細(xì)胞增殖及調(diào)控

1、第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞周期細(xì)胞周期(cell cycle)(cell cycle)概述概述 概念： 細(xì)胞從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開始到下一次 細(xì)胞分裂結(jié)束為止，所經(jīng)歷的一個有序過 程 ,包括包括物質(zhì)準(zhǔn)備物質(zhì)準(zhǔn)備和和細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂過程。過程。其間細(xì) 胞遺傳物質(zhì)和其他內(nèi)含物分配給子細(xì)胞。 細(xì)胞周期時相組成 間期間期(interphase): G1 phase，S phase，G2 phase M phase: 有絲分裂期有絲分裂期(Mitosis) 細(xì)胞沿著G1SG2MG1周期性運轉(zhuǎn)，在間期細(xì)胞體 積增大(生長)，在 M 期細(xì)胞先是核分裂，接著胞質(zhì)分裂， 完成一個細(xì)胞周期。 G：gap, 時間間隔； S：

2、synthesis,DNA合成； M：mitosis,分裂。 細(xì)胞周期時間 不同細(xì)胞的細(xì)胞周期時 間差異很大. S+G2+M 的時間變化較小， 細(xì)胞周期時間長短主要 差別在G1期. 有些細(xì)胞會暫時離開細(xì) 胞周期，停止分裂，成 為靜止期或G0期細(xì)胞。 根據(jù)細(xì)胞周期可將高等動物細(xì)胞分為3類： 連續(xù)分裂細(xì)胞，如表皮生發(fā)層、骨髓干細(xì)胞。 休眠細(xì)胞，暫不分裂，適當(dāng)刺激下可重新進(jìn) 入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、 腎細(xì)胞等。 不分裂細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，不再分裂，如 神經(jīng)元、肌肉、多形核細(xì)胞等。 細(xì)胞周期中不同時細(xì)胞周期中不同時相及其主要事件及其主要事件 G G1 1期期：與DNA合成啟動相關(guān)，開

3、始合成細(xì)胞生長所需 要的多種蛋白質(zhì)、RNA、碳水化合物、脂等，同時染色 質(zhì)去凝集。 S S 期期：DNA復(fù)制與組蛋白合成同步，組成核小體串珠 結(jié)構(gòu)。 G2G2期期：DNA復(fù)制完成，染色體倍性由2n變成4n,在G2期 合成一定數(shù)量的蛋白質(zhì)和RNA分子。 M 期期： M期即細(xì)胞分裂期，遺傳物質(zhì)平均分配給子細(xì) 胞和細(xì)胞內(nèi)其它物質(zhì)分配給子細(xì)胞。 細(xì)胞周期的細(xì)胞周期的人工選擇同步化 有絲分裂選擇法有絲分裂選擇法：用于單層貼壁生長細(xì)胞。優(yōu)點是細(xì) 胞未經(jīng)任何藥物處理，細(xì)胞同步化效率高。缺點是 分離的細(xì)胞數(shù)量少。 密度梯度離心法密度梯度離心法：根據(jù)不同時期的細(xì)胞在體積和重量 上存在差別進(jìn)行分離。優(yōu)點是方法簡單

4、省時，細(xì)胞同步化 效率高，分離的細(xì)胞數(shù)量多。缺點是對大多數(shù)種類的細(xì) 胞并不適用。適用于姴殖酵母（fission yeast)和有些 哺乳動物細(xì)胞（如HeLa)。 藥物誘導(dǎo)法同步化 DNA DNA合成阻斷法：合成阻斷法：常用試劑如HU（hydroxyurea，羥基 脲), TdR (胸腺嘧啶核苷）。單次處理可將細(xì)胞群同步 化于G1/S交界處和S期。TdR兩次處理可將細(xì)胞群同步 化在G1/S交界處。優(yōu)點是同步化效率高，幾乎適合于 所有體外培養(yǎng)的細(xì)胞體系，被廣泛采用。 分裂中期阻斷法分裂中期阻斷法：常用試劑如nocodazole，通過抑制 微管聚合來抑制細(xì)胞分裂器的形成，將細(xì)胞群同步化 在M期。優(yōu)點

5、是操作簡便，效率高。缺點是這些藥物的 毒性相對較大，若處理時間長，細(xì)胞常不能恢復(fù)細(xì)胞 周期的運轉(zhuǎn)。 條件依賴性突變株在細(xì)胞周期同步化中的 應(yīng)用：可用于酵母細(xì)胞的同步化，極少 用于動物細(xì)胞。 將與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的條件依賴性突 變株轉(zhuǎn)移到限定條件下培養(yǎng)，所有細(xì)胞 便被同步化在細(xì)胞周期中某一特定時期。 特殊的細(xì)胞周期特殊的細(xì)胞周期 爪蟾爪蟾早期胚胎細(xì)胞早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期：的細(xì)胞周期：細(xì)胞分裂快,無G1期, G2期非常短,S期也短(所有復(fù)制子都激活), 以至認(rèn)為 僅含有S期和M期。細(xì)胞越分裂體積越小。 酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期：酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期：封閉式細(xì)胞分裂 ，即細(xì)胞分 裂時核膜不解聚；紡錘體位于

6、細(xì)胞核內(nèi)。 植物細(xì)胞的細(xì)胞周期：植物細(xì)胞的細(xì)胞周期：植物細(xì)胞不含中心體但在細(xì)胞 分裂時可以正常組裝紡錘體。 細(xì)菌的細(xì)胞周期：細(xì)菌的細(xì)胞周期：快速生長時，細(xì)胞分裂周期為35 分鐘，而DNA復(fù)制一次需70分鐘。第1次復(fù)制未完成， DNA即開始第2次復(fù)制。經(jīng)過70分鐘，DNA復(fù)制產(chǎn)生4個 DNA分子，細(xì)胞分裂2次，得到4個細(xì)胞。 第二節(jié) 細(xì)胞分裂 一、有絲分裂一、有絲分裂(mitosis)(mitosis) 前期前期( (proprophase)phase) 前中期前中期( (prometaprometaphase)phase) 中期中期( (metametaphase)phase) 后期后期(an

7、aphase) 末期末期( (telotelophase)phase) 高等動物細(xì)胞的有絲分裂期可分為： 前期前期(prophase)(prophase) 標(biāo) 志 前 期 開 始 的 第 一 個 特 征 是 染 色 質(zhì) 開 始 濃 縮 (condensation) ，光鏡下可見早期染色體結(jié)構(gòu)。 在前期末，染色體主縊痕部位形成一種蛋白復(fù)合物稱為動 粒(kinetochore)，又稱著絲點，與著絲粒（centromere）緊 密相連。 2個中心體周圍，微管組裝并以中心體為核心向外發(fā)散， 形成2個星體。2個星體逐漸向2極運動而確立細(xì)胞分裂極。 Golgi體、ER等細(xì)胞器解體，形成小的膜泡 前期 前中

8、期前中期(prometaphase)(prometaphase) 核膜破裂，核纖層解體。 紡錘體微管侵入細(xì)胞核與染色體的動粒結(jié)合， 捕捉住染色體。 不斷運動的染色體開始移向赤道板。 前中期 中期中期(metaphase)(metaphase) 所有染色體排列到赤道板(Metaphase Plate)上， 標(biāo)志著細(xì)胞分裂已進(jìn)入中期。 染色體的兩個動粒分別面向紡錘體的兩極。在每個 動粒上結(jié)合的動粒微管可以多達(dá)幾十根。 中期 后期后期(anaphase) 排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離 產(chǎn)生向極運動 后期(anaphase)大致可以劃分為后期A和后期B 后期A，動粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)

9、生兩極運動 后期B，極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉 長，介導(dǎo)染色體向極運動。 用破壞微管的藥物，如用破壞微管的藥物，如nocodazole或秋水仙堿處理，染色體或秋水仙堿處理，染色體 的運動會立即停止。的運動會立即停止。-細(xì)胞分裂停止在細(xì)胞分裂停止在M期期（同步化）（同步化）。 后期 末期末期(telophase)(telophase) 染色單體到達(dá)兩極，即進(jìn)入了末期（telophase）, 到達(dá)兩極的染色單體開始去濃縮 核膜開始重新組裝：小膜泡雙層核膜片段完整的核 膜。 Golgi體和ER重新形成并生長 核仁也開始重新組裝，RNA合成功能逐漸恢復(fù),有絲分裂 結(jié)束 末期 動物細(xì)胞胞質(zhì)分

10、裂動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂 胞質(zhì)分裂(cytokinesis)開始于細(xì)胞分裂后期，在 赤道板周圍細(xì)胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為 分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體極性微管和 鈣離子濃度升高的變化有關(guān)。 胞質(zhì)分裂開始時，大量肌動蛋白和肌球蛋白在中間體 處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細(xì)胞，稱為 收縮環(huán)（contractile ring)。收縮環(huán)收縮、收縮環(huán) 處細(xì)胞膜融合并形成兩個子細(xì)胞。 有絲分裂有絲分裂(mitosis)(mitosis) 各期主要變化各期主要變化 與有絲分裂有關(guān)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 1. 中心體中心體(centrosome)：在G1期末開始復(fù)制，在S期形成 1對，但二者不分開，

11、到G2期一對中心體開始分離， 各自向細(xì)胞兩極移動，最后每個子細(xì)胞各獲得1個中心 體。 2. 動粒與著絲粒動粒與著絲粒(centromere)：動粒是蛋白復(fù)合物，其分 子構(gòu)成包括CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-E等。 其中CENP-A是一種組蛋白H3類的蛋白質(zhì)，位于動粒 的內(nèi)層；人類著絲粒DNA由特殊的序列重復(fù)排列構(gòu)成， 長幾千個kb，深入動粒內(nèi)層，成為內(nèi)層組成部分. Caffeine可使動粒與染色體脫離。 3. 紡錘體：微管分為3種，即星微管，動粒微管和極微管。 中心體的分離需要2種馬達(dá)蛋白，即驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白 （Kinesin-related proteins,KR

12、Ps，向微管負(fù)極運動)和細(xì) 胞質(zhì)動力蛋白（dynein, 向微管正極運動)。 二、減數(shù)分裂二、減數(shù)分裂(Meiosis) 減數(shù)分裂概念與過程： 減數(shù)分裂的意義 減數(shù)分裂特點 減數(shù)分裂概念與過程 概念：減數(shù)分裂是細(xì)胞僅進(jìn)行一次DNA復(fù)制，隨 后進(jìn)行兩次分裂，染色體數(shù)目減半的一種特殊的 有絲分裂 分為前減數(shù)分裂間期和減數(shù)分裂期。 減 數(shù) 分 裂 前 S 期 有 絲 分 裂 前 S 期 蠑螈 10天 12小時 小鼠 14小時 56小時 小麥 12小時 3.8小時 酵母 1.0小時 0.5小時 減數(shù)分裂前S期與有絲分裂前S期長度比較 前減數(shù)分裂間期 S期持續(xù)時間長 減數(shù)分裂過程 減數(shù)分裂 前期前期 ，

13、前中期 ，中期 ，后期 ，末 期 和胞質(zhì)分裂 減數(shù)分裂 前期 ，中期 ，后期 ，末期 ，和胞 質(zhì)分裂 減數(shù)分裂過程 Visible evidence of crossing over 同源染色體配對排列在中期板上 減數(shù)分裂特點 遺傳物質(zhì)只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次， 導(dǎo)致染色體數(shù)目減半 S期持續(xù)時間較長 同源染色體在減數(shù)分裂期I(MeiosisI)配對聯(lián)會、基 因重組，形成聯(lián)會復(fù)合體，同源染色體間遺傳物質(zhì) 重組,產(chǎn)生新的基因組合。 減數(shù)分裂同源染色體配對排列在中期板上,第一次 分裂時,同源染色體分開。 減數(shù)分裂的意義 獲得父母雙方的遺傳物質(zhì)，確保世代間 遺傳的穩(wěn)定性。 增加變異機(jī)會，確保生物的

14、多樣性，增 強生物適應(yīng)環(huán)境變化的能力。 減數(shù)分裂是生物有性生殖的基礎(chǔ)，是生 物遺傳、生物進(jìn)化和生物多樣性的重要基礎(chǔ)保 證。 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞周期的調(diào)控細(xì)胞周期的調(diào)控(Cell-Cycle Control) 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的發(fā)現(xiàn) 細(xì)胞周期的調(diào)控 細(xì)胞周期的檢驗點（check point） MPF (Maturation-promoting factor， Mitosis-promoting factor)的發(fā)現(xiàn)及其生化實質(zhì) 1971 年，Masui 和Markert在用非洲爪蟾卵子非洲爪蟾卵子的實驗中提出 MPF的概念。 1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和

15、45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進(jìn)一 步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=cdc2(CDK1)+clyclin B MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶； 由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependent protein kinase) 形成的復(fù)合物。MPF=CDK1/p34/cdc2+cyclinB Hartwell 1960s, Nurse 1970s 分別以芽殖酵母和裂 殖酵母為材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多 與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle, cdc)。如： 裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無 法分裂； cdc2

16、和cdc28都編碼34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn) 行。 酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc (cell division cycle) T. Hunt 1980s發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的 含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為cyclin A和B，在細(xì)胞 間期內(nèi)積累，在細(xì)胞分裂期消失。 周期蛋白廣泛存在于從酵母到人類的各種真核生 物中。 海膽中發(fā)現(xiàn)的周期蛋白（cyclin) 細(xì)胞周期蛋白cyclin 特點特點： 1. 在細(xì)胞周期中蛋白含量呈周期性變化。 2. 含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框 （cyclin box），介導(dǎo)與CDK結(jié)合。有特異性：不同的 cyclin 結(jié)合并激活不同的CDK。

17、 3. M期周期蛋白有破壞框（destruction box)，位于蛋白質(zhì) 進(jìn)N末端，參與由泛素介導(dǎo)的蛋白降解。 分為4類：G1型（cyc D) 、G1/S型（cyc E)、S型（cyc A) 、 M型（cyc B) 。 作用：激活和引導(dǎo)不同的CDK作用于不同底物 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 cyclin-dependent kinase, CDK cdc2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故稱為CDK。 Cdc2是第1個發(fā)現(xiàn)的CDK，又稱CDK1，可將特定蛋白磷酸化， 如： 將核纖肽磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失； 將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10余種CDK，在CDK激酶結(jié)構(gòu)

18、域中均含PSTAIRE保 守序列，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。 Cyclin 與CDK 的結(jié)合是CDK激活的必要條件，不是充分條件。 CDK1 蛋白在細(xì)胞周期中含量相對穩(wěn)定，而cyclin B 的含量呈周期性變化。 Cyclin-Cdk復(fù)合物的多樣性 G1 S G2/M Cyclin-Cdk Cyclin-Cdk Cyclin-Cdk Budding Yeast CLN1,2,3-CDC28 CLB5,(3,4)-CDC28 CLB1,2(3,4)-CDC28 Fission Yeast CIG1-CDC2 CIG2-CDC2 CIG13-CDC2 Higher Eukaryotes CyclinD

19、1,2,3-CDK4/6 CyclinA-CDK2 CyclinB-CDK1/CDC2 CyclinE1,2-CDK2 G1 Substrates S Substrates G2/M Substrates Growth and Morphogenesis DNA ReplicationMitosis CDK抑制因子 （CDK inhibitors, CDKIs) CDKI對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為2大家族： INK4家族: 包括p16,p18,p19等。 p16抑制cdk4 和 cdk6。 Cip/Kip家族：包括p21Cip/WAF1，p27Kip1和p57Kip2等。其 中p21Cip/

20、WAF1抑制G1期CDK，如CDK2、3、4、6；還能與 DNA聚合酶的輔助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen)結(jié)合，直接抑制DNA的合成。 cyclin B 的含量呈周期性變化 周期性表達(dá)和降解 APC介導(dǎo)的靶蛋白（如M期周期蛋白）通過 泛素依賴性途徑降解 后期促進(jìn)復(fù)合物：APC（anaphase- promoting complex)，由至少15種成分組 成，即APC1-APC15。 在體外促進(jìn)周期蛋白A、B降解，表明分裂 中期向后期轉(zhuǎn)化也受到精密調(diào)控。 Cyclin A 和 B 通過泛素化 途徑（ubiquitination pathway

21、) 降解(M期周期蛋期周期蛋 白的破壞框起調(diào)節(jié)作用白的破壞框起調(diào)節(jié)作用） 1. 泛素與泛素激活酶E1結(jié)合 形成E1-泛素復(fù)合體。 2. E1-泛素復(fù)合體將泛素轉(zhuǎn)移 給泛素結(jié)合酶E2，形成E2- 泛素復(fù)合體。 3. 在泛素蛋白連接酶E3的催 化下，泛素分子連接到靶 蛋白上。 4. 形成多聚泛素鏈。 5. 泛素化的靶蛋白被蛋白質(zhì) 列解體（proteasome)逐步降 解。 G1期周期蛋白的降解 1. G1期周期蛋白包括cyclin D 和 cyclin E。 2. G1期周期蛋白不含破壞框，但含PEST序列。 3. PEST序列促進(jìn)G1期周期蛋白通過泛素化途徑降解。 4. 參與G1期周期蛋白泛素化

22、的E2和E3與泛素化M期 周期蛋白的E2、E3不同。 二、細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)調(diào)控 CDK激酶是細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)的引擎分子，對細(xì)胞 周期起核心性調(diào)控作用。 （一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的作用 1. Cyclin B 蛋白含量在G2期達(dá)到最大值，CDK1活 性開始出現(xiàn)，磷酸化下游蛋白質(zhì)。 2. CDK1 的激活還需要Wee1/Mik1和CAK催化的 CDK1的Thr14, Tyr15和Thr161 的磷酸化，及 Cdc25催化的Thr14, Tyr15的去磷酸化，才能表現(xiàn) 出激酶的活性。 （二）M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期的轉(zhuǎn)化 分裂中期后，cyclin A 和 cyclin B通過APC介導(dǎo)的泛

23、 素化途徑迅速降解，CDK1激酶活性喪失，被CDK1 磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化，細(xì)胞周期便從M期中期 向后期轉(zhuǎn)化。 （三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性 CDK激酶 1. Cyclin D 與CDK4，CDK6結(jié)合并激活CDK4/6活性。 2. Cyclin E 與CDK2結(jié)合并激活CDK2活性。 3. Rb（retinoblastoma protein)是G1/S轉(zhuǎn)化的抑制因子， 在G1晚期通過磷酸化而失活。 4. Rb與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄因子活性。 5. E2F激活DNA合成所需蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞 周期進(jìn)入S期所必需。 6. CDK2/4/6均磷酸化Rb，從而釋放E2F，使E2F發(fā)揮 作用。 7. G1期的周期蛋白通過泛素化途徑降解。 p16抑制cdk4 和 cdk6 p21抑制cdk2, 4 和 6 三、細(xì)胞周期檢驗點（check point） 主要檢驗點： G1/S檢驗點：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì) 胞體積是否足夠大？在酵母中稱start點，在哺乳動物中 稱R點(restriction point)。 S期檢驗點：DNA復(fù)制是否完成？ G2/M檢驗點：DNA是否損傷？ 中-后期檢驗點：紡錘體組裝檢驗點。 FOUR CHECKPOINTS DNA 損傷 ATM/ATR 磷酸化 p53磷酸化，減少降解 p53蛋白量增加