生物制藥技術(shù)(三)

1、 第三章第三章 細(xì)胞工程制藥細(xì)胞工程制藥 細(xì)胞是一切生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。細(xì)胞是一切生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。 uMuller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。 uVirchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。 uLuginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。 uLange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程。 uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。 u1958年日本學(xué)者岡田（Ok

2、ada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。 u1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。 u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 u20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。 生物種類生物種類細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞來(lái)源成功年代成功年代 煙草兩個(gè)種間 苷藍(lán)青菜 大豆馬唐草 矮牽牛龍面花 大麥花生 大麥大豆 小麥矮牽牛 油菜大豆 玉米大豆 大豆野豌豆 大麥蠶豆 大豆草香木犀 酵母菌雞 大豆煙草 大豆秋水仙 人胡蘿卜 番茄馬鈴薯 人小鼠 葉葉 葉根 愈傷組織葉 葉花瓣 種子種子 葉懸浮細(xì)胞 葉花瓣 葉懸

3、浮細(xì)胞 葉懸浮細(xì)胞 懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞 葉根 懸浮細(xì)胞葉 原生質(zhì)體血紅細(xì)胞 懸浮細(xì)胞葉 懸浮細(xì)胞葉 腹水癌細(xì)胞原生質(zhì)體 葉根尖 纖維肉瘤細(xì)胞畸胎瘤細(xì)胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 幾種細(xì)胞融合成功的例子幾種細(xì)胞融合成功的例子 植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比,右瓶為地面融合的右瓶為地面融合的 細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如

4、下：病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下： 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 u聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。 uPEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。 uPEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。 u通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。 uPEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。 2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEG）法）法 聚乙二醇（聚

5、乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程）法細(xì)胞融合過(guò)程 PEG的作用機(jī)理的作用機(jī)理： 由于由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，分子具有輕微的負(fù)極性， 故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等 形成形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使 細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能能 增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合 成為可能。成為可能。 PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本

6、低，勿需特殊其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊 設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。 其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害?？赡軐?duì)細(xì)胞有毒害。 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法細(xì)胞融合步驟細(xì)胞融合步驟 （1）將兩種不同親本細(xì)胞各5l06混勻； （2）離心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘； （4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng) 液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （6

7、）624小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。 3、電融合法、電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電 脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變， 使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連 接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。 電融合法的優(yōu)點(diǎn)：電融合法的優(yōu)點(diǎn)： u融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害小； u裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程； u免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。 電融合的基本過(guò)程：電融合的基本過(guò)程： 細(xì)胞膜的接觸：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通 電后，電流

8、即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在 電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串； 膜的擊穿：膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以 使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖電融合誘導(dǎo)法原理示意圖 第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用 4、激素、激素 5、酶、酶 6、病毒

9、殺蟲(chóng)劑、病毒殺蟲(chóng)劑 7、腫瘤特異性抗原、腫瘤特異性抗原 8、單克隆抗體、單克隆抗體 9、細(xì)胞本身、細(xì)胞本身 （anchoraged-independent cell ） 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： （1）提供激素及低分子量營(yíng)養(yǎng)物。）提供激素及低分子量營(yíng)養(yǎng)物。 （2）提供結(jié)合蛋白質(zhì)，能識(shí)別維生素、脂類、）提供結(jié)合蛋白質(zhì)，能識(shí)別維生素、脂類、 金屬和其他激素等。金屬和其他激素等。 （3）有些情況下，結(jié)合蛋白能與有毒金屬和熱）有些情況下，結(jié)合蛋白能與有毒金屬和熱 原結(jié)合，起到解毒作用原結(jié)合，起到解毒作用 （4）起酸堿度緩沖劑作用。）起酸堿度緩沖劑作用。 （5）提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞傳代時(shí)使用的）提供蛋白酶抑制劑

10、，使細(xì)胞傳代時(shí)使用的 胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。 血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的負(fù)面影響：血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的負(fù)面影響： 空氣提升式生物反應(yīng)器兩種構(gòu)型：空氣提升式生物反應(yīng)器兩種構(gòu)型： 內(nèi)循環(huán)式、外循環(huán)式內(nèi)循環(huán)式、外循環(huán)式 空氣流速一般控制在空氣流速一般控制在0.010.06m3/m3.min, 反應(yīng)器高徑比一般為反應(yīng)器高徑比一般為(3:1)(12:1) （1）沒(méi)有移動(dòng)部件，產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，）沒(méi)有移動(dòng)部件，產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻， 剪切力相當(dāng)小，細(xì)胞損傷率比較低。剪切力相當(dāng)小，細(xì)胞損傷率比較低。 （2）完全密封，便于無(wú)菌操作，不易污染。）完全密封，便于無(wú)菌操作，不易污染。 （3）

11、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，便于放大生產(chǎn)。）設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，便于放大生產(chǎn)。 （4）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體 循環(huán)量大，使細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分能均勻地分布于培養(yǎng)循環(huán)量大，使細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分能均勻地分布于培養(yǎng) 基中?；?。 （3 3）、中空纖維生物反應(yīng)器）、中空纖維生物反應(yīng)器 第三節(jié)第三節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用 葉綠體 線粒體 細(xì)胞壁 細(xì)胞膜 液泡 細(xì)胞質(zhì) 光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 細(xì)胞核 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體 二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的 誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期 對(duì)數(shù)增殖對(duì)數(shù)增殖 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 衰減期衰減期 靜靜 止止 0 40 80 120 160 200 細(xì)細(xì) 胞胞

12、 濃濃 度度 (g/ L) 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間(h) 植物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線植物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的比較植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的比較 特性特性 微生物微生物 植物細(xì)胞植物細(xì)胞 大小大小 2 mm3 3 10105 5 m m3 3 單一細(xì)胞單一細(xì)胞 經(jīng)常經(jīng)常 一般以群體發(fā)育一般以群體發(fā)育 由單細(xì)胞生長(zhǎng)成細(xì)胞群由單細(xì)胞生長(zhǎng)成細(xì)胞群 是是 少有少有 加成時(shí)間加成時(shí)間 大于大于1 1h 1d d 接種濃度接種濃度 小小 細(xì)胞在培養(yǎng)液中濃度為細(xì)胞在培養(yǎng)液中濃度為5% 5% 20% 20% 染色體數(shù)目染色體數(shù)目 單或雙倍體單或雙倍體 單、雙、多及不定倍體混合生長(zhǎng)單、雙、多及不定倍體混合生長(zhǎng)

13、 切力切力 不敏感不敏感 敏感敏感 單一培養(yǎng)的變異單一培養(yǎng)的變異 安定安定 變異很大變異很大 發(fā)育發(fā)育 可形成孢子或假菌絲可形成孢子或假菌絲 形成器官或胚形成器官或胚 通氣需求通氣需求 高，高，1 1 2 2m3/m3.min 低，低，0.2 0.30.3m3/m3.min 產(chǎn)物形成產(chǎn)物形成 進(jìn)入菌絲進(jìn)入菌絲 進(jìn)入液泡進(jìn)入液泡 有有13種植物必需的元素種植物必需的元素 N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、 Cu、Zn、Mo、Cl，前前6種為大量元素，后種為大量元素，后7種種 屬微量元素。屬微量元素。I雖不是植物生長(zhǎng)所必需的，但幾雖不是植物生長(zhǎng)所必需的，但幾 乎所有組織培養(yǎng)基中都有，有些

14、培養(yǎng)基還加入乎所有組織培養(yǎng)基中都有，有些培養(yǎng)基還加入 Co、Ni、Ti、Be，、，、Al等元素。等元素。 。 這些物質(zhì)不是植物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，這些物質(zhì)不是植物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的， 但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有益。如活性炭可以降低組織培但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有益。如活性炭可以降低組織培 養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。液養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。液 體培養(yǎng)基中加入瓊脂糖，可改善培養(yǎng)細(xì)胞的供體培養(yǎng)基中加入瓊脂糖，可改善培養(yǎng)細(xì)胞的供 氧狀況。氧狀況。 植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等， 它們的作用是供給一些必需的微量營(yíng)養(yǎng)成它們的作用是供給一些必需的微量營(yíng)養(yǎng)成 分、生理活性物質(zhì)

15、和生長(zhǎng)激素物質(zhì)等。分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素物質(zhì)等。 2 2、光、光 植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的合成受光質(zhì)和植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的合成受光質(zhì)和 光量的調(diào)節(jié)。光量的調(diào)節(jié)。 對(duì)于黃酮、黃酮醇、花色素苷、萘對(duì)于黃酮、黃酮醇、花色素苷、萘 醌、多酚、揮發(fā)油、萜烯和其他次級(jí)代醌、多酚、揮發(fā)油、萜烯和其他次級(jí)代 謝的合成和積累來(lái)講，光質(zhì)和光量具有謝的合成和積累來(lái)講，光質(zhì)和光量具有 重要的影響。重要的影響。 最適生長(zhǎng)溫度最適生長(zhǎng)溫度25253030，此外，溫，此外，溫 度對(duì)培養(yǎng)基成分的利用速度也有一定的度對(duì)培養(yǎng)基成分的利用速度也有一定的 影響。影響。 KessellKessell和和CarrCarr在驗(yàn)證溶解氧對(duì)攪動(dòng)通

16、氣在驗(yàn)證溶解氧對(duì)攪動(dòng)通氣 培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn) 有一個(gè)臨界氧水平。在臨界水平之上，生長(zhǎng)不有一個(gè)臨界氧水平。在臨界水平之上，生長(zhǎng)不 受溶解氧的影響，根據(jù)干重或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算的受溶解氧的影響，根據(jù)干重或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算的 生長(zhǎng)呈指數(shù)增加。而低于這個(gè)臨界值時(shí)，干重生長(zhǎng)呈指數(shù)增加。而低于這個(gè)臨界值時(shí)，干重 增加呈線性，而細(xì)胞數(shù)目仍以指數(shù)形式增加。增加呈線性，而細(xì)胞數(shù)目仍以指數(shù)形式增加。 1 1 組織培養(yǎng)：組織培養(yǎng)： 植物細(xì)胞工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)首先是細(xì)胞生物量的植物細(xì)胞工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)首先是細(xì)胞生物量的 增長(zhǎng)，細(xì)胞即為重要的產(chǎn)品之一。如人參細(xì)胞制增長(zhǎng)，細(xì)胞

17、即為重要的產(chǎn)品之一。如人參細(xì)胞制 成人參細(xì)胞粉，既是保健食品原料，也可作為藥成人參細(xì)胞粉，既是保健食品原料，也可作為藥 材，其中除含人參皂苷（人參皂苷含量材，其中除含人參皂苷（人參皂苷含量7%，超，超 過(guò)了原植物過(guò)了原植物 ）外，還）外，還含有天然人參所不具有的酶含有天然人參所不具有的酶 類及其活性成分，其保健作用優(yōu)于天然人參。類及其活性成分，其保健作用優(yōu)于天然人參。 日本曾用煙草細(xì)胞培養(yǎng)收集煙草細(xì)胞作為煙日本曾用煙草細(xì)胞培養(yǎng)收集煙草細(xì)胞作為煙 草原料。草原料。 2 2、初級(jí)及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)、初級(jí)及次級(jí)代謝物的生產(chǎn) 化合物化合物細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞來(lái)源作用作用 紫草素紫草素紫草細(xì)胞紫草細(xì)胞抗炎劑，食

18、用色素抗炎劑，食用色素 辣椒素辣椒素朝天椒細(xì)胞朝天椒細(xì)胞食品，化妝品色素食品，化妝品色素 甘草精甘草精甘草細(xì)胞甘草細(xì)胞甜味劑甜味劑 香豆素香豆素薰衣草細(xì)胞薰衣草細(xì)胞香料香料 薄荷醇薄荷醇薄荷細(xì)胞薄荷細(xì)胞香料香料 黃連素黃連素黃連細(xì)胞黃連細(xì)胞止瀉藥止瀉藥 類胰島素類胰島素苦瓜細(xì)胞苦瓜細(xì)胞治療糖尿病治療糖尿病 毛地黃毒素毛地黃毒素毛地黃細(xì)胞毛地黃細(xì)胞強(qiáng)心藥強(qiáng)心藥 利血平利血平羅夫杉細(xì)胞羅夫杉細(xì)胞降血壓藥降血壓藥 奎寧堿奎寧堿金雞納樹(shù)金雞納樹(shù)抗瘧疾抗瘧疾 長(zhǎng)春花堿長(zhǎng)春花堿長(zhǎng)春花長(zhǎng)春花治療白血病治療白血病 可卡因可卡因古柯植物古柯植物抗阿米巴病抗阿米巴病 尼古丁尼古丁煙草煙草殺蟲(chóng)藥殺蟲(chóng)藥 嗎啡嗎啡罌粟

19、罌粟止痛藥止痛藥 九、植物細(xì)胞培養(yǎng)的幾個(gè)技術(shù)難題九、植物細(xì)胞培養(yǎng)的幾個(gè)技術(shù)難題 植物細(xì)胞生產(chǎn)周期一般為植物細(xì)胞生產(chǎn)周期一般為25 3535d d， 由于生產(chǎn)效率低，設(shè)備周轉(zhuǎn)慢，能源、勞力由于生產(chǎn)效率低，設(shè)備周轉(zhuǎn)慢，能源、勞力 消耗多，因而成本高。消耗多，因而成本高。 成塊后使細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，細(xì)胞的性成塊后使細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，細(xì)胞的性 質(zhì)有差異，有效成分的含量不一樣，影響產(chǎn)質(zhì)有差異，有效成分的含量不一樣，影響產(chǎn) 品的質(zhì)量的產(chǎn)量，另外造成管路堵塞等麻煩。品的質(zhì)量的產(chǎn)量，另外造成管路堵塞等麻煩。 選用松散易分散的起始材料，培養(yǎng)過(guò)程選用松散易分散的起始材料，培養(yǎng)過(guò)程 中隨時(shí)除去細(xì)胞團(tuán)塊，提高生長(zhǎng)素的

20、濃度向中隨時(shí)除去細(xì)胞團(tuán)塊，提高生長(zhǎng)素的濃度向 培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入EDTA-NaEDTA-Na螯合劑和果膠酶等。螯合劑和果膠酶等。 包括特異性免疫包括特異性免疫( (Specific Specific immunity)immunity)和非特異性免疫。和非特異性免疫。 一、免疫系統(tǒng)一、免疫系統(tǒng) 當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，一當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，一 類小淋巴細(xì)胞類小淋巴細(xì)胞- -依賴胸腺的依賴胸腺的T T細(xì)胞細(xì)胞 發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細(xì)發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細(xì) 胞或間接地釋放一些淋巴因子，胞或間接地釋放一些淋巴因子， 從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過(guò)程。從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過(guò)程。 細(xì)胞免疫：細(xì)

21、胞免疫： 單克隆抗體：?jiǎn)我坏奶禺愋钥贵w即為單一單克隆抗體：?jiǎn)我坏奶禺愋钥贵w即為單一B 細(xì)胞克隆抗體，細(xì)胞克隆抗體，B型淋巴細(xì)胞的增生過(guò)程是一個(gè)型淋巴細(xì)胞的增生過(guò)程是一個(gè) 無(wú)性繁殖過(guò)程，即由一個(gè)無(wú)性繁殖過(guò)程，即由一個(gè)B細(xì)胞分裂而形成的細(xì)細(xì)胞分裂而形成的細(xì) 胞 群 ， 稱 為 一 個(gè) 克 隆 。 單 克 隆 抗 體胞 群 ， 稱 為 一 個(gè) 克 隆 。 單 克 隆 抗 體 (Monoclonal antibody,McAb) 也稱為單抗。也稱為單抗。 多克隆抗體多克隆抗體(Polyclonal antibody) ：多多 種種B型淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物。型淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物。

22、19751975年，英國(guó)年，英國(guó)Milstein Milstein 和和KohlorKohlor將經(jīng)將經(jīng) 綿羊細(xì)胞免疫的小鼠脾綿羊細(xì)胞免疫的小鼠脾B B淋巴細(xì)胞與小鼠骨淋巴細(xì)胞與小鼠骨 髓瘤細(xì)胞在仙臺(tái)病毒的誘導(dǎo)下進(jìn)行融合，利髓瘤細(xì)胞在仙臺(tái)病毒的誘導(dǎo)下進(jìn)行融合，利 用用HATHAT選擇性培養(yǎng)基篩選出融合后形成的雜選擇性培養(yǎng)基篩選出融合后形成的雜 交細(xì)胞，這種細(xì)胞既有小鼠骨髓瘤細(xì)胞在體交細(xì)胞，這種細(xì)胞既有小鼠骨髓瘤細(xì)胞在體 外培養(yǎng)條件下大量繁殖的本領(lǐng)，又有外培養(yǎng)條件下大量繁殖的本領(lǐng)，又有B B淋巴淋巴 細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，使得單克隆抗細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，使得單克隆抗 體在體外生產(chǎn)成為可

23、能。體在體外生產(chǎn)成為可能。 1 1 、新型診斷試劑：、新型診斷試劑： 紅細(xì)胞表面的糖蛋白：紅細(xì)胞表面的糖蛋白：A、B型型 AB型：兩種都帶型：兩種都帶 O型：兩種血型物質(zhì)都不帶型：兩種血型物質(zhì)都不帶 法國(guó)輸血中心還研制出了可分辯法國(guó)輸血中心還研制出了可分辯A型、型、 B型、型、AB型血型的單克隆抗體診斷盒。型血型的單克隆抗體診斷盒。 單克隆抗體可用在體內(nèi)定位診斷上，單克隆抗體可用在體內(nèi)定位診斷上， 不同的癌癥或腫瘤在體內(nèi)所表現(xiàn)出的癌不同的癌癥或腫瘤在體內(nèi)所表現(xiàn)出的癌 抗原或瘤抗原不同，可以獲得各種特異抗原或瘤抗原不同，可以獲得各種特異 的單克隆抗體，再采用合適的同位素標(biāo)的單克隆抗體，再采用合適

24、的同位素標(biāo) 記表使特異的單克隆抗體上帶有放射性記表使特異的單克隆抗體上帶有放射性 標(biāo)記。標(biāo)記。 單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正 顯示著巨大的優(yōu)勢(shì)，其中治療效果較好顯示著巨大的優(yōu)勢(shì)，其中治療效果較好 的有白血病、淋巴瘤、腎癌、肉瘤、黑的有白血病、淋巴瘤、腎癌、肉瘤、黑 色素瘤、肝癌以及胃腸道腫瘤等。色素瘤、肝癌以及胃腸道腫瘤等。 1、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物 抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，操作簡(jiǎn)單、用量小， 且能觀察到藥物在體內(nèi)的分布和藥物動(dòng)力學(xué)，放射性標(biāo)記的 抗體有較大的殺傷范圍，有利于克服腫瘤表面抗原的異質(zhì)性， 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷也不依賴抗原抗體結(jié)合后的吸收作

25、用，由 于分子量小，容易穿透到達(dá)腫瘤部位。 2、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物 （1）、常用抗癌藥 氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素、環(huán)磷 酰胺等，以人血清白蛋白為中間載體，可明顯提高每分子抗 體所攜帶的氨甲喋呤量，使體外細(xì)胞毒性提高倍。 （2）、抗體類藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥性 腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可 產(chǎn)生多藥耐藥性。 毒素偶聯(lián)的抗體藥物 1、免疫毒素及其換代制品 毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B鏈的完整的毒素和抗體的交聯(lián)物，應(yīng)用有限， 第二代免疫毒素利用抗體或抗體片段與毒素作用，在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用； 第三代免疫毒素重組免疫毒素，特異性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，滲透性好，免疫原性 低，

26、可大量制備。 2、免疫毒素的制備 來(lái)源:主要是細(xì)菌毒素和植物毒素。 載體種類：小分子抗體FV和SCFV；細(xì)胞生長(zhǎng)因子可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合； 激素，可識(shí)別細(xì)胞表面的受體；CD4可識(shí)別HIV表達(dá)的糖蛋白。 先克隆出細(xì)胞基因，再利用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性結(jié)合部位基因， 經(jīng)過(guò)改造的毒素基因再與載體基因的互補(bǔ)DNA重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá)，形成融 合蛋白，再經(jīng)純化可得到重組的免疫毒素。 3、免疫毒素的臨床應(yīng)用 可用于治療腫瘤、自身免疫病、并能克服組織移植排斥反應(yīng)，可單獨(dú)給藥也 可包裹在脂質(zhì)體及其他微粒中給藥，在胞漿物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，相對(duì)分子量小， 滲透力強(qiáng)、效果好。 抗HBsAg的單克隆抗體生

27、產(chǎn)工藝 抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)單克隆抗體是專一性識(shí)別 HBsAg的單一抗體，能與HBsAg產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 臨床上用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的感染并用于生產(chǎn)預(yù)防乙 肝的免疫制劑，目前生產(chǎn)抗HBsAg的單克隆抗體技術(shù)有基因 工程與細(xì)胞工程。 免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞與大鼠骨髓瘤的IR983F 細(xì)胞融合技術(shù)制造抗HBsAg單克隆抗體的工藝。 (1)(1)工藝流程工藝流程 大鼠骨髓瘤細(xì)胞+免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞 融合混合物 雜種細(xì)胞混合物 雜交瘤克隆系 細(xì)胞種質(zhì) 培養(yǎng)液 粗制McAb 層析液 濃縮液 McAb精品 (2)工藝過(guò)程工藝過(guò)程 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 大鼠骨髓瘤IR983 F細(xì)胞系的培養(yǎng)基為改良的改良的

28、 (DMEM)培培 養(yǎng)基。養(yǎng)基。 使Eagle培養(yǎng)基中15種氨基酸濃度增加1倍， 8種維生素濃度增加3倍而成，用于細(xì)胞培養(yǎng)，提高了細(xì)胞 生長(zhǎng)效果。 其中尚需10%滅活小牛血清，1%非必需氨基酸，0.1mol L丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺及50mgmI慶大霉素；雜交瘤細(xì) 胞篩選系統(tǒng)用含HAT的DMEM培養(yǎng)基。 飼養(yǎng)細(xì)胞制備： 在細(xì)胞融合前23天，取健康大鼠處死，向腹腔內(nèi)注入 10mlDMEM培養(yǎng)液 輕壓腹腔使細(xì)胞懸浮，打開(kāi)腹壁皮膚，暴露腹膜，提起 腹膜中心，插入注射針頭，吸出全部細(xì)胞懸液； 500g離心5min，用pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液洗滌2-3 次； 收集細(xì)胞，用含10小牛血清、10

29、0Uml青霉素和鏈霉 素及HAT的DMEM培養(yǎng)液制成106細(xì)胞ml懸浮液； 使用24孔板時(shí)，每孔加0.1ml，當(dāng)使用96孔板時(shí)，則制成 2x105細(xì)胞ml的懸浮液，每孔加0.1ml， 然后置37的CO2培養(yǎng)箱中溫育，備用。 親本細(xì)胞準(zhǔn)備：親本細(xì)胞準(zhǔn)備： 取對(duì)8氮鳥(niǎo)嘌呤抗性的Louc大鼠非分泌型漿細(xì)胞瘤 IR983F細(xì)胞，用常規(guī)方法制成細(xì)胞懸浮液，按1.5x105細(xì)胞 ml接種量接種于DMEM培養(yǎng)液中，于37CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)常規(guī)消化分散法用DMEM培養(yǎng)液制成細(xì) 胞懸浮液，即為待融合用骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞親本，備用。 另取HBsAg用pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液溶解并稀

30、釋 成20gml的溶液，加等體積福氏完全佐劑充分乳化后， 取2ml注入Louc大鼠腹腔，2周后進(jìn)行第2次免疫，3個(gè)月 后于融合前34天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3次免疫的劑量和注射途 徑均相同，唯第3次免疫時(shí)不加福氏佐劑， 于細(xì)胞融合前處死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后對(duì) 右上腹部消毒，剖開(kāi)腹部，用無(wú)菌剪刀與鑷子取出脾臟脾臟，用 pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液洗去血液，在無(wú)菌燒杯或培養(yǎng) 皿中切成1mm3小塊，再用磷酸緩沖液洗滌34次，直至澄 清，傾去洗滌液， 加入組織塊56倍體積(質(zhì)量體積)的0.25%胰蛋白酶 溶液(pH7.67.8)于37度保溫，消化20一40min，每10min 輕搖消化瓶1次

31、，直至組織塊松軟為止，傾去胰蛋白酶溶液， 再用上述磷酸緩沖液洗滌35次，然后加入少量磷酸緩沖液 用10ml吸管吹打分散，至大部分組織塊分散為細(xì)胞， 用兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾，未分散的組織塊再加少量磷酸緩 沖液吹打和分散，合并細(xì)胞濾液，離心收集細(xì)胞并用磷酸緩 沖液洗滌23次，然后用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋制成細(xì) 胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞親本，備用。 固定化抗大鼠K輕鏈單抗的制備： 本法所用載體也為Sepharose 4B，其活化方法與制備固定化t-PA相 同 取30g活化的Sepharose 4B懸浮于100ml，pH10.2，0.025mol/L硼酸 緩沖液中，另取1g抗大鼠K輕鏈的McA

32、b(MARK-1)溶于25ml硼酸緩沖液， 然后加至上述已活化的Sepharose 4B懸浮物中，于10度攪拌反應(yīng)16 20h，將其裝柱(直徑2cm*50cm)并用10倍柱床體積(體積體積)的上述 硼酸緩沖液以56mlmin流速洗滌柱床，收集流出液， 測(cè)A280并根據(jù)流出液計(jì)算偶聯(lián)效率然后依次用5倍柱床體積(體積 體積)的pH10，0.1mol/L乙醇胺溶液及pH8.0，0.1molL硼酸緩沖液充分 洗滌 最后用pH7.4，0.1mo/L磷酸緩沖液洗至流出液A280小于0.01，即得抗 HBsAg McAb的親和吸附劑，將其轉(zhuǎn)移至含0.01NNaN3的pH7.4，0.1mol 磷酸緩沖液中，于

33、4貯存，備用。 細(xì)胞融合：細(xì)胞融合： 取107個(gè)IR983 F細(xì)胞與108個(gè)免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞于 50mi離心管中，混勻，在4度下，1500rmin離心810min， 用巴斯德吸管小心吸去上清液，輕彈管底，使沉淀的細(xì)胞松 動(dòng)， 于37度水浴中保溫，并于lmin內(nèi)輕輕滴加0.8ml 50%PEG4000，同時(shí)用吸管尖輕輕攪動(dòng)6090s，然后于 2min內(nèi)緩慢滴加20mlDMEM培養(yǎng)液，1500rmin離心8 10min，吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的DMEM培 養(yǎng)液稀釋至50ml，制成細(xì)胞懸浮液， 得細(xì)胞融合混合物.取25ml融合混合物加至兩塊含飼養(yǎng)細(xì) 胞的24孔微量培養(yǎng)板中，每孔加0.

34、5ml； 余下25ml細(xì)胞融合混合物再用含20%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋至50m1，依上法再接種兩塊24孔培養(yǎng)板 依此類推，每次融合混合物可按種810塊24孔培養(yǎng)板， 按IR983 F計(jì)，每孔接種細(xì)胞數(shù)約為105個(gè)，剩余融合物棄 去 若用96孔板，則每孔接種細(xì)胞數(shù)約為104個(gè)然后于37 度，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24天，每天從各孔中吸去lml原 培養(yǎng)液，替換含20%小牛血清及HAT的DMEM培養(yǎng)液，繼 續(xù)培養(yǎng)至第56天可見(jiàn)小克隆，至910天可見(jiàn)大克隆， 中途不換HT培養(yǎng)液。 若培養(yǎng)液出現(xiàn)淡黃色，可取出一部分培養(yǎng)液進(jìn)行抗體檢 測(cè)。培養(yǎng)10天后改換含HT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后改用 常規(guī)DME

35、M培養(yǎng)液培養(yǎng)。 雜交瘤細(xì)胞篩選： 篩選產(chǎn)生抗HBsAg單抗的雜交瘤細(xì)胞的方法是用AUSAB 酶免疫試劑盒酶免疫試劑盒測(cè)定表達(dá)抗體的細(xì)胞， 即將包被了人HBsAg的聚苯乙烯珠與待測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清 培育，然后用磷酸緩沖液洗滌34次，加入用生物素偶聯(lián)的 HBsAg培育后洗滌，再加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素培育，最 后用鄰苯二胺(OPD)顯色，經(jīng)酶標(biāo)儀定量測(cè)定，以確定產(chǎn)生 抗HBsAg單抗的陽(yáng)性孔。 經(jīng)檢測(cè)確定為產(chǎn)生抗HBsAg單抗的陽(yáng)性孔細(xì)胞需進(jìn)行克隆 和再克隆，井經(jīng)全面鑒定與分析，最后才能獲得產(chǎn)生抗 HBsAg單抗的雜交瘤克隆系。其過(guò)程如下： 將陽(yáng)性孔中的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)常規(guī)消化分散法制成細(xì)胞懸浮 液，計(jì)數(shù)，用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液依次稀釋成 5X104細(xì)胞ml，5X103細(xì)胞ml、5X102細(xì)胞m1及 5X10細(xì)胞ml細(xì)胞懸液， 然后在已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板的第1一3行中，