葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)PPT課件

1、 一、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選 n 我們比較了豬心胨湯（原生產(chǎn) “金葡素”用培養(yǎng)基）、酶解豬心湯 和胰酪胨綜合培養(yǎng)基，接種復(fù)壯后種 子液，以靜置與搖瓶（156r/min）二 種方式作48小時(shí)培養(yǎng)，取出以高速離 心法除去菌細(xì)胞，再用0.45um微孔 濾膜過濾除去殘存菌，取其無菌濾液 用反相膠乳凝集試驗(yàn)（RPLA）測 SET-C含量。 n結(jié)果證明：胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖 瓶培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，其產(chǎn)生 SET-C最高。因此，我們?cè)谧?SET-C提純時(shí)就決定采用胰酪胨 綜合培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)方式來制 備腸毒素原液。 二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液 n 采用中科院上海原子核研究所裝 配的POST-FLO TM

2、 型流動(dòng)循環(huán)超濾 泵，以10000dalton超濾膜對(duì)腸毒素原 液進(jìn)行截留濃縮，除去原液中水份及 10000dalton以下的小分子物質(zhì)，使原 液濃縮達(dá)20倍以上，離心除沉淀，取 其上清，經(jīng)透析作為純化SET-C的原液。 三、用DEAE-纖維素（系Pharmacia 產(chǎn)品）柱層析作第一步提取 n 一般要求DEAE-纖維素40100目， 臨用前過篩，再以蒸餾水漂洗，去除細(xì) 微粒子。用1%NaoH和和1%HCL交替處 理后直至洗滌液呈中性。再用 0.01mol/L PH5.4 PB沖洗平衡，裝柱。 柱大小為4.142cm。裝柱時(shí)切忌氣泡 進(jìn)入，裝好柱后用同一PB緩慢洗滌使整 個(gè)柱內(nèi)達(dá)到平衡，然后上

3、樣。 n即將上一步濃縮透析過的SET-C 原液緩慢加入使全部入柱后。先 用PH5.0 0.01mol/L PB洗滌，使 有色液體流盡。其后作分管收集， 每10分鐘收集一管，其量為 7.5ml，對(duì)收集液逐管在OD280nm 紫外分光自動(dòng)檢測儀測蛋白峰出 現(xiàn)管數(shù)。 n其后相繼換用PH 6.6、0.06mol/L PB 和PH 6.8，0.2mol/L PB分步洗脫，洗 速為45ml/hr，每管仍用OD280nm紫外分 光自動(dòng)檢測儀測洗脫液蛋白吸收峰。 并對(duì)各峰洗脫液合并，再用反相膠乳 凝集試驗(yàn)（RPLA）檢測是否有SET-C 存在，合并蛋白峰。收集結(jié)果證明 SET-C 在第峰，結(jié)果見圖1，并對(duì) 峰

4、用PEG濃縮至一定量，提供下一步純 化。 n圖1：用DEAE-纖維素層析結(jié)果 四、用Sephadex G-75分子篩 層析柱進(jìn)一步純化 n對(duì)收集經(jīng)DEAE-纖維素層析分離 的第峰洗脫液合并，用PEG濃 縮，將濃縮液置透析袋中，用 0.01mol/L PH7.4 PB透析平衡后， 將第一步濃縮透析液再通過事先 準(zhǔn)備好的Sephadex G-75分子篩 柱(2.630cm)過柱。 上樣后用0.01mol/L PH7.4 PB洗脫，洗脫液出 現(xiàn)一個(gè)蛋白峰，用RPLA檢測毒素即在此峰，收 集峰混合，濃縮。結(jié)果見圖2： n圖2：用Sephadex G-75分子篩結(jié)果 對(duì)截留后濃縮液及通過DEAE纖維素柱

5、層析與Sephadex G-75分子篩過柱后各項(xiàng)內(nèi)容的變化情況見表1： 表1：SET-C的提純及回收率 檢測內(nèi)容 項(xiàng)目 體積 （ml） 蛋白量 (mg/ml) 總蛋白 （mg） RPLA (mg/ml) 毒素 （mg） 總回收 率(%) 純度 （%） 分子截留后 的濃縮液 40022.188400.4276.25 DEAE 纖維素峰 10420.72152.84.6180.386646 SephadexG -75峰 524.18217.369.64138.577696.4 從表1可見，通過DEAE-纖維素柱層析后，SET-C回收 率為66%而純度為46%，再通過Sephadex G-75分子篩

6、過柱 后回收率達(dá)76%，而純度則達(dá)96.4%。 五、純化前后SET-C的SDS-PAGE鑒定 n 對(duì)分子截留濃縮的截留原液，經(jīng) DEAE-纖維素初步提以的濃縮液及再 經(jīng)Sephadex G-75分子篩純化后濃縮 液，在同一塊10%的SDS-PAGE凝膠 板上，分別滴樣進(jìn)行電泳后染色觀察， 結(jié)果見圖3： C B A n（A：濃縮液 B：經(jīng)DEAE柱 C：經(jīng)Sephadex G-75柱） n 圖3 SET-C各部樣品的電泳圖譜 從圖3可見，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析后， 雜蛋白帶顯著減少，而再經(jīng)Sephadex G- 75分子篩提純后，在SDS-PAGE中呈現(xiàn)一 條清晰的條帶。 六、純化后的SET-C分子量測定 n對(duì)純化后的SET-C制品與已知分 子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一塊 10%SDS-PAGE凝膠板進(jìn)行電泳 后作染色檢定，結(jié)果見圖4、圖5 （M: standard protein S: sample） 圖4 SDS-PAGE測定腸毒素C分子量 n圖5 SETC分子量測定結(jié)果 30000 n從圖4、圖5中可見純化SET-C在 PAGE中呈現(xiàn)單一條帶，通過與 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量比較計(jì)算，SET- C的分子量約在28000dalton左右。 七、對(duì)SET-C純化品的N末端氨基酸測定 n由我公司提供純化SET-C，請(qǐng)上海 基康生物技術(shù)有限公司，用 PROCI