 與 AAGAA 的最適距離是57 個堿基長度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 4個堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個堿基； mRNA 的翻譯才能進(jìn)行 ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A，T 堿基豐富時，mRNA 翻譯效 率較高。 核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因 mRNA 5 端的二級 結(jié)構(gòu)，研究表明討 mRNA

40、 5端形成的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu)阻礙了 mRNA 與核糖 體 30S 亞基的結(jié)合，從而抑制了翻譯的起始。 盡量提高核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低 mRNA 5 端形成的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時需要注意 的事項。 在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR 等技術(shù)改變個別關(guān)鍵的堿 基來破壞 mRNA 5 端的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu) 。 把目標(biāo)基因設(shè)計成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元 件后加上第二個 SD 序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適 用于目標(biāo)基因 5 端序列容易形成二級結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計 在

41、構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時，充分利用各個基因的結(jié)構(gòu)特征和特點，注意引入 翻譯增強(qiáng)子序列 能提高 mRNA 翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強(qiáng)子 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達(dá)水平低的基因。 現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有： 編碼 Arg 的密碼子 AGA、AGG、CGA、CGG 編碼 Pro 的密碼子 CCC、CCU、CCA 編碼 Cys 的密碼子 UGU、UGC; 編碼 Gly 的密碼子 GGA、GGG 編碼 Leu 的密碼子 CUA、CUC 編碼 Ile 的密碼子 AUA 編碼 Ser 的密碼子 UC

42、A、AUG、UCG、UCC 編碼 Thr 的密碼子 ACA 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的 tRNA 的豐度有正比關(guān)系 稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA 的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移 碼突變。 解決這一問題的辦法： 通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子 tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞 內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 在所有的大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 中，tRNA Arg (AGG/AGA) 含量 最少，而 AG

43、G 和 AGA 密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn)。 人尿激酶原 ProUK，新型組織纖溶酶原激活劑 NTA 等基因中都含有 較多的 AGG 和 AGA 密碼子， 在大腸桿菌中直接表達(dá)的水平很低，但在 大腸桿菌中共表達(dá) tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后， 這些基因的表 達(dá)水平能明顯得到提高。 現(xiàn)在還沒有一個固定規(guī)則來判定稀有密碼子的存在是否確實會對翻譯 過程產(chǎn)生明顯的不利影響。因為稀有密碼子存在的位置、分布的均勻性、 mRNA 的二級結(jié)構(gòu)的不同決定了它對翻譯過程的影響是有差別的。所有 的結(jié)論要通過實驗才能得出。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因

44、產(chǎn)物的穩(wěn)定性 由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白 水解酶能夠降解目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對不 同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 蛋白水解酶的特點 細(xì)胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中最容易受 到蛋白水解酶的作用。 通過對已知大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋臼質(zhì)的統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn) N末 端為Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質(zhì)，含有Pro Glu 、Ser 、Thr 豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解，穩(wěn)定性較差。 在細(xì)胞內(nèi)有多肽碎片、突變的異常

45、蛋白和外界物理因素的刺激的條件 下，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達(dá)到比較高的水平。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有： 利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。 對分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)。 共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。 對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進(jìn)行改造。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 但必須指出的是，由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同，上述幾種 方法在使用上是受到一定

46、的限制的。主要表現(xiàn)為： 大腸桿菌對分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低，不 能滿足大規(guī)饃制備的需要。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速率慢，使高密度發(fā) 酵比較困難。 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活力降低， 甚至沒有活性。 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白。 酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W(xué)法比酶法成本低， 但不少裂解試劑有毒性。 對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面 的數(shù)據(jù)庫還不完整。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組

47、蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝 步驟。其目的是在單個菌體對目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通 過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達(dá)量的提高。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往 往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對 目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切 需要解決的問題。 雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補(bǔ)料速度等措 施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實際應(yīng)用上看，這些措施都有 一定的滯后效

48、應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工 程化宿主菌，是從恨本上解決問題的途徑之一。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的 生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其 對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。 用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶 基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷。 改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合 成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大

49、腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇 的方向進(jìn)行。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 對于以可溶性或分泌形式表達(dá)的目標(biāo)蛋日而言，隨著發(fā)酵后期各種 蛋白水解酶的累積，目標(biāo)蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解。為了 使對蛋白水解酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達(dá)，需要構(gòu) 建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基， r32 亞基對大腸 桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。 rpoH 基因缺陷的突變株己 經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。到目前為 止，已知的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得，其中一 部分具有實際應(yīng)用的潛力。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 構(gòu)建各種表達(dá)載體 建立新的表達(dá)系統(tǒng) 目前研究的重點完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷 等方面。這些研究工作主要包括: 重組蛋白