生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題答案

1、生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)大綱一、名詞解釋：1、生物藥物：是指利用各種生物材料，綜合采用各種生物技術(shù)的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制品。2、抗生素：由微生物產(chǎn)生，在低濃度下能殺滅和抑制病原體，但對宿主不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用的物質(zhì)，或使用化學(xué)方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。廣義的抗生素還包括一些抗腫瘤藥、殺蟲劑和除草劑。 3、補(bǔ)料分批發(fā)酵： 是指將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間之后，間歇式地、或者連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的方法。4、限制性內(nèi)切酶：生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈dna序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來的dna切斷的酶，即能夠限制異源dna的侵入并使之

2、失去活力，但對自己的dna卻無損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在dna分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶。 5、載體：將外源目的dna導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。 6、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：正常細(xì)胞經(jīng)過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程，失去正常細(xì)胞的特點(diǎn)而獲得無限增殖能力的細(xì)胞系。7、微載體培養(yǎng)：將細(xì)胞吸附于微載體表面，再在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面生長成單層的方法稱為微載體培養(yǎng)法。8、毛狀根： 受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染后形成的根組織，易于培養(yǎng)，改變了植物的次生代謝。毛狀根生長快速和次級代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級代謝產(chǎn)物。9、氣升式

3、反應(yīng)器：沒有攪拌，氣體通過噴管進(jìn)入剪切力更小，主要用于懸浮細(xì)胞的分批式培養(yǎng)，近年開發(fā)用于貼壁細(xì)胞的微載體培養(yǎng)，并進(jìn)行半連續(xù)、連續(xù)和灌流式培養(yǎng)。10. 酶固定化： 指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶（細(xì)胞）限制或固定于特定空間位置，使之不但能連續(xù)發(fā)揮催化作用，而且反應(yīng)后酶又可以反復(fù)利用的技術(shù)。11. 抗體酶：又稱催化抗體，是指通過一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)特性，還類似于酶，能催化某種反應(yīng)。12. 微生物轉(zhuǎn)化：是通過微生物細(xì)胞將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,也就是利用微生物謝過程中產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對底物特定部位(基團(tuán))進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)催化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化

4、成結(jié)構(gòu)相似的更有價(jià)值的新化合物。13. 多克隆抗體：給動(dòng)物接種天然抗原所獲得的免疫血清或抗血清，是多種抗體的混合物, 它是由多種抗原決定簇刺激多株b細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的, 稱為多克隆抗體。14. 單克隆抗體： 通過b細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。15. 基因工程抗體：基因工程抗體：將抗體的基因按不同需要進(jìn)行改造和重組，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，便產(chǎn)生了第三代抗體基因工程抗體。16. 基因工程多肽疫苗： 利用基因工程技術(shù)制備抗原成分的亞單位的疫苗稱為基因工程多肽疫苗。17. dna疫苗：dna疫苗又稱核酸疫苗、基因疫苗，是通過基因重組技術(shù)把

5、編碼抗原蛋白的基因序列克隆到質(zhì)粒，并在基因的上游加上細(xì)胞可以識(shí)別的啟動(dòng)子，形成一個(gè)表達(dá)載體，將這個(gè)表達(dá)載體dna直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，由細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)直接合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，達(dá)到防病治病目的。18. 基因治療：廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。19. 細(xì)胞治療技術(shù)： 將患者自身細(xì)胞在體外進(jìn)行處理后回輸體內(nèi)進(jìn)行治療的方法。 20. 生化藥物：所謂生化藥物是指以天然的動(dòng)物、植物、微生物等生物體組織和器官為原料，通過化學(xué)方法進(jìn)行提取、精制或者用化工合成方法制成的內(nèi)源性生理生化物質(zhì)，用于預(yù)防、治療、診斷疾病。

6、包括由上述這些已知藥物加以結(jié)構(gòu)改造或人工合成創(chuàng)造出的自然界所沒有的新藥物。二、簡答題 1. 簡述生物藥物新藥的研發(fā)流程。答：新藥研究和開發(fā)的主要過程：(1) 確定研究計(jì)劃； (2) 準(zhǔn)備候選菌株； (3) 選擇合適藥理模型初篩（搖瓶）、復(fù)篩（小型發(fā)酵）體外試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)；(4) 提純有效成分進(jìn)行化學(xué)分析 ； (5) 精制樣品（中型發(fā)酵）；(6) 臨床前期(preclinical ) ；(7) 期臨床 (preclinical i)；(8) 期臨床 (preclinical )；(9) 期臨床 (preclinical )；(10) 注冊申請上市、試生產(chǎn) ； (11) 售后監(jiān)測(postmark

7、eting surveillance)。2. 簡述生物藥物的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。答：生物藥物是指利用各種生物材料，綜合采用各種生物技術(shù)的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制品。優(yōu)點(diǎn)：（1） 用量少，藥理活性高；（2）特異性強(qiáng)，治療的生理生化機(jī)制合理，療效可靠；（2） 毒副作用小、價(jià)值高；（3） 缺點(diǎn)：（1）成分復(fù)雜：大多數(shù)是混合物；（2）不穩(wěn)定：易變性，易失活，易降解。（3）提取純化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)技術(shù)難度高；（4）生理副作用常有發(fā)生。3. 給出下列生物藥物的中文名稱: ifn；tnf；il；g-csf；epo；gm-csf；r-sk；r-sak；gh；egf；bfgf；rhtpo；t-pa；s

8、rm 答：ifn （人-干擾素）；tnf （腫瘤壞死因子）；il （白細(xì)胞介素）；g-csf （粒細(xì)胞集落刺激因子）；epo （促紅細(xì)胞生成素）；gm-csf （粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子）；r-sk （重組鏈激酶）；r-sak （重組葡激酶）；gh （生長激素）；egf （表皮細(xì)胞生長因子）；bfgf （堿性成纖維細(xì)胞生長因子）；rhtpo （重組人血小板生成素）；t-pa（ 組織纖溶酶激活劑）；srm （生長激素釋放抑制素）。 4. 簡述微生物發(fā)酵制藥的基本流程。答：微生物發(fā)酵制藥基本流程：菌種選育（自然界選種、誘變育種、基因工程、細(xì)胞工程）培養(yǎng)基配制（根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實(shí)踐中需多

9、次試驗(yàn)配方）滅菌（殺滅雜菌（胞體、孢子及芽孢）擴(kuò)大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過程（檢測進(jìn)程，滿足營養(yǎng)需要；嚴(yán)格控制溫度、ph、溶氧、轉(zhuǎn)速等）分離純化（菌體：過濾、沉淀；代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換）5、 簡述基因工程操作流程答：基因工程的操作流程：（1）分：分離目的基因；（2）切：對目的基因和載體適當(dāng)切割；（3）接：目的基因與載體連接；（4）轉(zhuǎn)：重組dna轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；（5）篩：篩選出含有重組體的受體細(xì)胞；（6）表：目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，受體細(xì)胞成長為基因改造生物。 6. 簡述化學(xué)修飾藥用酶的新特征。答：藥用酶修飾后所具有的新特征：（1）對熱的穩(wěn)定性有所提高。（2）具有對抗各類失活因子的能力。（3）

10、抗原性消除。（4）體內(nèi)的半衰期有所延長。（5）最適ph值發(fā)生改變。（6）酶反應(yīng)特性發(fā)生變化。（7）在人體組織中的分布能力發(fā)生變化，有利于被靶器官選擇性的吸收。 7. 簡述固定化酶生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 答：固定化酶生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)：（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化；（3）反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少。缺點(diǎn)：（1）固定化過程中，可能會(huì)引起酶活性喪失；（2）只適用于催化可溶性小分子底物的酶促反應(yīng)，對大分子底物不適合；（3）通常不適用于多酶反應(yīng)，尤其是需要輔助因

11、子參與的反應(yīng)。 8. 簡述單克隆抗體制備的過程。答：單克隆抗體的制備： 用抗原免疫小鼠 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 免疫脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 在peg作用下合成雜交瘤細(xì)胞 選擇培養(yǎng)基（融合的細(xì)胞死亡，雜交瘤細(xì)胞存活） 陽性克隆的篩選機(jī)克隆化 克隆擴(kuò)增及大量制備mcab 9. 簡述轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn)。答：優(yōu)點(diǎn)：（1）價(jià)格便宜，易形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模；（2）安全，使用方便；（3）植物具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。 缺點(diǎn)：（1） 表達(dá)量偏低；（2）免疫效果較差；（3）糖基化不可靠性、生物安全性和公眾接受性以及工業(yè)化技術(shù)問題；（4）目前轉(zhuǎn)基因植物普遍存在基因沉默或不穩(wěn)定表達(dá)的現(xiàn)象。10. 簡述動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器優(yōu)

12、點(diǎn)及制作過程。答：哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：（1）通過乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時(shí)也容易提純。（2）乳腺是一個(gè)外分泌器官，乳汁不會(huì)參與體內(nèi)循環(huán)，也不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身的生理代謝過程。（3）乳汁所表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)過修飾加工之后，具有穩(wěn)定的生物活性。（4）對于牛、羊這些大量分泌乳汁的動(dòng)物來說，動(dòng)物本身就相當(dāng)于一座大型的藥物工廠。動(dòng)物乳腺反應(yīng)器制作：藥用蛋白基因 表達(dá)細(xì)胞株 細(xì)胞核供體動(dòng)物 受精卵 無核受精卵 組裝的核細(xì)胞 胚胎藥用蛋白 乳汁雌性 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 動(dòng)物幼崽 假孕動(dòng)物 受體動(dòng)物三、設(shè)計(jì)題 請?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)基因工程藥物的生產(chǎn)工藝流程（應(yīng)包括工程菌構(gòu)建、擴(kuò)大培養(yǎng)方法、產(chǎn)物分離純化、質(zhì)量檢測等

13、環(huán)節(jié)）。答：干擾素a-2b 的制備干擾素（inf）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等等作用,是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分,干擾素（inf）最早被用于誘導(dǎo)人體產(chǎn)生白細(xì)胞。（1） 基因工程菌的組建誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸 通過寡dt-纖維素柱提取mrna pbr322質(zhì)粒 5%-23%蔗糖密度梯度離心提取12s-mrna psti內(nèi)切酶切割 由mrna轉(zhuǎn)錄成cdna 切割段位于內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi) 結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素雙鏈cdna用末端psti酶切割 再用dna轉(zhuǎn)移酶接上dt或者dg 在pbr322質(zhì)粒dna的切割段加上da或者dc + 退火獲

14、得雜交質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌k-12擴(kuò)增雜交質(zhì)粒 篩選能夠抗四環(huán)素、但是對氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株 采用雜交翻譯法挑選含有干擾素cdna的克隆 將干擾素cdna克隆進(jìn)表達(dá)載體 在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá) （進(jìn)入下游工藝）（2） 基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)人干擾素a-2b的基因工程菌為sw-ifna-2b/e.colidh5a。質(zhì)粒使用pl啟動(dòng)子，含有四環(huán)素抗性基因。種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%nacl 基因工程菌接種到4個(gè)1000ml三角燒瓶之中，每個(gè)燒瓶內(nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30搖床培養(yǎng)10小時(shí)，作為發(fā)酵罐的種子 用15l發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10l 攪拌轉(zhuǎn)速500

15、r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%30發(fā)酵8小時(shí)，42誘導(dǎo)2-3小時(shí) 鑒控手段：每隔不同時(shí)間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。（3） 干擾素的制備 發(fā)酵物質(zhì)4000r/min離心30min，除去上清液，得濕菌，從其中取100g。懸浮于20mmol/l磷酸緩沖液（ph=7.0）500ml之中，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。 4000r/min離心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室溫條件下，進(jìn)行攪拌抽提2小時(shí) 提取液15000r/min離心30min，下層不溶棄去。取上清液，用20mmol/l磷酸緩沖液（ph=7.0）稀釋至尿素

16、濃度0.5mol/l 加入0.1mmol/l二巰基蘇糖醇，4攪拌15小時(shí)。15000r/min離心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相對分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮 濃縮液采用sephadex g50層析柱分離，層析柱2cm*100cm、先用20mmol/l磷酸緩沖液（ph=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫分離 收集人干擾素a-2b部分，用sds-page檢查。再經(jīng)de-52柱進(jìn)行純化層析柱2cm*50cm、上柱之后，分別采用含有0.05mol/l、0.10mol/l、0.15mol/l的nacl的20mmol/l磷酸緩沖液（ph=7.0）洗滌。 收集含有收集人干

17、擾素a-2b部分。分裝凍干成品鑒定成品包裝。（4） 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求（1） 半成品檢定-13項(xiàng)指標(biāo)1、 干擾素效價(jià)測定；2、蛋白質(zhì)含量測定；3、比活性測定；4、純度測定；5、相對分子量測定；6、殘余外源性dna含量測定；7、殘余抗生素活性測定；8、紫外光譜掃描；9、肽圖測定；10、等電點(diǎn)測定；11、無菌試驗(yàn)；12、熱原質(zhì)試驗(yàn)。（2）成品檢定-7項(xiàng)指標(biāo)1、物理性狀；2、鑒別試驗(yàn)；3、水分測定；4、無菌試驗(yàn)；5、熱原質(zhì)試驗(yàn)；6、干擾素效價(jià)測定；7、安全試驗(yàn)。四、論述題 查閱資料，結(jié)合你的專業(yè)和興趣，請談?wù)勀撤N生物藥物生產(chǎn)工藝國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀，你認(rèn)為存在哪些技術(shù)問題，請?zhí)峁┫鄳?yīng)的解決方案。答：青

18、霉素的生產(chǎn)工藝國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀： 青霉素屬于-內(nèi)酯類抗生素,能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，可從青霉菌的培養(yǎng)液中提制，對大多數(shù)的革蘭氏陽性菌引起的疾病都具有明顯的治療效果。我國生產(chǎn)青霉素一部分用作醫(yī)療，有少部分可以先分裂后用來合成新青霉素或半合成青霉素。青霉素的生產(chǎn)，包括發(fā)酵過程，發(fā)酵過程的控制以及青霉素的提煉。提煉過程一般是預(yù)處理、過濾、萃取、脫色、結(jié)晶。最終得到青霉素產(chǎn)品。青霉素鈉的提取工藝有溶媒萃取工藝和離子交換工藝。溶媒萃取是利用青霉素在不同的ph條件下，會(huì)以不同的狀態(tài)存在，從而在水和有機(jī)溶劑中具有不同溶解度，通過多次萃取分離即可達(dá)到分離提純的目的。離子交換工藝采用陽離子交換樹脂作為交換劑，將青霉素

19、鉀鹽交換為青霉素鈉鹽。目前國內(nèi)大多數(shù)廠家采用混合槽或靜態(tài)混合器進(jìn)行混合萃取。但是這種裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，拆洗困難，使用不方便。80年代初，已有部分西方國家開始將德國傾析機(jī)應(yīng)用于青霉素生產(chǎn)并取得成功。近幾年，國內(nèi)已有廠家開始引進(jìn)新型的集過濾、洗滌、干燥為一體的“三合一”全密閉生產(chǎn)設(shè)備。國外制藥技術(shù)發(fā)展迅速，由于涉及技術(shù)保密，難以參考到有關(guān)方面的資料。我認(rèn)為存在的技術(shù)問題及解決方案有：（1） 發(fā)酵過程成本高、能耗大。采用計(jì)算機(jī)青霉素發(fā)酵過程建模的方法對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化；（2） 發(fā)酵單位需進(jìn)一步提高?？梢詮木N選育及發(fā)酵過程上進(jìn)一步提高發(fā)酵單位；（3） 菌絲生長后期，酶易失活，糖類轉(zhuǎn)化為抗生素的效率較低。

20、采用固定化細(xì)胞或固定化全酶的方法改進(jìn)發(fā)酵；（4） 發(fā)酵罐接種工藝存在的問題無法充分發(fā)揮某些菌種的優(yōu)良特性。使用混合接入種源法改良接種工藝；目前所使用的過濾設(shè)備過濾面積小，產(chǎn)能小，在某些條件下收率低。增加鼓式過濾機(jī)和熱交換器提高收率及濾液質(zhì)量實(shí)現(xiàn)膜萃取分離的方法。 芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈

21、蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂

22、肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃

23、芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖

24、莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈

25、肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁莃羀聿芀蒆螃羅艿薈羈袁羋蝕螁膀莇莀薄肆莆蒂蝿羂莆蚅薂羈蒞莄袈襖莄蕆蟻膂莃蕿袆肈莂蟻蠆羄莁莁襖袀蒀蒃蚇腿蒀薅袃肅葿螈蚅肁蒈蕆羈羇肄薀螄袃肄螞罿膂肅莂螂肈肂蒄羈羄膁薆螀袀膀蠆薃膈腿莈蝿膄膈薁蟻肀膈蚃袇羆膇莂蝕袂膆蒅裊膁膅薇蚈肇芄蠆袃羃芃荿蚆衿節(jié)薁袂裊節(jié)蚄螅膃芁