免疫組化操作步驟.doc

1、免疫組化操作步驟第節(jié)免疫組化操作步驟及抗原修復(fù)（供參考）第二節(jié)免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)耍點（供參考）（一）、儀器設(shè)備1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.2. 水浴鍋（二）、試劑1. PBS 緩沖液（pH7.27.4）2. O.Olmol/L 檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH60,1000ml）3. 3%甲醇一H2O2溶液：用30%HzO2和80%甲醇溶液配制4. 風裱劑小甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0-9.5）等量混合b油和TBS （PBS）配 制5. TBS/PBS pH90-95.適用于熒光纖維鏡標本;pH7.0-7.4適合光學纖維標本（三）、操作流程I、脫蠟和水化：脫

2、蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60C恒溫箱中烘烤20分鐘。a組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘b無水乙醇中浸泡五分鐘c 95%乙醇中浸泡五分鐘d75%乙醇中浸泡五分鐘 2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片:抗原修復(fù)（免疫組化石蠟切片）用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu)，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導致部分抗原衣 位封閉，結(jié)合位點減少，所以需要抗原修復(fù)，以暴露原來的抗原農(nóng)位，達到充分顯露抗原，以不出 現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳?？乖迯?fù)的幾種常用方法（供參考）1. 微波爐加熱：在微波爐里加熱0.01枸椽酸鈉緩

3、沖液（PH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷 電，間隔5-10分鐘，反復(fù)12次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后 靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。適用的抗原；來源于人、大鼠、小鼠的組織標本：來源于其他動物種屬的組織標本：2. 沸熱修復(fù)：電爐或水浴鍋加熱0.01M枸椽酸鈉緩沖液（pH6.0）至95C左右，放入組織芯 片加熱10-15分鐘。3. 高壓熱修復(fù)：在沸水中加入EDTA （pH8.0）或0.01m枸椽酸鈉緩沖溶液（pH6.0） 蓋上 不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分 鐘，然后將蓋（鎖定，小閥門將會升起來。10

4、分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去 后打開蓋此力法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。（骨及軟骨組織的標本最好選擇較 溫和的微波加熱修復(fù)）4. 酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37C,消化時間約為5-30分鐘。 適用于被固定遮蔽的抗原： 包括 石蠟切片免疫組化染色步驟1.三步法（以SP試劑盒為例）石蠟切片脫蠟至水。蒸係水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進行。3%H2O2室溫孵育510分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的沾性，PBS沖洗，2分鐘x3次。5-10%正常山羊血淸封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的“抗或

5、 抗工作液,37C孵W 1-2小時或4C過夜。PBS沖洗，2分鐘x3次。滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋）,379孵育1030分鐘:或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37C或室溫孵育1020分鐘。PBS沖洗,2分鐘x3次。滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37C孵育1030分鐘；或第二代辣 根酶標記鏈霉卵白素工作液，37C或室溫孵育1020分鐘。PBS沖洗，2分鐘x3次。顯色劑顯色（DAB或AEC）。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片。如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素。2.SABC 法（1）脫蠟、水化（2）PBS洗2次各5分鐘（3）用蒸鐳

6、水或PBS配制新鮮的3%H2O2,室溫封閉5-10分鐘，用蒸倔水洗3次（4）抗原修復(fù)(5) PBS洗5分鐘(6) 滴加正常山羊血淸封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體(7) 滴加I抗5()ul,室溫靜置I小時或4C過夜或37C1小時(8) PBS洗3次各2分鐘(9) 滴加生物素化II抗,20C-37C 20分鐘(10) PBS洗3次各2分鐘(11) 滴加試劑 SABC 20C-30C 20 分鐘(12) PBS洗4次各5分鐘(13) DAB顯色：試劑盒或Fl配顯色劑顯色(14) 脫水、透明、封片、鏡檢。冰凍切片的免疫組化染色步驟速凍組織冰凍切片48pim冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱

7、內(nèi)，或進行短暫預(yù)固定后儲 存于-20C冰箱。室溫放置30分鐘后，入4C丙洞固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式。PBS沖洗，5分鐘x3次。用3%過氧化氫孵育510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，5分鐘x3次。下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟(滴加抗開始)。第二節(jié)免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(供參考)1、抗原熱修復(fù)溫度和時間的關(guān)系找們?nèi)粘[作中所使用的組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連.具體過 程如下：第一步基木反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物第二步基木反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞F卩基橋 上述反應(yīng)的結(jié)果導致許篡抗原決定簇被対閉，而加熱可以水解

8、該橋連使抗廉被激活。彩響抗原熱修復(fù)的兩 個最關(guān)鍵的因素是溫度和時間.有人將這兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下而的公式：抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） X加熱時間（t ）也就是說為我們修復(fù)時的溫度越低則需要修復(fù)的時間就越長：反過來為修復(fù)溫度增商時修復(fù)的時間可以 適十地縮短，才能使抗原決定簇完全暴露這種反比的關(guān)系從MBI 克隆抗體的實驗結(jié)果表1中也可以清 楚地看出。時間和溫度對染色的影響時間（分鐘）loo cc 8o*c 6or5x2 + + +5x6 + + + + + +5x10 + + + + +10小時+ +如果修復(fù)強度不夠.免疫組織化學染色所顯示的只能是修復(fù)后暴瞬的部分抗原決定簇，而

9、不是組織所含 的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果.充其址只能起到定性的作 用，不能適應(yīng)今后對免疫組化進行定雖:的需要。這就給我們診斷中定址抬標的應(yīng)用帶來困難.例如用來測 定耐藥的指標。2、組織固定時間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系大雖的實驗表明.固定時間越長的標木.時間的延長.組織中蛋白對溫度的耐受也相應(yīng)増商（如圖1所示）， 這可能就是我們對固定時間長的標木加大修復(fù)強度的理論基礎(chǔ)。固定時間和變性的關(guān)系這就提醒我們在做回顧性的研尤時一定要注總所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標木的修復(fù)條件一定是有所 區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時間或提疵修復(fù)所使用的溫度.才可能得到比較

10、滿總的結(jié)果。3. 不同PII值抗原修復(fù)液對染色結(jié)果的影響抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液PH值也會對染色結(jié)果產(chǎn)生相X大的影響。PH值對染色結(jié)果的影響大概可 以分為以下四種情況A穩(wěn)定型.PH值對染色結(jié)果彩響不大.如PCNA、AEK EMA. CD20等。B_V空，商PH值和低PH值染色較好，而PH值45染色結(jié)果較差，如ER. Ki67等。C一上升型.隨著PH值的増加，染色結(jié)果逐漸增強，如HMB45等。D下降型，隨著PH值的増加染色結(jié) 果逐漸減弱，、作然這種類型的抗休只是個別的現(xiàn)象.如M0C3K一個有趣的現(xiàn)象值得注意，即在商PH值都有較好的染色結(jié)果.所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為商PH 值得修復(fù)液.如或PH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習慣，絕大女數(shù)醫(yī)院和實驗室都在使用PII6.0 的枸穩(wěn)酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床匸作的實際情況許篡國外免疫組化專家建議. 在常規(guī)的免疫組化匚作中，全部選用祐PH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的PH6.0枸椽酸緩沖液。為此. 木公司已經(jīng)推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復(fù)液c經(jīng)驗證，絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0得修復(fù)液效果都 要優(yōu)于PII6.0的枸椽酸.尤其是核陽性的抗體。所以.在常規(guī)的免疫組化工作中，使用島