實時熒光定量PCR實驗結(jié)果分析

1、鄧椋爻 技術(shù)支持 廣州市昊洋貿(mào)易有限公司 u定量分析 絕對定量 相對定量 u定性分析 SNP分析，基因掃描 陰陽性判定 熔解曲線分析 絕對定量：How Many 優(yōu)點：給出目標基因初始模板 的絕對數(shù)量，數(shù)據(jù)容易處理 缺點：必須有標準品，做標準 曲線 應用：病毒拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)基因的 拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)基因成分百分含量檢 測 相對定量:How Much 優(yōu)點：需要/不需要標準品； 使用廣泛 缺點：數(shù)據(jù)理解困難 應用：差異表達分析；芯片評 估 14500 copies 108106102104 108106102104 T 108106102104 T 10105 5 copies/well copies/we

2、ll 1/3 Blank 1/31/31/3 1.11 ng/2ul 0.37 ng/2ul 0.12 ng/2ul10.0 ng/2ul 3.33 ng/2ul T Control CT = 21.3 Sample A CT = 22.8 Sample B CT = 19.3 Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1 Sample A CT = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33 Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4 Fold 管家基因校準(Normalization Gene) 得出每個細胞中的目的基因 目標基因v

3、s. 管家基因 對照樣品校準(Calibrator Sample) 得出相對于某個樣品的基因表達量, 1X sample. 處理的vs. 未處理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常. 目標基因 管家基因 處理后 處理前 ERBB2 GAPDH Sample Calibrato r 按比例稀釋標準品，根據(jù)標準曲線確定樣本初始模板濃度 至少需要兩個標準曲線 GOI reference gene 標準曲線確定反應擴增效率 依據(jù)：平均相對含量% = 2 平均CT 數(shù)據(jù)處理： C（t）GOI- C（t）ref= C（t） C（t）sample- C（t）calibrator= C（t） 好處

4、：不做標準曲線 應用范圍：擴增效率較高，目標基因和內(nèi)標基因擴增效率一 致并且相互獨立擴增；不做標準曲線，高通量檢測（芯片評估） ；不要求很高的精度 RNA提取 RT-qPCR實驗 結(jié)果分析 RNA定量 反轉(zhuǎn)錄(RT) 設計qPCR實驗方法 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit 已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達異常， 因此可以作為一個檢測標準 選用GAPDH作為內(nèi)標基因 FAM標記的ERBB2探針 VIC標記的GAPDH探針 標準品（質(zhì)粒）構(gòu)造標準曲線 多重PCR反應 陰性對照 無RNA對照（空白） 無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（監(jiān)控基因組污

5、染） Experion RNA StdSens Chip 5-500 ng/ml 100-6,000 nt Experion RNA HighSens Chip 0.1-5 ng/ml 100-6,000 nt 乳癌組織 RNA 正常乳腺組織 RNA 5 hr. at 90CIntactIntact 7 hr. at 90C Intact 7 hr. degradati on GAPDH gene Intact 5 hr. degradation 在不同的反應管中運行RT & PCR 1. 反轉(zhuǎn)錄反應 加熱滅活反轉(zhuǎn)酶 2. PCR 反應 2. PCR 反應 1.反轉(zhuǎn)錄反應 25C 5 min

6、42C 30 min 85C 5 min 冷卻至4C iScript cDNA Synthesis Kit 定性條件摸索 熒光化學物質(zhì) SYBR GREEN染料 Taqman探針 定量PCR條件優(yōu)化 單雙通道相互驗證 qFam標記目標基因探針 qVIC標記看家基因探針 動態(tài)溫度梯度動態(tài)溫度梯度 5-6oC Below 10oC Above 預設退火溫度預設退火溫度 Real annealing range 95C,15min 94C,15sec 60C,1min plate read go to step 3,39 more times 10C,forever End 目標基因： 未知樣品 生

7、成標準曲線： 標準品梯度 監(jiān)控系統(tǒng)故障： 陽性對照 監(jiān)控污染： 陰性對照/基因組對照 校準生物學誤差：看家基因 降低其余誤差： 重復實驗 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 FAM detection for ERBB2 ERBB2單雙通道相互驗證的實驗結(jié)果 A.Multiplex Reactions Healthy RNACarcinoma 28.4826.42 28.6826.98 28.7826.98 28.65 0.1526.80 0.32 B.Singleplex reactions Healthy RNACarcinoma 28.67

8、27.09 28.7126.68 28.7326.70 28.70 0.0326.82 0.24 樣品擴增：正常vs腫瘤 PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH 腫瘤腫瘤 正常 Healthy RNA Tumor RNA GAPDH ERBB2 1095 1052 2130 2492 95500 85730 136000 130800 Copies ng/ l Total RNA ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.0197 Healthy RNA Tumor RNA 0.011 0.018 0.018/ 0.0111.63 Healthy Tissue Carc. Tissue Relative Expression 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 C(t)=4.41-5.18 =-0.770.18 2-c(t) =1.511.93 結(jié)果與雙標準曲線法相近結(jié)果與雙標準曲線法相近 Healthy RNA BBER2GAPDHC(t) 28.4023.275.