溫度和轉(zhuǎn)數(shù)對GMCSF表達(dá)量的影響

1、本科學(xué)生畢業(yè)論文論文題目：溫度和轉(zhuǎn)數(shù)對gm-csf表達(dá)量的影響學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院年 級：專 業(yè)：制藥工程姓 名：學(xué) 號：指導(dǎo)教師：摘要 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（gm-csf）主要是有體內(nèi)激活的t細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生。近年研究發(fā)現(xiàn)它是一種有廣泛免疫活性的效應(yīng)銀子，在激活免疫反應(yīng)中起重要作用，參與特異性抗體的產(chǎn)生。gm-csf主要促進粒細(xì)胞、局勢細(xì)胞的增殖、分化及功能成熟，提高宿主的防御能力，而且可以活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生依賴性細(xì)胞接到的細(xì)胞毒效應(yīng)（adcc）和多形性中性粒細(xì)胞（pmn）產(chǎn)生補體介導(dǎo)的吞噬作用，以及增強pmn的各種功能，還能提高c3bi及fcr受體的表達(dá)，本文是就溫度和轉(zhuǎn)數(shù)對

2、gm-csf表達(dá)量的影響作一綜述。關(guān)鍵詞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（gm-csf）；粒細(xì)胞；溫度；轉(zhuǎn)數(shù)；表達(dá)量abstract granulocyte macrophage colony-stimulating factor (gm-csf) is the main body of activated t cells, macrophages and other produce.recent studies indicate that it is a kind of extensive immunological activity effect of silver, in the activ

3、ation of the immune response plays a role in, participate in the generation of specific antibodies.gm-csf mainly promote granulocyte, the situation of cell proliferation,differentiation and functional maturation, improves host defense, and can activate macro- phages produce dependent cell receiving

4、cytotoxic effect (adcc) and poly -morphic neutrophils (pmn) produce complement mediated phagocytosis, and enhances pmn function, can improve the c3bi and fcr receptor express- ion,this paper is on the temperature and speed of gm-csf expression amount reviewed the effects of.key wordsgranulocyte macr

5、ophage colony-stimulating factor (gm-csf)；granulocytes；temperature；speed； amount of expressionii目錄摘要iabstractii前言11.1 gm-csf的國外研究進展11.1.1 gm-csf的名稱來源11.1.2 gm-csf在創(chuàng)面愈合方面的研究概況11.1.3 gm-csf在促進急性皮膚缺損創(chuàng)面和切口愈合方面的研究11.1.4 gm-csf在促進靜脈性及糖尿病性潰瘍愈合方面的研究21.1.5 cm-csf在壓力性和其他原因引起的慢性潰瘍愈合方面的研究21.1.6 gm-csf在促進放、化療相關(guān)創(chuàng)

6、面愈合方面的研究21.1.7 gm-csf在促進腫瘤治療相關(guān)的粘膜潰瘍的修復(fù)方面的研究31.1.8 gm-csf對促進愈合能力受損的腸吻合口愈合方面的研究31.1.9 gm-csf在促進感染創(chuàng)面愈合方面的研究31.2 國內(nèi)進展41.3 gm-csf的作用機制51.3.1 gm-csf的來源51.3.2 gm-csf的生物學(xué)特性51.3.3 gm-csf的結(jié)構(gòu)6 1.3.3.1 hgm-csf基因的結(jié)構(gòu)特點6 1.3.3.2 hgm-csf蛋白分子的結(jié)構(gòu)特點6 1.3.3.3 gm-csf的理化性質(zhì)71.3.4 gm-csf誘導(dǎo)自身免疫疾病的機制81.3.5 gm-csf的作用機制81.4 臨床

7、應(yīng)用91.4.1 gm-csf在不同創(chuàng)面治療的臨床應(yīng)用101.4.2 gm-csf在疫苗佐劑中的臨床應(yīng)用11 1.4.2.1 gm-csf在病毒性疫苗佐劑中的應(yīng)用12 1.4.2.2 gm-csf在腫瘤性疫苗佐劑中的應(yīng)用13 1.4.2.3 gm-csf在細(xì)胞疫苗佐劑中的應(yīng)用131.4.3 gm-csf在治療頭頸部腫瘤放射性黏膜炎的應(yīng)用141.5 gm-csf的研究內(nèi)容141.5.1 gm-csf對創(chuàng)面愈合的研究141.5.2 骨髓抑制化療141.5.3 gm-csf協(xié)同抗腫瘤作用151.5.4 gm-csf與慢性阻塞性肺疾?。╟opd）的相關(guān)性151.5.5 hgm-csf基因的表達(dá)及其調(diào)控

8、15第二章 材料與方法162.1 材料162.1.1 菌種162.1.2 培養(yǎng)基162.1.3 藥品及試劑162.1.4 儀器及器皿172.2 實驗方法172.2.1 配制培養(yǎng)基172.2.2 菌種活化182.2.3 菌體在小搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)182.2.4 菌體在大搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)182.2.5 誘導(dǎo)處理182.2.6 不同轉(zhuǎn)數(shù)對蛋白表達(dá)量的影響192.2.7 電泳的工作液及操作步驟19第三章 結(jié)果和分析203.1 溫度對rhgm-csf表達(dá)量的影響203.2 轉(zhuǎn)數(shù)對rhgm-csf表達(dá)量的影響213.3 分析21結(jié)論22參考文獻23致謝28 溫度和轉(zhuǎn)數(shù)對gm-csf表達(dá)量的影響前言1.1gm

9、-csf的國外研究進展 1.1.1 gm-csf的名稱來源 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte/macrophagecolony-stimulatingfactor,gm-csf)是近幾十年來醫(yī)學(xué)研究的一種熱門細(xì)胞因子。1977年，它由burgess等在鼠的肺條件培養(yǎng)液中首次發(fā)現(xiàn)，因能刺激造血前體細(xì)胞形成粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落，故而得名1。 1.1.2 gm-csf在創(chuàng)面愈合方面的研究概況1985年，首次克隆表達(dá)了人類gm-csf基因（human gm-csf,hgm-csf),此后重組人gm-csf(recombinant human gm-csf,rhgm-csf)逐漸應(yīng)用

10、于臨床。1989年,意大利學(xué)者gianni對惡性腫瘤患者進行了自體造血干細(xì)胞移植時，意外發(fā)現(xiàn)rhgm-csf能夠很好地防治嚴(yán)重口腔黏膜炎，并推測其與創(chuàng)面愈合有關(guān)2。從此人們開始將gm-csf作為促進創(chuàng)面愈合的主要細(xì)胞因子試用于臨床，以期解決創(chuàng)面難愈問題。1993年，首篇局部注射rhgm-csf促進慢性創(chuàng)面愈合的報道發(fā)表3。隨后的研究表明，gm-csf可被一系列參與創(chuàng)面修復(fù)過程的細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞、活化的t細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)合成分泌物體4-5;且gm-csf可增強多種創(chuàng)面愈合必需的細(xì)胞的功能，如活化單核/巨噬細(xì)胞功能、促進上皮細(xì)胞遷移、中性粒細(xì)胞、增殖、調(diào)節(jié)成纖

11、維細(xì)胞表型等6，更激起了人們將其用于促進創(chuàng)面愈合的興趣。 1.1.3 gm-csf在促進急性皮膚缺損創(chuàng)面和切口愈合方面的研究1992年，kaplan等首次把gm-csf引入急性皮膚創(chuàng)面治療，最早證實了gm-csf可以促進急性皮膚缺損創(chuàng)面愈合，并證實創(chuàng)周注射rhgm-csf可促進麻風(fēng)患者活檢創(chuàng)面的愈合3。在體內(nèi)，給麻風(fēng)患者的麻風(fēng)結(jié)節(jié)周圍注射gm-csf后，在注射部位以及臨近的部位取組織活檢，因而觀察到注射gm-csf外止血會更快，并且上皮厚度增加，角質(zhì)細(xì)胞的層數(shù)、數(shù)目、體積均增加，并聚集朗罕細(xì)胞至真皮層，加快創(chuàng)面的愈合。局部滴注還可促進雷諾病患截趾創(chuàng)面的愈合5。在體外，他們發(fā)現(xiàn)gm-csf是誘導(dǎo)

12、朗罕細(xì)胞分裂增殖的主要因子,可以刺激角質(zhì)細(xì)胞生長。同時，動物實驗也證實了gm-csf能夠促進急性皮膚切口的修復(fù)。jyung等人對單核細(xì)胞耗竭所導(dǎo)致的創(chuàng)面愈合能力受損的大鼠創(chuàng)造皮膚的切口，而發(fā)現(xiàn)了局部應(yīng)用gm-csf可以活化巨噬細(xì)胞，并增加切口擴張力的強度，促進其愈合。 1.1.4 gm-csf在促進靜脈性及糖尿病性潰瘍愈合方面的研究 1994年，dacosta等首次將rhgm-csf應(yīng)用于慢性下肢潰瘍的老年人，潰瘍周圍皮下注射rhgm-csf并使其痊愈。之后又進行了隨機、雙盲、安慰劑平行對照的臨床研究，1999年，他們擴大了研究對象，進一步驗證了rhgm-csf能夠促進慢性靜脈性潰瘍的愈合，且

13、不受潰瘍存在時間的影響6。jaschke等7對慢性靜脈性潰瘍患者的創(chuàng)面局部噴灑rhgm-csf也得出類似結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)其可明顯提高創(chuàng)面愈合率，并減少復(fù)發(fā)，縮短創(chuàng)面愈合時間，平均愈合時間為19周，且無明顯的毒副作用。創(chuàng)面均勻滴用rhgm-csf也會使糖尿病脂性漸進性壞死患者小腿慢性潰瘍愈合局部，而且持續(xù)3年以上無復(fù)發(fā)。注射rhgm-csf還能促進糖尿病患者足部慢性神經(jīng)性潰瘍的愈合8. 1.1.5 cm-csf在壓力性和其他原因引起慢性潰瘍愈合方面的研究1997年，一項臨床研究表明對壓力性潰瘍局部連續(xù)噴灑rhgm-csf,可以使?jié)兊捏w積明顯地減少，利于愈合。 eisaghir等9首次報道，在潰瘍周

14、圍及底部注射rhgm-csf能夠成功使壓力性潰瘍愈合，并發(fā)現(xiàn)潰瘍是從注射部位開始愈合的，隨診9個月無復(fù)發(fā)。局部應(yīng)用gm-csf還可以促進其它原因引起的慢性潰瘍愈合，如可促進鐮刀性貧血9及中性粒細(xì)胞功能不良患者10下肢慢性潰瘍的愈合。促進hiv感染者退步慢性潰瘍、多發(fā)性動脈炎、血紅蛋白病、kippel-trnaunay-weber綜合征相關(guān)性潰瘍等創(chuàng)面的愈合。 1.1.6 gm-csf在促進放、化療相關(guān)創(chuàng)面愈合方面的研究gulcelik等11實驗，給大鼠靜脈注射阿霉素14天以后，進行剖腹術(shù)，同時給創(chuàng)周多點注射gm-csf或是生理鹽水，觀察切口愈合的情況。結(jié)果表明，局部注射gm-csf可以增加切口

15、羥脯氨酸的含量及其抗張力強度，從而促進了因阿霉素抑制創(chuàng)面愈合的副作用和髓系抑制相關(guān)，可以抑制單核細(xì)胞與血小板的功能，阻礙其愈合。而皮內(nèi)應(yīng)用gm-csf可以增加皮膚角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加no的濃度，火花成纖維細(xì)胞并刺激膠原的合成，這些因素單獨或者聯(lián)合作用，可以促進受損的切割傷愈合12。ergn等13認(rèn)為在因系統(tǒng)性疾病或者藥物引起的愈合受損以及需要皮片重建時，給予gm-csf可以加速創(chuàng)面的愈合并降低其致殘率。另外有類似的報道稱，局部應(yīng)用gm-csf可以活化巨噬細(xì)胞，增加抗張力的強度，促進由于甲基強的松龍導(dǎo)致創(chuàng)面難以治愈的大鼠皮膚切口的愈合3。放療會導(dǎo)致手術(shù)的切口愈合受損并且產(chǎn)

16、生氧化物而造成細(xì)胞損傷，但放療后制造皮膚切口，且局部注射gm-csf可以使放療引起的手術(shù)切口脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象顯著降低，促進其愈合。 1.1.7 gm-csf在促進腫瘤治療相關(guān)的粘膜潰瘍的修復(fù)方面的研究masucci等14 在黏膜炎的評分大于（等于）1.5時，給皮下注射gm-csf可以明顯的促進因放療所大致的嚴(yán)重口部、咽部黏膜炎的恢復(fù)。koc等15認(rèn)為放療性食管炎是胸部、頭頸惡性腫瘤放療時最重要的副反應(yīng)，常常會迫使放療中斷數(shù)天。michael等采用rhgm-csf口服治療了36例度放射性食管炎，結(jié)果顯示有85%的患者明顯改善了其吞咽困難的癥狀。同時發(fā)現(xiàn)了被損傷的上皮祖師有血管的形成以及血管內(nèi)皮生長

17、因子的過度表達(dá)，因而他認(rèn)為，rhgm-csf可能增強了受損的組織血管生成因子的釋放或者直接的血管生成活性16，從而增強了局部治療放射性食管炎的療效很顯著。 1.1.8 gm-csf對促進愈合能力受損的腸吻合口愈合方面的研究cetinkaya等17報道，創(chuàng)周注射gm-csf可以對抗因撕裂霉素-c腹腔內(nèi)化療導(dǎo)致的愈合受損，通過增加切口的羥脯氨酸含量和抗張力強度，促使大鼠腸吻合口正常的愈合。局部給予rhgm-csf可以糾正術(shù)后早期應(yīng)用5-氟尿嘧啶腹腔內(nèi)化療所導(dǎo)致的大鼠巨噬細(xì)胞活性降低，促進其受損的吻合口愈合18，并可促進長期應(yīng)用皮質(zhì)類固醇引起的難以愈合的腸吻合口的愈合19。根據(jù)以上敘述可知，局部應(yīng)用

18、gm-csf可以促進多種不同的原因所導(dǎo)致的愈合能力受到損傷的黏膜的修復(fù)。 1.1.9 gm-csf在促進感染創(chuàng)面愈合方面的研究 robson等20率先進行了gm-csf對感染創(chuàng)面應(yīng)用方面的研究。他們制造了sd大鼠的創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)了單（多）次局部外用的gm-csf都能夠減少創(chuàng)面的細(xì)菌數(shù)量，并逆轉(zhuǎn)感染對創(chuàng)面收縮的抑制作用，促進急、慢性細(xì)菌感染的皮膚創(chuàng)面的愈合情況。makik等21報道了29個不同病因（創(chuàng)傷后、血管性、糖尿病等）引起的病程大于3個月以及標(biāo)準(zhǔn)個治療無效的慢性創(chuàng)傷，在創(chuàng)周單次皮下注射gm-csf 10微克/厘米2，注射6周后，其中有9例痊愈，11例創(chuàng)面的縮小范圍超過了原來的50%，7例有

19、所改善。1999年，da costa等22發(fā)現(xiàn)了慢性靜脈性潰瘍的rhgm-csf治療組中，在24個細(xì)菌培養(yǎng)陽性的潰瘍中有11個已經(jīng)愈合，而對照組則是無一例細(xì)菌培養(yǎng)陽性的潰瘍愈合。因此，創(chuàng)面對gm-csf的反應(yīng)和它是否感染無關(guān)，rhgm-csf對于感染創(chuàng)面也是有治療作用的。 1.2 國內(nèi)進展 gm-csf已成功應(yīng)用于多個臨床領(lǐng)域，如改善放化療、增強疫苗的免疫原性，嚴(yán)重感染等原因?qū)е碌墓撬枰种?，促進創(chuàng)面愈合等,是近幾十年來醫(yī)學(xué)研究的一種熱門細(xì)胞因子。在國內(nèi)，近幾年主要研究其在燒傷創(chuàng)面的臨床應(yīng)用。國內(nèi)學(xué)者研究報道開始于2008年以后，局限于深度早期創(chuàng)面的應(yīng)用，國內(nèi)生物制藥企業(yè)率先生產(chǎn)了全球第1支rh

20、gm-csf凝膠，并于2008年被我國sf-da批準(zhǔn)上市，取得了良好的療效，并具有較好的安全性。國外學(xué)者則未見同類研究報道。國內(nèi)外無論何種劑型的rhgm-csf，均沒有應(yīng)用于燒傷后殘余創(chuàng)面的報道。而燒傷后殘余創(chuàng)面不同于燒傷后早期創(chuàng)面，有著特殊的形成原因和發(fā)生機制，本質(zhì)上屬于難愈性慢性創(chuàng)面，因此rhgm-csf治療燒傷后殘余創(chuàng)面是否也可以取得良好的療效，需要通過臨床試驗進行證實。王志勇等23研究人員，應(yīng)用rhgm-csf治療深度燒傷創(chuàng)面，結(jié)果也顯示出有明顯的促進創(chuàng)面愈合的作用，并具有一定安全性。劉波等24人，應(yīng)用不同劑量的rhgm-csf凝膠促進大鼠深度燒傷創(chuàng)面的愈合進行了一定的實驗研究，結(jié)其果

21、顯示rhgm-csf凝膠能夠促進痂皮形成和脫落、促進毛囊再生、加快上皮生長，加快燒傷創(chuàng)面修復(fù)的速度并且還能夠改善修復(fù)質(zhì)量。陳炯等25人，收集多中心研究中的其中的兩個單位的資料，并以深度燒傷患者作為試驗對象，采用多中心隨機雙盲對照試驗的方法進行試驗。其中試驗 組60例100cm2創(chuàng)面使用100微克的rhgm-csf凝膠劑，對照組30例則是使用基質(zhì)安慰劑，觀察其創(chuàng)面愈合情況。實驗結(jié)果顯示，rhgm-csf凝膠劑可以促進燒傷患者深度創(chuàng)面愈合，而且對于100cm2 的創(chuàng)面使用是相當(dāng)安全的。 國內(nèi)外局部應(yīng)用rhgm-csf，使用的藥物劑型為注射劑或溶液，凝膠劑型則是目前國內(nèi)外的最新劑型只可檢索到其促進深

22、h度燒傷早期創(chuàng)面愈合的報道(國內(nèi)生物制藥企業(yè)率先生產(chǎn)了全球第一支rhgm-csf凝膠，并于200826年被我國sfda批準(zhǔn)上市)。多采用創(chuàng)周注射、局部噴灑、局部濕敷等方法，好的劑型如凝膠劑有助于維護創(chuàng)面愈合濕潤的微環(huán)境，促進上皮及其它細(xì)胞的遷移，促進創(chuàng)面愈合，故局部外用藥物劑型的選擇很重要。良好劑型的rhgm-csf應(yīng)該具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題擬采用隨機、雙盲、安慰劑同體對照研究方法，觀察并評價局部應(yīng)用rhgm-csf凝膠治療燒傷后殘余創(chuàng)面的臨床效果，并進行作用機制的初步研究，以期為治療燒傷后殘余創(chuàng)面提供新的治療藥物，并為新藥開發(fā)進一步提供實驗依據(jù)。 1.3 gm-csf的作用機制 1.3.

23、1 gm-csf的來源 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colony stimulating factor,gm-csf)是一種多功能的造血生長因子之一, 具有誘導(dǎo)未成熟的骨髓細(xì)胞前體細(xì)胞增殖和成熟等功能。它由t細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、b細(xì)胞核巨噬細(xì)胞等分泌，并且可以通過自分泌和旁分泌方式作用于這些細(xì)胞,影響其趨化、增殖和成熟。在正常情況下,血液中的gm-csf的量是難以檢測的,但在脂多糖（lps）等刺激下,濃度可顯著升高。創(chuàng)面上的gm-csf來源于炎癥反應(yīng)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)及角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等,其中角

24、質(zhì)細(xì)胞是產(chǎn)生gm-csf的主要細(xì)胞。 1.3.2 gm-csf的生物學(xué)特性 gm-csf是相對分子質(zhì)量 介于15000-35000的一種多功能細(xì)胞因子。人gm-csf（hgm-csf）的基因全場約為25kh，其中含有4個外顯子以及3個內(nèi)含子，在恒氨酸的水平和鼠類特有70%的同源性。gm-csf的開放閱讀框全場為432bp，共編碼144個氨基酸，hgm-csf的初產(chǎn)物是一個由144個氨基酸構(gòu)成的多肽片段，在從其氨基酸末端切除一個17個氨基酸片段后，由127個氨基組合成的多肽蛋白便為其成熟的gm-csf27。它有3個o-糖基化位點和2個n-糖基化位點，具有4個半胱氨酸構(gòu)成的2個二硫化鍵，9條分子量

25、從14.5-32kd不等的蛋白質(zhì)組成，糖基化程度上的差別造成了分子量的不同。 gm-csf屬于糖蛋白因子家族中的一員, 也是一個具有多項潛能的造血生長因子。作為一種特殊的生長因子，gm-csf不僅能夠刺激造血祖細(xì)胞的增殖形成粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞。在體外，它還可以對骨髓細(xì)胞，單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的增殖產(chǎn)生刺激，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中占有很重要的地位；gm-csf能延長嗜酸性細(xì)胞的存貨，使其產(chǎn)生細(xì)胞毒性殺死病原體等28；并且能夠增強嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌、聚集等功能；具有增多嗜酸粒細(xì)胞、降低血清中的膽固醇等的作用29，也能夠通過提高免疫細(xì)胞的吞噬活性來殺

26、滅病原體，刺激嗜酸性粒細(xì)胞的功能,提高nk細(xì)胞的活動能力,以及誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生ifn-,il-12和il-15；gm-csf也會參與炎癥反應(yīng)的形成27，并且具有免疫調(diào)節(jié)的特性；gm-csf在免疫反應(yīng)中能促進體液免疫及細(xì)胞免疫的建立,因此,目前它作為dna疫苗免疫佐劑已被大量應(yīng)用；gm-csf也參與動員骨髓細(xì)胞釋放,并參與免疫炎癥反應(yīng)和損傷組織器官修復(fù)的進行。另外,gm-csf可作為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化因子,調(diào)節(jié)其分化、增殖,并活化其功能。同時，gm-csf是一種安全佐劑，作為佐劑對身體是沒有毒害作用的。 1.3.3 gm-csf的結(jié)構(gòu) 下面以人gm-csf（hgm-csf）為例子介紹其結(jié)

27、構(gòu)特點： 1.3.3.1 hgm-csf基因的結(jié)構(gòu)特點hgm-csf基因長度約2.5kb,含有4個外顯子(分別編碼14,42，35和53個氨基酸)和3個內(nèi)含子，為單基因編碼，位于第5號染色體長臂的il-3基因的下游。gm-csf的mrna中含有17個氨基酸信號肽，mrna為長0.7kb編碼144個氨基酸的前體蛋白(16.3kda)。hgm-csfmrna的3端的非編碼區(qū)內(nèi)有與加速mrna的降解相關(guān)的8個串聯(lián)的auuua結(jié)構(gòu)。hgm-csf在5端的翻譯區(qū)域有可能控制著mrna的降解的最保守的核苷酸序列30。圖1-1是hgm-csf基因編碼序列31。 圖1-1 hgm-csf 1.3.3.2 hg

28、m-csf蛋白分子的結(jié)構(gòu)特點從圖1-1中可看出hgm-csf具有2個n-糖基化部位，即28-30(asn-leu-ser)和38-40(asn-glu-thr)和3個o-糖基化部位,由127個氨基酸殘基組成的一種糖蛋白分子,含4個半胱氨酸并可組成2個二硫鍵。天然的hgm-csf的相對分子量因為糖基化程度的不同而介于14.5-32kd30而真核細(xì)胞表達(dá)時相對分子量一般為22kd，糖基化程度高的則比活性反而是降低。hgm-csf的分子整體呈非球形，由4個反向平行的a-螺旋和2個反向平行的-折疊組成。另由2個二硫鍵分別與-折疊和螺旋b的第二條鏈、螺旋c和羧基末端連接,43-54位殘基形成的環(huán)穿過羧基

29、末端二硫鍵而形成的環(huán),形成了罕見的“穿線”拓?fù)鋵W(xué)。圖1-2是hgm-csf的蛋白立體結(jié)構(gòu)。 圖1-2 hgm-csf的蛋白分子結(jié)構(gòu)示意圖通過對hgm-csf的功能與其一級結(jié)構(gòu)之間相互關(guān)系的研究表明,缺失n末端前13個氨基酸與c末端的第122-127位的6個氨基酸對其造血的活性并無影響。97-121位氨基酸之間的結(jié)構(gòu)在維持hgm-csf的造血活性方面是必要的,而第16-18位氨基酸的殘基對保持gm-csf的生物學(xué)活性是至關(guān)重要的30。 1.3.3.3 gm-csf的理化性質(zhì)編碼人類gm-csf的基因位于5號染色體5q21-5q32。鼠和hgm-csf通過與靶細(xì)胞膜上的受體(hgm-csf rec

30、eptor,hgm-csfr)結(jié)合,發(fā)揮其多種生理作用。人和小鼠gm-csf受體均由、兩條鏈組成32,而其中鏈?zhǔn)沁B接亞單位,負(fù)責(zé)和配體部分的結(jié)合,而鏈主要和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),其細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)是多種信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵。單獨鏈與配體的結(jié)合為低親合力,鏈單獨是不結(jié)合配體的,但與鏈共同組成了一種高親和力受體,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起了主要作用。gm-csf它對骨髓中的造血祖細(xì)胞有顯著性影響，從而對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生各種效應(yīng)；增強樹突狀細(xì)胞成熟和遷移；引起在疫苗注射部位產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；能誘導(dǎo)mhc分子抗原在巨噬細(xì)胞表面表達(dá)。gm-csf通過促進dc的聚集與存活，從而誘導(dǎo)對病原體的防護免疫應(yīng)答并能夠間接協(xié)助免疫系統(tǒng)對腸道病原體

31、的有效清除達(dá)到增強和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。gm-csf作為佐劑，能增強疫苗的免疫原性。由于dna疫苗所誘發(fā)的免疫應(yīng)答效果的局限性，在dna疫苗的免疫策略中，gm-csf作為佐劑能夠顯著增強dna疫苗的免疫應(yīng)答。gm-csf已作為佐劑在各種疫苗中與抗原共同參與免疫反應(yīng)，并對免疫應(yīng)答的增強起積極作用。當(dāng)然gm-csf作為佐劑應(yīng)用時，也受到劑量、免疫方式和其他細(xì)胞因子的影響。rhgm-csf在臨床上已經(jīng)被用于骨髓抑制患者(腫瘤放療、造血干細(xì)胞移植后等)促進骨髓細(xì)胞恢復(fù)；gm-csf在整個免疫調(diào)控網(wǎng)路中發(fā)揮了重要作用，gm-csf能活化apc并促進其捕獲外來抗原以及對它進行加工處理。 1.3.4 gm-

32、csf誘導(dǎo)自身免疫疾病的機制 gm-csf在自身免疫疾病中至關(guān)重要35。如圖1-3所示，由病原體相關(guān)分子模型（pamps）誘導(dǎo)dc的活化及成熟，并能夠促進細(xì)胞因子il-23、il-6和gm-csf的分泌。巨噬細(xì)胞與pamps相互接觸后就會產(chǎn)生gm-csf。gm-csf再進一步增強dc和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生il-23和il-6。il-6一方面增強th17和th1的存活能力，一方面與tgf-共同促進轉(zhuǎn)錄因子ror-t表達(dá)，并使th17進一步分化。th17是誘導(dǎo)自身免疫病的細(xì)胞，因此il-23在促進th17細(xì)胞維持或致病性方面發(fā)揮著很重要的作用。 實箭頭:表示刺激;虛箭頭:表示分泌（引自sonderegge

33、r等，jexp med，2008) 圖1-3 gm-csf介導(dǎo)的自身免疫病模型 1.3.5 gm-csf的作用機制 gm-csf對dc的成熟具有非常明顯的作用，是主要的dc活化因子。細(xì)胞表型分析顯示，當(dāng)gm-csf基因轉(zhuǎn)入到dc時，能夠刺激dc持續(xù)分泌gm-csf，轉(zhuǎn)染前dc、mhc類分子、cim0、cd80和cd86呈中度表達(dá)，而轉(zhuǎn)染后的dc細(xì)胞表型也會隨之發(fā)生相應(yīng)的改變，其中包括細(xì)胞呈細(xì)胞核大而深染，懸浮狀，細(xì)胞體積大而形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞形成樹突狀在形態(tài)上更加趨向成熟。轉(zhuǎn)染24 h后的dc，大部分細(xì)胞更加聚集，細(xì)胞表面呈現(xiàn)突起的狀態(tài)，呈現(xiàn)簇狀，細(xì)胞核分裂更加明顯，呈枝狀，形似于蟹足。同時mh

34、c 類分子、cd86和cd80表達(dá)明顯上調(diào)，cd40則呈現(xiàn)中度表達(dá)，更具有成熟dc表型的特征，抗原遞呈及活化t細(xì)胞的能力顯著增強，并顯示出其更強的刺激t細(xì)胞增殖的能力33。 gm-csf的免疫增強作用是通過提高apc的，特別是dc的抗原遞呈能力來實現(xiàn)的，gm-csf誘導(dǎo)apc到免疫反應(yīng)部位，促進抗原被apc捕獲。gm-csf與外源疫苗預(yù)先或者一起注入體內(nèi)作為免疫原，刺激并聚集dc，增強其捕獲、遞呈和加工抗原的能力；與此同時會誘導(dǎo)脾細(xì)胞分泌ifn-，并增強巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、nk細(xì)胞和tc細(xì)胞的活性；同時ifn-又繼續(xù)誘導(dǎo)mhc和類分子的表達(dá)，分布在巨噬細(xì)胞表面的mhc分子能夠促進巨噬細(xì)胞更有效地

35、遞呈抗原；活化的dc開始進一步趨向成熟并遷移，使其免疫調(diào)節(jié)能力加強，在疫苗注射的部位產(chǎn)生炎癥。綜上所述的一系列活動的結(jié)果便會導(dǎo)致靜止的t細(xì)胞和b細(xì)胞被激活，包括cd 4+t細(xì)胞的激活，并且使其分泌抗體的能力增強，同時也會增強cd8+t細(xì)胞的功能，從而誘導(dǎo)強烈的細(xì)胞免疫34。gm-csf能夠增加抗原呈遞細(xì)胞(apc)表面的mhc-類抗原和t細(xì)胞共刺激分子b7-2和b7-1的表達(dá),趨化apc在注射部位聚集和增強巨噬細(xì)胞等細(xì)胞因子的分泌,并且調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)?，F(xiàn)在認(rèn)為在t細(xì)胞和抗原作用的開始階段，樹突狀細(xì)胞(dc)是最重要的apc之一,有效的輔助t細(xì)胞對抗原的應(yīng)答，起到了決定性的作用,而gm-csf則能

36、夠增強巨噬細(xì)胞、dc、朗格漢斯(langerhans)細(xì)胞的生長和分化,增加dc細(xì)胞數(shù)量的同時增強dc的活力和功能。dc細(xì)胞本身作為一種良好的疫苗佐劑,在和抗原一起注射時能夠明顯的增強免疫反應(yīng)應(yīng)答36。disis等37對gm-csf在蛋白疫苗和多肽方面的佐劑作用進行了研究,表明將gm-csf皮內(nèi)或皮下注射后能夠明顯增加局部淋巴結(jié)內(nèi)表達(dá)mhc-類細(xì)胞的比例,皮內(nèi)注射是在4-5d達(dá)到高峰,皮下注射是在2d達(dá)到高峰。gm-csf增強抗體反應(yīng)的作用不僅是體現(xiàn)在先用gm-csf注射調(diào)理局部微環(huán)境后注射疫苗,在和疫苗同一時間使用時也很有效,顯示出其佐劑作用事有實際意義的。 1.4 臨床應(yīng)用目前，已經(jīng)有3種

37、不同的重組人生長調(diào)節(jié)因子：巨噬細(xì)胞集落刺激因子（m-csf)、粒細(xì)胞集落刺激因子（g-csf)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（gm-csf)獲得確證和分子克隆，并在世界各國獲準(zhǔn)用于臨床。這些生長因子能影響骨髓造血細(xì)胞的功能活性、存活、增殖和分化。gm-csf主要影響定型祖代中性白細(xì)胞的增殖，功能性刺激和分化作用。gm-csf的活性類似于g-csf，具有使前祖細(xì)胞群分化為單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞或粒細(xì)胞系的能力。m-csf主要影響單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖、功能增強和分化作用。g-csf和gm-csf均能刺激多潛能祖細(xì)胞核肝細(xì)胞從骨髓移行進入循環(huán)系統(tǒng)。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（gm-csf）主要是

38、由體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞等產(chǎn)生，是諸多造血因子中重要的一員。自90年代應(yīng)用于臨床以來，特別是腫瘤放療、化療所致的白細(xì)胞減少、骨髓移植、骨髓異常增生綜合征、再生障礙性貧血等治療取得了一定療效。近幾年發(fā)現(xiàn)gm-csf是一種具有廣泛免疫活性的效應(yīng)因子，在激活免疫繁重起著重要作用。gm-csf主要促進粒、巨噬細(xì)胞的增殖、分化及其功能的成熟，提高宿主的防御能力，而且可以回話巨噬細(xì)胞產(chǎn)生依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)（adcc)和多形性中性粒細(xì)胞（pmn）產(chǎn)生補體介導(dǎo)的吞噬作用，以及增強pmn的各種功能。gm-csf還能提高c3bi及fcr受體的表達(dá)，并且對放、化療所致的黏膜炎、真菌感染、病毒性肝炎、糖尿

39、病合并脂肪漸進性壞死的不愈性小腿潰瘍和肺泡蛋白沉積癥等也有很好的療效。 1.4.1 gm-csf在不同創(chuàng)面治療的臨床應(yīng)用 基本創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)病理生理過程可以分為:局部炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖分化及肉芽組織形成期(即增生期)和組織重建塑形期(塑形期)3個階段。其中炎癥反應(yīng)期，是指傷后開始至傷后第3天或第6天,增生期是在傷后第4-14天,塑形期是在傷后第8天至1年的時間,在各個階段彼此之間有區(qū)別卻又是相互重疊的。研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷刺激可以上調(diào)創(chuàng)面gm-csf的表達(dá), 作為一種有絲分裂劑和免疫增強劑38，gm-csf成為創(chuàng)面愈合過程中的啟動因子39,gm-csf能夠作用于創(chuàng)面愈合必經(jīng)的每一個階段而發(fā)揮其重

40、要作用,促進創(chuàng)面的愈合。目前，令臨床醫(yī)生感到困擾的問題之一便是慢性難愈性創(chuàng)面。慢性難愈性創(chuàng)面主要分四類:糖尿病性潰瘍、壓力性潰瘍、靜脈性潰瘍和缺血性潰瘍等。其中糖尿病創(chuàng)面及潰瘍是很具有代表性的難愈創(chuàng)面,也是目前醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題之一。gm-csf已經(jīng)被試用于對此類疾病的治療,效果也十分理想。糖尿病主要由于血管病變導(dǎo)致局部缺血、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的功能受損、成纖維細(xì)胞增殖能力降低、血管病變及內(nèi)皮細(xì)胞異常、易感染等,致使創(chuàng)面很難完全愈合40。局部注射gm-csf可促進糖尿病患者的足部慢性神經(jīng)性潰瘍愈合41;使糖尿病脂性漸進性壞死者的小腿慢性潰瘍進行愈合,可以均勻地在創(chuàng)面滴用gm-csf，并且能

41、夠持續(xù)3年以上不會復(fù)發(fā)42。因此一種極其有效地治療糖尿病患者伴發(fā)慢性遷延不愈創(chuàng)面的方法便是推出局部應(yīng)用gm-csf。國外曾經(jīng)有一系列應(yīng)用rhgm-csf促進靜脈性潰瘍愈合的報道。長期存在的下肢肢端靜脈性潰瘍是最為常見的一種慢性潰瘍,它會嚴(yán)重影響患者的正常日常生活,并加重社會負(fù)擔(dān),但是目前尚無理想療法。dacosta等43研究者，于1994年采取隨機雙盲對照試驗，實驗對象首次選取為60個慢性靜脈性潰瘍的病人，分別在其病變的周圍注射了安慰劑和濃度分別為200微克、400微克的gm-csf，將其分別在注射后的5、9、13周和6個月時再觀察創(chuàng)面，并且發(fā)現(xiàn)注射13周后，400微克組、200微克組、對照組

42、的潰瘍愈合率分別為61%、57%、19%。式樣還發(fā)現(xiàn)gm-csf注射組的晃著在愈合后的6個月內(nèi)均無復(fù)發(fā)現(xiàn)象;同時還有一些臨床報道，gm-csf可以治療壓力性潰瘍及缺血性潰瘍，對壓力性潰瘍局部連續(xù)噴灑rh-gm-csf,可使?jié)凅w積明顯減小,利于愈合,并且已取得了令人滿意的療效45-46。1997年elsaghir等研究者，首次報道在潰瘍周圍及底部注射rhgm-csf，并且成功地使壓力性潰瘍愈合,同時也發(fā)現(xiàn)潰瘍是從注射部位開始愈合的,隨診9個月也并無復(fù)發(fā)。wang等44在一部分為深度燒傷的病人的創(chuàng)面，運用了gm-csf凝膠進行涂抹，發(fā)現(xiàn)其創(chuàng)面愈合一般需要的時間對于對照組明顯要少，實驗得出結(jié)論為，

43、gm-csf凝膠能夠明顯加速深度燒傷創(chuàng)面的愈合，并且臨床運用的安全性也很好。daniela等人,使用了局部皮下注射gm-csf治療法，對由于不同病因?qū)е碌闹行粤＜?xì)胞功能障礙而引起的難愈性創(chuàng)面進行治療時,發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面在4周內(nèi)全部愈合，且局部應(yīng)用的副作用相對較小,而且也相應(yīng)的降低了治療費用;raderer等人，使用了相同的辦法來治療10例癌癥病人由于手術(shù)和褥瘡而產(chǎn)生的慢性創(chuàng)面,在治療的五天之后創(chuàng)面即發(fā)現(xiàn)有所好轉(zhuǎn),經(jīng)過一段時間治療后所有病人的創(chuàng)面都全部愈合,除了1例病人由于濃度過高(200ug/ml)局部有灼燒感外,其余病人(4ug/ml)均無副反應(yīng),并且局部應(yīng)用gm-csf還不會影響外周血細(xì)胞的數(shù)量。

44、 symonds等47人，聲明rhgm-csf對于預(yù)防及減輕藥物所引起的黏膜炎具有較好的療效，并且能夠縮短切割傷和燒傷的愈合時間。研究結(jié)果顯示，外用rhgm-csf可以顯著促進燒傷小鼠度創(chuàng)面和大鼠皮膚燙傷創(chuàng)面的愈合，并縮短創(chuàng)面愈合的時間，與此同時還可以降低度燒傷小鼠的感染率和死亡率48。有學(xué)者曾觀注意到，rhgm-csf與重組人生長激素（rhgf）兩者合用，其效果比單一使用一種更能促進大鼠深度燙傷創(chuàng)面的愈合49。深度燒傷的創(chuàng)面處理一直是臨床關(guān)注的重點，偏深的深度燒傷為深度燒傷，需要3周以上時間來愈合，或者通過植皮手術(shù)才能愈合，處理原則為早期手術(shù)50。偏淺的深度燒傷則為淺度燒傷，普遍的愈合時間為

45、15d-20d，處理的標(biāo)準(zhǔn)即為經(jīng)換藥后自行愈合。但部分燒傷患者會懼怕手術(shù)，尤其是中小面積的深度燒傷患者普遍不愿接受手術(shù)治療，給臨床醫(yī)師帶來了很多困難。目前，有通過全身使用濕性敷料、局部使用各種生長因子、生長激素等促進創(chuàng)面愈合的方法，并且也取得了一定的效果，但這種方法還是存在一定的缺點，譬如濕性敷料存在一定的感染風(fēng)險，各種生長因子對深度燒傷創(chuàng)面早期的效果并不理想，全身使用生長激素也不適合腫瘤和糖尿病的患者等。燒傷患者常伴有集落刺激活性的降低的癥狀，并導(dǎo)致感染概率增加。體內(nèi)外的臨床試驗結(jié)果表明，rhgm-csf能夠促進燒傷感染創(chuàng)面的愈合并且調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，增加機體的免疫能力以預(yù)防感染51，故而

46、，rhgm-csf的活性及數(shù)量在燒傷后免疫功能的改變中扮演著及其重要的角色。rhgm-csf局部外用于燒傷創(chuàng)面時能夠啟動創(chuàng)傷修復(fù)的連鎖反應(yīng)，調(diào)節(jié)在創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成熟的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖和活化。rhgm-csf還能夠吸誘導(dǎo)炎性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，阻止其從傷口處逃逸，誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞增殖和發(fā)育，使朗格罕細(xì)胞進入真皮，促進傷口的修復(fù)52。 1.4.2 gm-csf在疫苗佐劑中的臨床應(yīng)用 1.4.2.1 gm-csf在病毒性疫苗佐劑中的應(yīng)用作為一種傳統(tǒng)疫苗佐劑,gm-csf與疫苗一般會按照不同的比例及先后順序注入機體內(nèi)。其中,gm-csf在乙肝疫苗佐劑方面

47、的研究成為當(dāng)今的熱點,研究者主要從預(yù)防及治療乙肝方面對gm-csf的作用進行嘗試。在預(yù)防方面,kim等53隨機對60名乙肝免疫無應(yīng)答志愿者進行了實驗，試驗中將其分為年齡、體重、性別、吸煙狀況等大致相同的兩組，一組每人每次注射40微克乙肝疫苗，另一組則首先注射125微克的gm-csf，然后立刻在同一部位注射標(biāo)準(zhǔn)的10微克乙肝疫苗，兩組其他實驗條件與程序均相容。實驗結(jié)果顯示，gm-csf與10微克乙肝疫苗共同注射組和40微克乙肝疫苗注射組志愿者的血清抗體都有很大的上升，且相差不大，表明gm-csf有效地提高了乙肝免疫無應(yīng)答者的血清保護抗體，能夠替代大劑量的疫苗注射產(chǎn)生的血清來保護抗體；作為佐劑gm

48、-csf可以明顯地提高疫苗在機體中的免疫作用,特別是對t細(xì)胞功能受損的個體中乙肝疫苗無/或低反應(yīng)患者更有意義。在治療方面的研究中,王建設(shè)等54人在以gm-csf增強apc的功能，并且消除免疫耐力的設(shè)想下，研究了27名母親為hbv攜帶者，出生時乙肝表面的抗原（h bsag)陽性經(jīng)乙肝疫苗免疫仍發(fā)展為慢性無癥狀攜帶兒童分為兩組進行了實驗，14名使用gm-csf50微克和乙肝疫苗10微克在相同部位進行肌肉注射，令13名則在不同部位肌肉注射乙肝免疫球蛋白200iu和乙肝疫苗10微克。治療結(jié)束后1個月進行復(fù)查，結(jié)果顯示，戀足各有12名兒童完成研究，第一組有3例，第二組有4例，治療后均有2例恢復(fù)正常。實驗

49、表明，gm-csf和乙肝疫苗共同免疫能夠顯著地抑制hbv的復(fù)制,并加快肝功能的恢復(fù),對乙肝疫苗免疫失敗的慢性hbv攜帶兒童具有一定的治療作用。、作為分子疫苗佐劑,編碼gm-csf的質(zhì)粒隨著新型病毒dna疫苗的發(fā)展也也被應(yīng)用于dna疫苗的研究中。gm-csf增強dna疫苗免疫效果,主要是通過促進包dc在內(nèi)的apc的增殖分化,將其吸引到注射部位,增強抗原呈遞能gm-csf增強dna疫苗免疫效果,主要是通過促進包dc在內(nèi)的apc的增殖分化,將其吸引到注射部位,增強抗原呈遞能力,從而達(dá)到佐劑作用。實驗研究表明用dna疫苗與質(zhì)粒gm-csf共注射與單獨用dna疫苗注射比較,前者抗體水平、ifn-分泌水平

50、及ctl活性均較后者高。單獨注射編碼丙型肝炎病毒(hcv)核心抗原dna疫苗的抗體陽轉(zhuǎn)率僅為40%，geissle等8把表達(dá)gm -csf的質(zhì)粒與該疫苗一起注射后,小鼠的抗體陽轉(zhuǎn)率為80%,同時還檢測到特異性cd4+t細(xì)胞增殖和ctl活性均增強。kusak-abe等10研究gm-csf表達(dá)質(zhì)粒對hiv dna疫苗誘導(dǎo)的th1和th2反應(yīng)類型的影響,在注射dna疫苗前3 d注射gm-csf,誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以th2為主,認(rèn)為可能是注射gm-csf后誘導(dǎo)大量th2型細(xì)胞因子的dc擴增產(chǎn)生的結(jié)果;若在注射dna疫苗后3 d注射gm-csf,誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以th1為主,其機制尚不清楚;若同時注射兩種質(zhì)粒

51、,可使th1和th2反應(yīng)均增強。barauch等9的研究表明表達(dá)gp120和gm-csf的雙順反子hiv dna疫苗可以誘導(dǎo)很強的cd4+t反應(yīng),使單順反子gp120 dna疫苗在低于使用劑量100倍情況下誘導(dǎo)出gp120特異的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)。 1.4.2.2 gm-csf在腫瘤性疫苗佐劑中的應(yīng)用作為腫瘤細(xì)胞疫苗的佐劑，瘤細(xì)胞免疫原性弱，腫瘤疫苗的作用機制為利用腫瘤抗原物質(zhì)或者腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機體的體液免疫應(yīng)答和特異性細(xì)胞免疫,增強機體的抗腫瘤能力，將可溶性的gm-csf作為佐劑轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)能誘導(dǎo)針對于腫瘤抗原的蛋白或多肽疫苗的免疫應(yīng)答，并通過主動免疫的治療方式能夠發(fā)揮更佳的抗腫瘤作用。 1.4

52、.2.3 gm-csf在細(xì)胞疫苗佐劑中的應(yīng)用細(xì)胞疫苗一般為分離出單核細(xì)胞從病人外周血和骨髓中,再在體外分化成apc后在外源性抗原的刺激下分化成成熟的apc。通過分子技術(shù)將細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染dc制備dc疫苗,因gm-csf本身具有很強的免疫佐劑功能,從而成為dc疫苗中常用于的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因子。另外gm-csf還與其他類型的抗腫瘤疫苗聯(lián)合應(yīng)用,如多肽瘤苗、帶有腫瘤抗原的重組痘苗病毒、腫瘤dna疫苗,均取得了良好得效果。但目前較為深入，也較多的依舊是腫瘤細(xì)胞疫苗,并且有很多gm-csf修飾自體腫瘤細(xì)胞的疫苗已經(jīng)進入了臨床i、ii試驗。 1.4.3 gm-csf在治療頭頸部腫瘤放射性黏膜炎的應(yīng)用gm-cs

53、f應(yīng)用在放射治療中，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子的產(chǎn)生,它們很可能介導(dǎo)黏膜的炎性過程；增加粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量并提高其活性；并且存在促進上皮修復(fù)的可能性。因此可以減輕放療所致的黏膜損傷。gm-csf可以通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞的增殖,增加郎格罕細(xì)胞的產(chǎn)生,從而控制局部感染。gm-csf可以有效地控制隨著放射劑量的增加黏膜損傷進一步加重的趨勢;有利于放射治療的順利進行,減少了因中斷放射治療而延長療程的幾率，同時gm-csf加快了口腔黏膜潰瘍的愈合,愈合時間明顯縮短,從而極大地減輕了患者痛苦,減少了局部繼發(fā)感染。幾乎無不良反應(yīng),及時有也是很輕微的，經(jīng)對癥處理

54、后并不影響放療的進行?？傊? gm-cs口腔含漱和皮下注射的方法是很值得臨床推廣應(yīng)用的，均能夠有效地促進口腔潰瘍愈合。 1.5 gm-csf的研究內(nèi)容 1.5.1gm-csf對創(chuàng)面愈合的研究 gm-csf是一種多功能的造血生長因子，具有恢復(fù)骨髓造血和增強機體免疫功能的生物學(xué)作用。目前有研究表明gm-csf能加速創(chuàng)面的愈合，并在臨床治療慢性創(chuàng)面中取得了很滿意的效果，肯定了其對于慢性不愈創(chuàng)面的促愈作用，但怎樣使其不影響后續(xù)皮膚組織再生，并將作用發(fā)揮到最大的抗異物、抗菌效應(yīng)；在局部用藥時，使其不會增加外周血gm-csf的濃度和血細(xì)胞數(shù)量而產(chǎn)生副作用，以及創(chuàng)面用藥時間及劑量、劑型、用藥的最佳時機等，還

55、需進一步研究。 1.5.2 骨髓抑制化療 gm-csf可減少接受骨髓抑制化療病人的中性白細(xì)胞減少癥和感染，并縮短住院期，但骨痛和腹痛、低度發(fā)熱、肌痛等不良反應(yīng)稍大，故對其在骨髓抑制化療中的應(yīng)用應(yīng)需要進一步研究。 1.5.3 gm-csf協(xié)同抗腫瘤作用 gm-csf強烈激活特異免疫反應(yīng)這一突出作用可用于腫瘤治療。 gm-csf是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，不僅可以誘導(dǎo)dc細(xì)胞成熟、分化，而dc細(xì)胞在t細(xì)胞免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用，而且gm-csf在免疫治療中還能夠增強主要和次要的抗體反應(yīng)。這也為臨床腫瘤的治療提供了新的思路和策略。故要利用gm-csf的協(xié)同抗腫瘤作用，配合手術(shù)、放療和化療必將提高腫瘤的

56、整體治療水平，還有許多問題仍需要解決。 1.5.4 gm-csf與慢性阻塞性肺疾病（copd）的相關(guān)性gm-csf由呼吸道病原體及有害氣體刺激氣道上皮細(xì)胞及其他細(xì)胞產(chǎn)生，對copd起到關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存活與活化具有重要調(diào)節(jié)作用，在copd的形成與發(fā)展中充當(dāng)了一定的角色，起著極其重要的作用，但gm-csf與copd嚴(yán)重程度的相關(guān)性還需進一步明確。 1.5.5 hgm-csf基因的表達(dá)及其調(diào)控 目前雖然對hgm-csf及其受體的信號傳導(dǎo)與細(xì)胞分化、存活和增值、凋亡及其功能的關(guān)系已經(jīng)有了一定的認(rèn)識，但仍然存在許多值得探討的問題，如其是否還存在其他的信號傳導(dǎo)通路，是否可以找到其最優(yōu)

57、化表現(xiàn)體系，隨著其的臨床一按就日趨成熟，其應(yīng)用前景將更為廣闊。第二章 材料與方法 2.1 材料 2.1.1菌種 經(jīng)重組后產(chǎn)gm-csf的大腸桿菌 2.1.2培養(yǎng)基lb培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和nacl。其中酵母提取物為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而nacl提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96時溶化，一般實際應(yīng)用時在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。

58、由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此，要用稀酸或稀堿將其ph調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。 lb的配方為： 氯化鈉10g 酵母膏5g 蛋白胨10g 蒸餾水1升 調(diào)ph為7.0 2.1.3 藥品及試劑重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhgm-csf）購自：衛(wèi)生部制品所；染色劑 脫色劑 酵母粉 蛋白胨 瓊脂 氯化鈉 氫氧化鈉 葡萄糖 甘油 蔗糖 牛肉膏 電泳液 氨芐西林鈉 ph試紙 1mol/l naoh 1mol/l hcl； 染色劑1升: 考馬斯亮藍(lán)r-250 1g 甲醇450ml 蒸餾水450ml 冰醋酸100ml脫色劑1升:甲醇 100ml 冰醋酸100ml 蒸餾水 800 ml

59、電泳液：（1）a液： 丙烯酰胺儲存，100ml 30%丙烯酰胺 0.8%雙丙烯酰胺 29.2克丙烯酰胺 0.8克雙丙烯酰胺 （2）b液：100ml 75ml 2mol/l tris-hcl(ph8.8) 4ml 10%sds 21ml蒸餾（3）c 液：50ml 1mol/l tris-hcl(ph6.8) 4ml 10%sds 46ml蒸餾水（4）10%過硫酸銨，5ml 0.5g過硫酸銨，5ml蒸餾水（5）電泳緩沖液，1升 3 g tris堿 14.4 g甘氨酸 1 gsds 加蒸餾水至1升 ph在8.3左右 2.1.4儀器及器皿恒溫振蕩器 烘箱 壓力蒸汽滅菌器 超凈工作臺 分光光度計 高速離心機 電泳儀 培養(yǎng)皿 小三角瓶 大三角瓶 移液槍 燒杯 移液管 試管 三角燒瓶 量筒 玻棒 培養(yǎng)基分裝器 天平 牛角匙 高壓蒸汽滅菌鍋 ph試紙（ph 5.59.0） 棉花 牛皮紙 記號筆 麻繩 紗布 2.2 實驗方法 2.2.1配制培養(yǎng)基a.稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物、蛋白胨、nacl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。b.溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。