載脂蛋白E基因敲除小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化

1、載脂蛋白E基因敲除小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化成纖維細(xì)胞作為動(dòng)脈外膜最主要的細(xì)胞成分，在環(huán)境因素發(fā)生改變時(shí)具有調(diào)整其表型的能力。在血管內(nèi)皮損傷的模型中，外膜表現(xiàn)出了顯著增厚，其主要就是由于外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞聚集引起的。但是關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化早期血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的報(bào)道甚少，本研究將通過(guò)整體動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)觀察載脂蛋白E基因敲除(ApoE/)小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化，探討血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?cè)谠缙趧?dòng)脈粥樣硬化病灶形成中的作用。1、材料與方法1.1主要材料6周齡ApoE/小鼠和C57BL/6鼠購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibicol公司

2、。兔多克隆抗體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)購(gòu)于美國(guó)SantaCruz公司;抗小鼠波形蛋白(vimentin)抗體、抗小鼠結(jié)蛋白(desmin)抗體及抗小鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SM-actin)抗體購(gòu)于美國(guó)NeoMarkers公司;鼠組織免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于福州邁新試劑公司;兔即用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司;鏈霉親和素-生物素-異硫氰酸酯(streptavidin-biotincomplex-fluor

3、esceineisothiocya-nate，SABC-FITC)及鏈霉親和素-生物素-cy3(streptavidin-biotincomplex-cy3，SABC-cy3)試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。DAPI購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。1.2標(biāo)本制備6周齡ApoE/小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分別給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料84.75%，飽和脂肪15%，膽固醇0.25%)喂養(yǎng)2周、4周和8周。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后取升主動(dòng)脈用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制備連續(xù)切片。1.3免疫組織化學(xué)染色選取部分切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)α-SM-actin和Vimentin的表達(dá)，按鼠組織免疫組織化

4、學(xué)試劑盒說(shuō)明書操作。按兔即用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)Desmin的表達(dá)。部分切片進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)TGF-β1的表達(dá)，按SABC-cy3試劑盒說(shuō)明書操作，顯微鏡下觀察采集圖像。1.4血管外膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)6周齡野生型C57BL/6小鼠和ApoE/小鼠，高脂喂養(yǎng)2周后，頸椎脫臼處死，無(wú)菌開(kāi)胸取出整條主動(dòng)脈，仔細(xì)清除血細(xì)胞及血管周圍脂肪組織，解剖顯微鏡下小心剝離外膜。用眼科剪將組織剪碎成約1mm3小塊，接種到培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37、5%CO2干涸培養(yǎng)24h待組織塊貼牢后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)靜置培養(yǎng)，觀察大部分組織塊周圍爬出細(xì)胞，融合成片時(shí)，用0.

5、25%胰蛋白酶消化并采用差速貼壁法純化兩次。選取第35代細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.5免疫熒光染色檢測(cè)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中Vi-mentin、α-SM-actin和Desmin的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%的胰酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108cells/L，接種于帶爬片的6孔板中，靜置培養(yǎng)48h待細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)后，血清饑餓24h，然后更換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，取出細(xì)胞爬片。PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定20min。然后PBS沖洗3遍，3%過(guò)氧化氫室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。之后Vimentin免

6、疫熒光染色按SABC-FITC試劑盒進(jìn)行，α-SM-actin及Desmin免疫熒光染色按SABC-cy3試劑盒進(jìn)行。1.6透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109cells/L，接種于新培養(yǎng)瓶中，后靜置培養(yǎng)48h待細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，血清饑餓24h，更換含10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后收集細(xì)胞約(1520)×106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色后透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。1.7WesternBlot檢測(cè)α-SM-actin及TGF-

7、β1蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞加入100μL細(xì)胞裂解液，冰上孵育20min，10000×g離心5min，取各組細(xì)胞的裂解液10μL，各加入5μL上樣緩沖液，混勻。水中煮沸35min，10000×g離心1min，冰上放置，上樣。經(jīng)電泳、考馬斯亮蘭染色、脫色，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗α-SM-actin或TGF-β1，4雜交過(guò)夜。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37孵育1h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色。結(jié)果作半定量分析。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)結(jié)果均用x±s表示，采用軟件SPSS11.5進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P0.05

8、表示差異有顯著性。2、結(jié)果2.1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)血管外膜α-SM-actin的表達(dá)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ApoE/小鼠血管外膜大部分細(xì)胞呈現(xiàn)Vimentin陽(yáng)性表達(dá)，Desmin始終呈陰性，而中膜細(xì)胞對(duì)Vimentin、Desmin、α-SM-actin三種單抗均呈陽(yáng)性反應(yīng)。高脂喂養(yǎng)2周的ApoE/小鼠血管外膜部分細(xì)胞檢測(cè)到α-SM-actin陽(yáng)性表達(dá)，此時(shí)并無(wú)可見(jiàn)內(nèi)膜病灶形成，高脂喂養(yǎng)4周后內(nèi)膜出現(xiàn)泡沫細(xì)胞，血管外膜α-SM-actin陽(yáng)性表達(dá)增多，但8周后外膜α-SM-actin呈弱陽(yáng)性表達(dá)，此時(shí)內(nèi)膜動(dòng)脈粥樣硬化病灶進(jìn)一步發(fā)展，內(nèi)膜&a

9、lpha;-SM-actin表達(dá)呈陽(yáng)性。而C57BL/6小鼠血管外膜細(xì)胞只檢測(cè)到Vimentin陽(yáng)性表達(dá)，始終未檢測(cè)到α-SM-actin陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。2.2免疫熒光染色檢測(cè)TGF-β1表達(dá)6周齡ApoE/小鼠(高脂喂養(yǎng)前)和各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的C57BL/6小鼠主動(dòng)脈外膜細(xì)胞均無(wú)TGF-β1的表達(dá)，高脂喂養(yǎng)2周后，ApoE/小鼠主動(dòng)脈外膜細(xì)胞呈現(xiàn)TGF-β1弱陽(yáng)性表達(dá)。高脂喂養(yǎng)4周后，主動(dòng)脈外膜細(xì)胞TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)，此時(shí)內(nèi)膜損傷處呈現(xiàn)TGF-β1弱表達(dá)，高脂喂養(yǎng)8周后主動(dòng)脈外膜和內(nèi)膜損傷處呈現(xiàn)TGF-β1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2

10、)。2.3免疫熒光染色檢測(cè)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞Vim-entin、α-SM-actin和DesminApoE/小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞除了Vimen-tin染色陽(yáng)性外，還有部分細(xì)胞表現(xiàn)為α-SM-actin染色陽(yáng)性，但Desmin染色一直呈陰性。C57BL/6小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞僅表現(xiàn)為Vimentin染色陽(yáng)性，而Desmin和α-SM-actin均呈陰性反應(yīng)(圖3)。2.4透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)C57BL/6小鼠血管外膜細(xì)胞主要表現(xiàn)出典型成纖維細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈梭形或者不規(guī)則形，有多個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)突起，核為卵圓形，偶見(jiàn)微管微絲。而ApoE/小鼠血管外膜細(xì)胞有

11、部分細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可見(jiàn)肌絲明顯增多，呈現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞的特征(圖4)。2.5α-SM-actin及TGF-β1蛋白的表達(dá)ApoE/小鼠成纖維細(xì)胞α-SM-actin(5.102±0.896)及TGF-β1(7.573±1.043)蛋白表達(dá)水平都明顯高于C57BL/6小鼠(0.126±0.521和0.279±0.769)，差異有顯著性(P0.05;圖5)。3、討論血管外膜長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為只是充當(dāng)內(nèi)皮損傷始動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成的配角;，隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示外膜可以通過(guò)由外而內(nèi)

12、的作用影響血管中膜及內(nèi)膜。外膜是多種血管活性因子的主要來(lái)源，是血管重塑過(guò)程中的重要參與者。血管外膜發(fā)生的變化(如結(jié)締組織生成增多、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞改變等)可能是即將發(fā)生的血管疾病的信號(hào)。在對(duì)損傷的反應(yīng)過(guò)程中，外膜細(xì)胞可表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)和功能行為，有報(bào)道在中度和重度球囊損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭型饽さ某衫w維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。動(dòng)脈損傷后早期血管外膜成纖維細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和增殖活性改變參與并促進(jìn)了血管橋再狹窄的發(fā)生過(guò)程。在移植性血管病模型中發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜增生之前外膜即出現(xiàn)大量a-SM-actin陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞。但是關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化早期血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的報(bào)道甚

13、少。本實(shí)驗(yàn)觀察了ApoE/小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成過(guò)程中血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)2周和4周后的ApoE/小鼠血管外膜細(xì)胞發(fā)生了表型改變，其在逐漸獲得α-SM-actin表達(dá)的同時(shí)，Desmin染色持續(xù)陰性，Vimentin則持續(xù)呈陽(yáng)性表達(dá)。Vimentin為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，Desmin則是高分化平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物，結(jié)果顯示所測(cè)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，并表現(xiàn)出向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特征。體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞結(jié)果也證實(shí)ApoE/小鼠血管外膜部分細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可見(jiàn)肌絲明顯增多，呈現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞的特征。免疫熒光染色除Vimentin染色陽(yáng)性外，還有部分細(xì)胞表現(xiàn)為&a

14、lpha;-SM-actin染色呈陽(yáng)性，但Desmin染色一直呈陰性，結(jié)果說(shuō)明ApoE/小鼠血管外膜細(xì)胞仍保持了成纖維細(xì)胞的表型特點(diǎn)，但有部分轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，而非典型平滑肌細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞是一種具有平滑肌細(xì)胞樣特點(diǎn)的成纖維細(xì)胞。它也能分泌細(xì)胞外基質(zhì)和多種生物活性因子參與組織修復(fù)，一旦創(chuàng)傷愈合，肌成纖維細(xì)胞迅速回轉(zhuǎn)到成纖維細(xì)胞或進(jìn)入凋亡。本研究結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)8周后的ApoE/小鼠血管外膜呈現(xiàn)α-SM-actin弱陽(yáng)性表達(dá)，這可能表示肌成纖維細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，或又轉(zhuǎn)為成纖維細(xì)胞，或進(jìn)入凋亡。許多生長(zhǎng)因子，如血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、TGF-β、腫瘤壞死因子&alph

15、a;(TNF-α)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等都參與了成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程。其中TGF-β1參與了多種細(xì)胞的增殖及分化，其可誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。大鼠肺動(dòng)脈高壓的肺組織中TGF-β1表達(dá)水平也顯著增高。TGF-β1是目前公認(rèn)的能直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因子。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到ApoE/小鼠隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，主動(dòng)脈外膜TGF-β1的表達(dá)增加，從而促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示ApoE/小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯高于C57BL/6小鼠。成纖

16、維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后又會(huì)分泌基質(zhì)蛋白、細(xì)胞因子等，進(jìn)行大量增殖，并且遷移到新生內(nèi)膜中，可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。增多的細(xì)胞外基質(zhì)又可進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化來(lái)參與血管重塑。因此成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后將有助于動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成。本研究結(jié)果提示動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成早期血管外膜成纖維細(xì)胞即出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞的特性，從而影響外膜和血管中膜及內(nèi)膜之間的交互對(duì)話，參與動(dòng)脈粥樣硬化病灶的形成及進(jìn)展，這可能成為抑制不良血管重塑的干預(yù)靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1Jin X，F(xiàn)u GX，Li XD，et al Expression and function ofosteoponti

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