蛋白質分析鑒定

1、1 第六章第六章 蛋白質的分析和鑒定技術蛋白質的分析和鑒定技術 2 第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質的物理化學性質分析蛋白質的物理化學性質分析 3 蛋白質由氨基酸構成，具有氨基酸蛋白質由氨基酸構成，具有氨基酸 的一些功能基團，保留了一些氨基酸的的一些功能基團，保留了一些氨基酸的 性質，但又發(fā)生了質的變化，具備一些性質，但又發(fā)生了質的變化，具備一些 氨基酸沒有的性質。氨基酸沒有的性質。 4 、 蛋白質的兩性解離和等電點蛋白質的兩性解離和等電點 兩性解離：蛋白質是兩性電解質，解離情況兩性解離：蛋白質是兩性電解質，解離情況 比氨基酸復雜得多。比氨基酸復雜得多。 在特定的在特定的pH值范圍內，蛋白質解離產生帶正值

2、范圍內，蛋白質解離產生帶正 電荷或負電荷的基團，分折蛋白質的滴定曲電荷或負電荷的基團，分折蛋白質的滴定曲 線可得到各解離基團的線可得到各解離基團的PK值值 5 等電點等電點pI 指某一指某一pH值時，蛋白質所帶正負電荷恰好相等值時，蛋白質所帶正負電荷恰好相等 ，凈電荷為，凈電荷為0，此時溶液的，此時溶液的pH值稱為等電點。值稱為等電點。 蛋白質分子所帶電荷的性質和數量由蛋白質分蛋白質分子所帶電荷的性質和數量由蛋白質分 子中可解離基團的種類和數目、溶液子中可解離基團的種類和數目、溶液pH值所決定。值所決定。 pH大于大于pI，蛋白質帶負荷，電場中向陽極移動蛋白質帶負荷，電場中向陽極移動 pH=p

3、I，電場中不移動，蛋白質沉淀出，此時導電場中不移動，蛋白質沉淀出，此時導 電率、滲透壓、粘度等均達最低值。電率、滲透壓、粘度等均達最低值。 pH小于小于pI， 蛋白質分子帶正電荷，電場向陰極蛋白質分子帶正電荷，電場向陰極 移動。移動。 6 蛋白質的等離子點（特征常數）：蛋白質的等離子點（特征常數）： 指在純水中（即沒有其它鹽類存在）指在純水中（即沒有其它鹽類存在） 蛋白質的正離子數等于負離子數的蛋白質的正離子數等于負離子數的pH值值 。因蛋白質的等電點不是一成不變的，它。因蛋白質的等電點不是一成不變的，它 隨溶劑性質、離子強變等因素而改變。隨溶劑性質、離子強變等因素而改變。 7 二、蛋白質分子

4、的大小二、蛋白質分子的大小 相對分子質量相對分子質量Mr從一萬到幾百萬或更從一萬到幾百萬或更 大，對大，對Mr的測定，按性質分兩類：的測定，按性質分兩類： 1.根據化學組成測定最低相對分子量根據化學組成測定最低相對分子量 利用化學分析定量測定蛋白質中某利用化學分析定量測定蛋白質中某 一特殊元素的含量，并假定蛋白質分子一特殊元素的含量，并假定蛋白質分子 中含中含1個這種元素，個這種元素， 8 2. 用物理化學方法來測定蛋白質的相對用物理化學方法來測定蛋白質的相對 分子質量分子質量 是目前常用的方法，包括測定質點是目前常用的方法，包括測定質點 的：擴散系數、沉降超離心、凝膠過濾的：擴散系數、沉降超

5、離心、凝膠過濾 、滲透壓等。、滲透壓等。 滲透壓測定法最為方便，但準確度滲透壓測定法最為方便，但準確度 較差，超離心法最為準確，但需昂貴的較差，超離心法最為準確，但需昂貴的 超速離心機，超速離心機， 9 三、三、 蛋白體的膠體性質蛋白體的膠體性質 膠體：指質點大小在膠體：指質點大小在1nm-100nm范圍內所構成范圍內所構成 的分散系統(tǒng)的分散系統(tǒng) 蛋白分子直徑蛋白分子直徑2nm-20nm，其溶液是膠溶液并其溶液是膠溶液并 且其分子表面分布有親水氨基酸的極性且其分子表面分布有親水氨基酸的極性R基，是一種基，是一種 親水膠體，具有親水膠體的性質：親水膠體，具有親水膠體的性質： 1、 具有半通透性具

6、有半通透性 2、丁達爾效應、丁達爾效應 3、布朗運、布朗運 動等動等 。 10 蛋白質相對分子質量大，在溶液中形成蛋白質相對分子質量大，在溶液中形成 的顆粒大，不能通過半透膜。的顆粒大，不能通過半透膜。 透析透析：利用蛋白質不能通過半透膜的性：利用蛋白質不能通過半透膜的性 質將其與小分子物質分開的分離質將其與小分子物質分開的分離方法方法 11 四、蛋白質的沉淀作用四、蛋白質的沉淀作用 蛋白質保持穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，這蛋白質保持穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，這 種穩(wěn)定性主要由兩因素決定：種穩(wěn)定性主要由兩因素決定： 1、 水化作用水化作用 存在有極性存在有極性R基（基（NH2、COOH、 OH等），故蛋白質

7、分子表面結合有一層等），故蛋白質分子表面結合有一層 水分子，稱為水化膜，其可防止分子互碰水分子，稱為水化膜，其可防止分子互碰 而聚集。而聚集。 12 2 、電荷排斥作用、電荷排斥作用 蛋白質是兩性分子，一定蛋白質是兩性分子，一定pH值下，分子值下，分子 帶相同電荷，同性電荷互斥，使分子不能聚帶相同電荷，同性電荷互斥，使分子不能聚 集。集。 由此，改變穩(wěn)定性的條件，蛋白質的穩(wěn)由此，改變穩(wěn)定性的條件，蛋白質的穩(wěn) 定性被破壞，從溶液中沉淀出來：定性被破壞，從溶液中沉淀出來： a 加入脫水劑除去水膜加入脫水劑除去水膜 b 使使pH=pI c 加入電解質使質點表面失去同種電荷。加入電解質使質點表面失去同

8、種電荷。 13 五、蛋白質的變性作用五、蛋白質的變性作用 天然蛋白質受到理化因素的影響，天然蛋白質受到理化因素的影響， 氫鍵、鹽鍵等次級鍵維系的高級結構遭氫鍵、鹽鍵等次級鍵維系的高級結構遭 到破壞，分子內部結構發(fā)生改變，致使到破壞，分子內部結構發(fā)生改變，致使 生物學生物學 性質、理化性質改變的現象。性質、理化性質改變的現象。 14 物理因素： 加熱、紫外線、X射線、超聲波 化學因素： 強酸、強堿、尿素、乙醇、三氯醋酸等 蛋白質變性后，結構雖有改變，但組成 成分和Mr沒有改變 15 六、蛋白質的顏色反應六、蛋白質的顏色反應 可作為蛋白質定性定量測定的依據可作為蛋白質定性定量測定的依據 16 1、

9、茚三酮反應、茚三酮反應(Ninhydrin Reaction) 氨基酸和水化茚三酮(苯丙環(huán)三酮戊烴)功 能時，產生藍色反應，由于蛋白質是由許多 氨基酸組成的，所以也呈此顏色反應。 17 2、雙縮脲反應、雙縮脲反應(Biuret Reaction) 蛋白質在堿性溶液中和硫酸銅功能呈現紫紅 色，稱雙縮脲反應。凡分子中含有兩個以上 CONH鍵的化合物都呈此反應，蛋白 質分子中氨基酸是以肽鍵相連，因此，所有 蛋白質都能和雙縮脲試劑發(fā)生反應。 18 3、米倫反應、米倫反應(Millon Reaction) 蛋白質溶液中加入米倫試劑(亞硝酸汞、硝酸 汞及硝酸的混和液)，蛋白質首先沉淀，加熱 則變?yōu)榧t色沉淀

10、，此為酪氨酸的酚核所特有 的反應，因此含有酪氨酸的蛋白質均呈米倫 反應。 19 第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質分析技術蛋白質分析技術 20 氨基酸序列分析氨基酸序列分析 電泳技術電泳技術 空間結構分析空間結構分析 生物質譜技術生物質譜技術 21 怎樣才能確定蛋白質分子的一級結構怎樣才能確定蛋白質分子的一級結構 呢？測定蛋白質的一級結構，就是要呢？測定蛋白質的一級結構，就是要 確定蛋白質多肽鏈中氨基酸殘基的排確定蛋白質多肽鏈中氨基酸殘基的排 列順序，其基本戰(zhàn)略是由列順序，其基本戰(zhàn)略是由Sanger開創(chuàng)開創(chuàng) 的肽鏈端基分析法與不同切點的肽片的肽鏈端基分析法與不同切點的肽片 段拼對法的巧妙結合。段拼對法的巧妙

11、結合。 22 確定蛋白質分子的一級結構，一般需確定蛋白質分子的一級結構，一般需 要經過以下步驟：要經過以下步驟： 純化待測的蛋白質分子，測定其分純化待測的蛋白質分子，測定其分 子量并確定分子中多肽鏈的數目。子量并確定分子中多肽鏈的數目。 對于由兩條及兩條以上多肽鏈組成對于由兩條及兩條以上多肽鏈組成 的蛋白質分子，則需將其拆開（斷的蛋白質分子，則需將其拆開（斷 裂二硫鍵）并單獨分離出來。裂二硫鍵）并單獨分離出來。 23 2. 分析多肽鏈的氨基酸組成。分析多肽鏈的氨基酸組成。 將多肽鏈用酸或酶完全水解，再用離子交換樹脂將多肽鏈用酸或酶完全水解，再用離子交換樹脂 （或用高效液相色譜）將各種氨基酸分離

12、開，測（或用高效液相色譜）將各種氨基酸分離開，測 定其含量并計算各種氨基酸組成的百分比。下圖定其含量并計算各種氨基酸組成的百分比。下圖 表示蛋白質的水解產物通過表示蛋白質的水解產物通過Moor-Stein Dowex 50 離子交換柱層析的自動分析結果。離子交換柱層析的自動分析結果。 24 3. 端基分析端基分析 分析確定多肽鏈的分析確定多肽鏈的N-末端和末端和C-末端氨基末端氨基 酸殘基，作為整條多肽鏈的標志點。酸殘基，作為整條多肽鏈的標志點。N- 末端測定多用二硝基氟苯法和丹磺酰氯末端測定多用二硝基氟苯法和丹磺酰氯 法，法，C-末端的測定可用肼解法和羧肽酶末端的測定可用肼解法和羧肽酶 法。

13、法。 25 26 5. 肽片段的氨基酸順序分析。肽片段的氨基酸順序分析。 采用采用Edman降解法，分別分析測定各肽片降解法，分別分析測定各肽片 段的氨基酸排列順序。該法用異硫氰酸苯酯段的氨基酸排列順序。該法用異硫氰酸苯酯 標記標記N-末端氨基酸殘基，然后將其水解并分末端氨基酸殘基，然后將其水解并分 離出來加以鑒定，剩余的肽片段回收后再進離出來加以鑒定，剩余的肽片段回收后再進 行下一個殘基的分析測定。如此循環(huán)操作，行下一個殘基的分析測定。如此循環(huán)操作， 就可以將一條肽片段的全部氨基酸順序排列就可以將一條肽片段的全部氨基酸順序排列 出來。出來。 27 電泳技術電泳技術 紙電泳紙電泳 醋酸纖維薄膜

14、電泳醋酸纖維薄膜電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE) (可分為圓盤電泳和垂直平板電泳）可分為圓盤電泳和垂直平板電泳） 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 等電聚焦等電聚焦(IEF) 雙向電泳雙向電泳 毛細管電泳毛細管電泳 28 在外加電場作用下，帶電的蛋白質顆粒在電場中移動在外加電場作用下，帶電的蛋白質顆粒在電場中移動 的速度（的速度（v）取決于電場強度取決于電場強度(E)，所帶的凈電荷所帶的凈電荷(q)， 蛋白質的分子量、分子形狀以及與介質的摩擦系數蛋白質的分子量、分子形狀以及與介質的摩擦系數(f)。 29 聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙

15、烯酰胺凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)是利用聚丙烯酰胺是利用聚丙烯酰胺 凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠是由單凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠是由單 體丙稀酰胺和交聯劑甲叉雙丙稀酰胺交聯而成的多體丙稀酰胺和交聯劑甲叉雙丙稀酰胺交聯而成的多 孔網狀凝膠?？拙W狀凝膠。 不連續(xù)不連續(xù)PAGE有分離膠、濃縮膠和樣品膠。有分離膠、濃縮膠和樣品膠。 PAGE分辨率很高。分辨率很高。 30 電泳過程電泳過程 31 SDS-聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳法電泳法 SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型 表面活性劑，

16、它能夠與蛋白質多肽鏈中表面活性劑，它能夠與蛋白質多肽鏈中 的氨基酸殘基按大約的氨基酸殘基按大約1 1.4比例結合。比例結合。 每一個蛋白質分子都因為結合了許多的每一個蛋白質分子都因為結合了許多的 SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質分而帶有大量的負電荷，而蛋白質分 子原有的電荷則可以忽略。該法主要利子原有的電荷則可以忽略。該法主要利 用了蛋白質分子量大小不同而分離蛋白用了蛋白質分子量大小不同而分離蛋白 質。質。 用已知分子量的蛋白質作為標準，則可以用已知分子量的蛋白質作為標準，則可以 估算出不同蛋白質的分子量。估算出不同蛋白質的分子量。 32 雙向電泳：雙向電泳： 2-DE技術依然是大多數蛋白質

17、組研究技術依然是大多數蛋白質組研究 中分離復雜蛋白質混合物的首選技中分離復雜蛋白質混合物的首選技 術術 。 33 雙向電泳分析中的樣品制備雙向電泳分析中的樣品制備 制備原則制備原則： 應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài) （包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可（包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可 重現性。重現性。 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修 飾（如酶性或化學性降解等）。飾（如酶性或化學性降解等）。 完全去除

18、樣品中的核酸和某些干擾蛋白。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而 保證待研究蛋白的可檢測性。保證待研究蛋白的可檢測性。 34 樣品的溶解樣品的溶解 是是2-DE成功分離蛋白質的最關鍵因素之一。成功分離蛋白質的最關鍵因素之一。 溶解的目標：溶解的目標： 1、樣品中非共價結合的蛋白質復合物和聚積體、樣品中非共價結合的蛋白質復合物和聚積體 完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則 樣品中結合牢固的蛋白復合物可能使樣品中結合牢固的蛋白復合物可能使2-DE中出中出 現新的蛋白點，

19、相應的表示單個多肽的點的強現新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強 度會下降）；度會下降）； 2、溶解方法必須允許可能干擾、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、分離的鹽、 脂類、多糖和核酸等物質的去除；脂類、多糖和核酸等物質的去除； 3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解 狀態(tài)。狀態(tài)。 35 增加樣品溶解性的手段增加樣品溶解性的手段 變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸 展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能 量域。其典型代表是尿素和硫

20、尿。量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性劑：經過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基表面活性劑：經過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基 團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。 常用的表面活性劑有離子去污劑常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑非離子去污劑 Triton X-100和和NP-40、兩性離子去污劑兩性離子去污劑CHAPS、 OBG等。其中等。其中CHAPS和和SB3-10最好。最好。 還原劑：在變性劑和表面活性劑聯用條件下，加用還還原劑：在變性劑和表面活性劑聯用條件下，加用還 原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。原

21、劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。 常用含自由巰基的常用含自由巰基的DTT或或 -巰基乙醇，以及不帶電荷巰基乙醇，以及不帶電荷 的三丁基膦（的三丁基膦（TBP）進行還原。進行還原。 36 起載體作用的兩性電解質：即便在變性劑和表起載體作用的兩性電解質：即便在變性劑和表 面活性劑存在的情況下，某些蛋白質也需要在面活性劑存在的情況下，某些蛋白質也需要在 鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否 則這些蛋白質在其處于則這些蛋白質在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。點時會發(fā)生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的的作用在于捕獲樣品中

22、的 少量鹽分，從而保證蛋白質的溶解性。應用時，少量鹽分，從而保證蛋白質的溶解性。應用時， 兩性電解質的濃度應小于兩性電解質的濃度應小于0.2（w/v)。濃度過濃度過 高會使高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的速度降低。另外，為了保證實驗 的精確性，在選擇不同的精確性，在選擇不同pH范圍的范圍的IPG膠條時，膠條時， 也應使兩性電解質的也應使兩性電解質的pH值與之相符合。值與之相符合。 37 一維固相一維固相pH梯度等電聚焦（梯度等電聚焦（IEF with IPG）：）： IPG膠的材料是膠的材料是Immobilines，為擁有為擁有CH2=CH- CO-NH-R結構的結構的8種丙烯酰胺

23、衍生物系列，其中種丙烯酰胺衍生物系列，其中R 包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在pH310 不同值的緩沖體系。根據公布的配方計算后，將不同值的緩沖體系。根據公布的配方計算后，將 適宜的適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，試劑添加至混合物中用于凝膠聚合， 在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯 酰胺骨架中而形成酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的梯度。通過這種方式生成的 IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn) 定的定的IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。分離達

24、到真正的平衡狀態(tài)。 38 39 40 41 IPG IEF 中中pH梯度的選擇梯度的選擇 常用方法：先寬后窄，先線性后非線常用方法：先寬后窄，先線性后非線 性，先短后長，預試驗確定。性，先短后長，預試驗確定。 42 兩維間的平衡兩維間的平衡 一維結束后可馬上進行二維電泳，也可保存一維結束后可馬上進行二維電泳，也可保存 在兩片塑料膜間于在兩片塑料膜間于80保存數月。保存數月。 但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以 便于被分離的蛋白質與便于被分離的蛋白質與SDS完整結合，從而完整結合，從而 在在SDS-PAGE是電泳能順利進行。是電泳能順利進行。 43 二維

25、二維SDS-PAGE 同普通同普通SDS-PAGE類似。類似。 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠， 因為在因為在IPG膠條中蛋白質區(qū)域已得到膠條中蛋白質區(qū)域已得到 濃縮，可以認為非限制性濃縮，可以認為非限制性IEF膠（低膠（低 濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠。濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠。 44 45 凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠的圖像處理分析和典型流程 凝膠圖像的掃描：凝膠圖像的掃描： 圖像加工：圖像加工： 斑點檢測和定量：斑點檢測和定量： 凝膠配比：凝膠配比： 數據分析：數據分析： 數據呈遞和解釋：數據呈遞和解釋： 2-DE數據庫的建立數據庫的建立： 4

26、6 雙向電泳的分類雙向電泳的分類 非變性非變性2D-PAGE：兩向均在非變性條件下兩向均在非變性條件下 進行，這樣分離的蛋白質點的等電點和表觀進行，這樣分離的蛋白質點的等電點和表觀 分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是 一樣的一樣的 非變性非變性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非變性第一向采用非變性 IEF，之后在之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也溶液中平衡；第二向也 在在SDS存在的條件下進行。適于分析非共價存在的條件下進行。適于分析非共價 鍵連接的蛋白蛋白間的相互作用。鍵連接的蛋白蛋白間的相互作用。 47 非變性非變性/還原還原/SDS-2D-

27、PAGE：非變性條件下非變性條件下IEF聚焦，聚焦， 之后用之后用8M尿素尿素5%-ME2%SDS進行平衡，再進行平衡，再 進行第二向進行第二向SDS-PAG電泳。此時分離的蛋白質點可電泳。此時分離的蛋白質點可 進行點的切取、蛋白酶消化、進行點的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分分 析鑒定，提供關于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。析鑒定，提供關于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。 變性變性2D-PAGE：樣品先用樣品先用2%SDS5%-ME95 變性變性5min，IEF在在8M尿素尿素1%NP-40條件下進行，條件下進行， 之后膠條用之后膠條用2%SDS5%-ME平衡，然后進行平衡，然后進行

28、SDS-PAGE。該技術適于該技術適于DNA序列和多肽結構的分序列和多肽結構的分 析，或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起析，或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起 的多肽結構微異質性，但此方式顯示的大于的多肽結構微異質性，但此方式顯示的大于100Kd 的蛋白質點少于第三種方式的蛋白質點少于第三種方式 48 毛細管電泳毛細管電泳 capillary electrophoresis 49 毛細管電泳毛細管電泳 capillary electrophoresis 是利用被分析離子在電場作用下移動是利用被分析離子在電場作用下移動 的速率不同而達到分離的目的，這種的速率不同而達到分離的目的，這種

29、 技術主要用來分析在毛細管緩沖溶液技術主要用來分析在毛細管緩沖溶液 中能離解為離子的物質。中能離解為離子的物質。 50 以毛細管為分離通道，高壓直流電以毛細管為分離通道，高壓直流電 場為驅動力的新型液相分析技術。場為驅動力的新型液相分析技術。 可將有生物化學意義的復雜化合物可將有生物化學意義的復雜化合物 在在的前提下進行分離的前提下進行分離 51 優(yōu)點優(yōu)點: 操作簡單，試樣量少，分離效操作簡單，試樣量少，分離效 率高，成本低等。率高，成本低等。 缺點：在遷移時間上的重現性，進樣缺點：在遷移時間上的重現性，進樣 的準確性和檢測靈敏度方面比高效的準確性和檢測靈敏度方面比高效 液相色譜法稍遜。液相色

30、譜法稍遜。 52 毛細管電泳的基本原理毛細管電泳的基本原理 離子的電泳遷移率不同，在電場中移動的速離子的電泳遷移率不同，在電場中移動的速 度不一樣，利用這個原理可以把不同的離度不一樣，利用這個原理可以把不同的離 子彼此分離。電泳遷移率與分析物質所帶子彼此分離。電泳遷移率與分析物質所帶 電荷呈正比，與摩擦阻力系數呈反比。如電荷呈正比，與摩擦阻力系數呈反比。如 果兩種物質帶有不同的電荷或者通過緩沖果兩種物質帶有不同的電荷或者通過緩沖 溶液移動的摩擦力不同，那么這兩種物質溶液移動的摩擦力不同，那么這兩種物質 可以彼此分離。可以彼此分離。 53 毛細管電泳裝置毛細管電泳裝置 54 毛細管電泳在蛋白質分

31、析的應用毛細管電泳在蛋白質分析的應用 分子量的測定分子量的測定 等電點的測定等電點的測定 肽譜分析（指紋圖）測定蛋白質的一級結肽譜分析（指紋圖）測定蛋白質的一級結 構構 遷移率的測定遷移率的測定 55 檢測方法檢測方法 紫外吸收、激光誘導熒光紫外吸收、激光誘導熒光 數據記錄數據記錄 參量：峰面積、峰高、參量：峰面積、峰高、 峰間距峰間距 56 蛋白質空間結構分析蛋白質空間結構分析 二級結構測定二級結構測定 通常采用通常采用圓二色光譜圓二色光譜(circular dichroism，CD) 測定溶液狀態(tài)下的蛋白質測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構二級結構含量。含量。 -螺旋的螺旋的CD峰有峰有222

32、nm處的負峰、處的負峰、208nm處處 的負峰和的負峰和198 nm處的正峰三個成分；而處的正峰三個成分；而 -折折 疊的疊的CD譜不很固定。譜不很固定。 57 X衍射晶體分析衍射晶體分析 (X-ray crystallography) 58 核磁共振核磁共振 59 瑞士科學家?guī)鞝柼厝鹗靠茖W家?guī)鞝柼鼐S特里希則發(fā)明了維特里希則發(fā)明了 “利用利用核磁共振核磁共振技術測定溶液中生物大技術測定溶液中生物大 分子分子三維結構三維結構法法”。 這種方法的優(yōu)點是可對溶液中的蛋白質這種方法的優(yōu)點是可對溶液中的蛋白質 進行分析進行分析,進而可對活細胞中的蛋白質進進而可對活細胞中的蛋白質進 行分析行分析,能獲得能

33、獲得“活活”蛋白質的結構蛋白質的結構,其意其意 義非常重大。這種方法的原理選擇生物義非常重大。這種方法的原理選擇生物 大分子中的質子大分子中的質子(氫原子核氫原子核) 作為測量對作為測量對 象象,連續(xù)測定所有相鄰的連續(xù)測定所有相鄰的2個質子之間的距個質子之間的距 離和方位離和方位,這些數據經計算機處理后就可這些數據經計算機處理后就可 形成生物大分子的三維結構圖。形成生物大分子的三維結構圖。 60 核磁共振核磁共振(NuclearMagnetic Resonance - NMR) 現象是現象是1946 年由哈佛大學的伯塞年由哈佛大學的伯塞 和斯坦福大學的布洛赫用不同的方法在和斯坦福大學的布洛赫用

34、不同的方法在 各自的實驗室里觀察到的。核磁共振分各自的實驗室里觀察到的。核磁共振分 析技術是利用通過對核磁共振譜線特征析技術是利用通過對核磁共振譜線特征 參數的測定來分析物質的分子結構與性參數的測定來分析物質的分子結構與性 質質.NMR 不破壞被測樣品的內部結構不破壞被測樣品的內部結構,是是 一種無損檢測方法一種無損檢測方法.由于不同的原子核吸由于不同的原子核吸 收不同的電磁波收不同的電磁波,因而通過測定和分析受因而通過測定和分析受 測物質對電磁波的吸收情況就可以判定測物質對電磁波的吸收情況就可以判定 它含有哪種原子它含有哪種原子,原子之間的距離有多大原子之間的距離有多大, 并據此分析出它的三

35、維結構。并據此分析出它的三維結構。 61 最初最初,核磁共振技術主要用于核物理研究方面核磁共振技術主要用于核物理研究方面,用它測量各用它測量各 種原子核的磁矩種原子核的磁矩,誤差僅是誤差僅是0. 003 %0. 005 %。 1985 年年,維特里希等人公布了第一次利用維特里希等人公布了第一次利用NMR 法測定的溶法測定的溶 液中蛋白質液中蛋白質蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的結構的結構(如圖如圖4 所示所示) 。1990 年用年用NMR 測定的蛋白質測定的蛋白質 結構有結構有23 個個,而到而到1994 年一年測定的蛋白質結構數上升到

36、年一年測定的蛋白質結構數上升到 100個。個。1997 年年,維特里希應用維特里希應用NMR 方法測定的一種蛋白方法測定的一種蛋白 質質蛋白感染素蛋白感染素(prion protein) 的結構。的結構。 62 在水溶液中在水溶液中,大約有一半的蛋白質鏈呈現出大約有一半的蛋白質鏈呈現出 規(guī)則、緊密的規(guī)則、緊密的 三維結構三維結構 ,而另一半則非而另一半則非 常松常松 。目前。目前,科學家已經利用這一方法繪科學家已經利用這一方法繪 制出制出15 %20 %的已知蛋白質的結構。的已知蛋白質的結構。 63 質譜分析法質譜分析法 質譜分析法是化學領域中一種非常重要的分析方法。它質譜分析法是化學領域中一

37、種非常重要的分析方法。它 通過測定分子質量和相應的離子電荷實現對樣品中分通過測定分子質量和相應的離子電荷實現對樣品中分 子的分析。子的分析。 質譜分析用于生物活性分子的研究具有如下的優(yōu)點質譜分析用于生物活性分子的研究具有如下的優(yōu)點:靈敏靈敏 度極高度極高,能為亞微克級試樣提供信息能為亞微克級試樣提供信息,適用于復雜體系中適用于復雜體系中 痕量物質的鑒定和結構測定痕量物質的鑒定和結構測定 。 質譜技術具有非常強的結構分析能力質譜技術具有非常強的結構分析能力,并且樣品用量極少并且樣品用量極少 (10 - 11g) 。19 世紀末科學家已經奠定了這種方法的世紀末科學家已經奠定了這種方法的 基礎基礎,

38、1912 年科學家約瑟夫年科學家約瑟夫湯普生湯普生(Joseph Thompson) 第一次利用它獲得對小分子的分析結果第一次利用它獲得對小分子的分析結果. 64 65 首先將成團的生物大分子拆成單個的生物大分子首先將成團的生物大分子拆成單個的生物大分子,并將其并將其 電離電離,使之懸浮在真空中使之懸浮在真空中,然后讓它們在電場的作用下運然后讓它們在電場的作用下運 動。不同的分子通過指定距離的時間不同動。不同的分子通過指定距離的時間不同,質量小的分質量小的分 子速度快些子速度快些,質量大的分子速度慢些質量大的分子速度慢些,通過測量不同分子通過測量不同分子 通過指定距離的時間通過指定距離的時間,

39、就可計算出分子的質量。就可計算出分子的質量。 66 質譜圖與分子結構有關質譜圖與分子結構有關 質譜是唯一可以給出精確分子量，對化合質譜是唯一可以給出精確分子量，對化合 物分子式的確定起決定性的作用。物分子式的確定起決定性的作用。 質譜法的優(yōu)勢質譜法的優(yōu)勢： 基本原理基本原理 67 68 蛋白質分析技術（蛋白質分析技術（2） 一、一、Western Blot 二、二、ELISA 三、免疫熒光技術三、免疫熒光技術 四、免疫組織化學技術四、免疫組織化學技術 五、蛋白質與蛋白質相互作用的研究五、蛋白質與蛋白質相互作用的研究 技術技術 69 一 Western Blot 1 原理：原理： 將通過聚丙烯酰

40、胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到 硝酸纖維素或硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識膜上，然后與能特異性識 別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結 合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異 性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再 次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適 合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察 有無特異性蛋白條帶的出現，也可通過條帶的

41、有無特異性蛋白條帶的出現，也可通過條帶的 密度大小來進行特異性蛋白的半定量。密度大小來進行特異性蛋白的半定量。 70 2 2 操作過程操作過程 SDS-PAGE電泳電泳 轉膜（轉膜（PVDF或硝酸纖維素膜）或硝酸纖維素膜） 封閉封閉 一抗一抗 洗滌洗滌 酶標二抗反應酶標二抗反應 洗滌洗滌 顯色或化學發(fā)光顯影顯色或化學發(fā)光顯影 71 72 73 二、ELISA 1 原理：原理： ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或 抗體的酶標記。在測定時，受檢標本與固相載抗體的酶標記。在測定時，受檢標本與固相載 體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記的體表面的抗原或抗體

42、起反應。再加入酶標記的 抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。 此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一 定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催 化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質 的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性 或定量分析。測定方法具有很高的敏感度或定量分析。測定方法具有很高的敏感度 （pg-ng/ml水平），并且重復性好。水平），并且重復性好。 74 ELISA 常用的

43、酶和底物常用的酶和底物 辣根過氧化物酶，底物為辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃深桔黃 色色 ，檢測波長，檢測波長492nm；TMB， 藍綠色，藍綠色， 檢測波長檢測波長450nm 堿性磷酸酶，底物為堿性磷酸酶，底物為 PNPP（對消基苯磷酸酯）對消基苯磷酸酯）, 黃色檢黃色檢 測波長測波長405nm 可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆每梢砸淮伟欢鄩K板，凍存?zhèn)溆?75 ELISA各步驟及反應時間各步驟及反應時間 包被：包被：2436h，蛋白濃度為蛋白濃度為15ug/ml 封閉：封閉：37C 2h 或或4C過夜（過夜（3BSA） 樣本反應：樣本反應：37C 45min-1h 酶標抗體反應：酶標抗

44、體反應： 37C 45min-1h 顯色：顯色：15min(避光）設對照避光）設對照 76 2 類型 （1）間接法測抗體）間接法測抗體 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理間接法是檢測抗體常用的方法。其原理 為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗 原結合的受檢抗體，故稱為間接法。原結合的受檢抗體，故稱為間接法。 常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以 及雜交瘤上清特異性抗體的篩選及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。 77 (2) 雙抗體夾心法測抗原 是檢測抗原最常用的方法。 只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可 用于包被固相載體和制備酶結合

45、物。 78 雙抗體夾心法測抗原的方法：雙抗體夾心法測抗原的方法： 捕獲抗體包被捕獲抗體包被 封閉（封閉（3BSA） 待待 測抗原測抗原 洗滌酶標單抗或多抗洗滌酶標單抗或多抗 洗滌洗滌 顯色顯色 檢測檢測 79 80 三三 、免疫熒光技術、免疫熒光技術 利用某些熒光素，如利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通等通 過化學反應與抗體或其它蛋白結合制備過化學反應與抗體或其它蛋白結合制備 成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā)成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā) 生特異性結合，形成的熒光復合物在一生特異性結合，形成的熒光復合物在一 定波長光的激發(fā)下可產生熒光，因此利定波長光的激發(fā)下可產生熒光，因此利 用熒

46、光顯微鏡或流式細胞儀可檢測未知用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測未知 抗原或相應配體?？乖蛳鄳潴w。 81 82 四、免疫組織化學技術四、免疫組織化學技術 原理：原理： 是指酶標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗是指酶標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗 原抗體反應和組織化學的成色反應，對相應的原抗體反應和組織化學的成色反應，對相應的 抗原進行定性、定位和定量測定的一項技術。抗原進行定性、定位和定量測定的一項技術。 它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧 妙的結合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、妙的結合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、 電子顯微鏡等）

47、的顯像和放大作用，在細胞、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細胞、 亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋白質、多亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋白質、多 肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在 原位顯示相應的基因和基因表達產物。原位顯示相應的基因和基因表達產物。 83 按標記物性質分：熒光法、酶法、免按標記物性質分：熒光法、酶法、免 疫金、銀及鐵標記技術等。疫金、銀及鐵標記技術等。 按染色步驟分：直接法、間接法。按染色步驟分：直接法、間接法。 按結合方式分：抗原按結合方式分：抗原-抗體結合法、親抗體結合法、親 和連接法、標記的鏈親和素和連接法、標記的鏈親和素-生物素生物素 法等。法等。 84 雄激素受體雄激素受體 85 雌激素受體（雌激素受體（ER） 86 五、蛋白質相互作用的研究 （酵母雙雜交技術） 87 Yeast two-hy