微生物的實驗室培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)

1、學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo) 1.了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識； 2.掌握無菌操作技術(shù)； 3.了解純化大腸桿菌的基礎(chǔ)知識。 到目前為止，幾十項到目前為止，幾十項NobelNobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)生理學(xué)和醫(yī)學(xué) 獎，化學(xué)獎都與微生物學(xué)有關(guān)獎，化學(xué)獎都與微生物學(xué)有關(guān) 微生物 1 2.2.微生物包括五類：微生物包括五類： 真菌真菌 原生動物原生動物 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界 真菌界真菌界 病毒界病毒界 1.1.微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的 微小生物的總稱微小生物的總稱 細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌的外形與大小 圖圖1-1 常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)

2、 A.球菌球菌 B.桿菌桿菌 C.弧菌弧菌 有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形 成一個橢圓形的成一個橢圓形的休眠體休眠體，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽芽 孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡 劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的 細(xì)菌的芽孢，煮沸細(xì)菌的芽孢，煮沸3 3小時以后才死亡。芽小時以后才死亡。芽 孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適 宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢 又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌。又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌。 細(xì)菌、

3、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)細(xì)菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn) 生的一種有繁殖作用的生的一種有繁殖作用的生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞。 能直接發(fā)育成新個體。能直接發(fā)育成新個體。 單個單個或少數(shù)細(xì)菌在或少數(shù)細(xì)菌在固體固體培養(yǎng)基上大量繁殖培養(yǎng)基上大量繁殖 時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定 形態(tài)結(jié)構(gòu)的子形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體細(xì)胞群體，叫做，叫做菌落菌落。 2.2.特征：特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。 3.3.功能：功能： 1.1.定義：定義： 菌落菌落 鑒定菌種鑒定菌種的重要依據(jù)的重要依據(jù) 菌落菌落 細(xì)菌的細(xì)菌的 菌落特菌落特 征因種

4、征因種 而異而異 1 1、結(jié)構(gòu)：、結(jié)構(gòu)： 單細(xì)胞原核單細(xì)胞原核 分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲） 鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、 氯霉素、紅霉素、慶大霉素氯霉素、紅霉素、慶大霉素 微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素， 其中其中2/32/3是由放線菌產(chǎn)生的是由放線菌產(chǎn)生的 應(yīng)用應(yīng)用: : 培養(yǎng)基 2 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而 成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng) 液。 （一）培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用：（一）培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用： 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型配制特點配制特點主要應(yīng)用主要應(yīng)用 物理物理 狀態(tài)狀態(tài) 固體

5、培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)半固體培養(yǎng) 基基 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 基基 加入瓊脂較加入瓊脂較 多多 加入瓊脂較加入瓊脂較 少少 不加入瓊脂不加入瓊脂 微生物分離微生物分離,鑒定鑒定, 計數(shù)，活菌保存計數(shù)，活菌保存 觀察微生物的運觀察微生物的運 動，分類，鑒定動，分類，鑒定 工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)生產(chǎn) 半固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基： 無動力無動力 有動力有動力( (彌散彌散) ) ( (是否運動是否運動) ) 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基： 表面生長表面生長均勻混濁生長均勻混濁生長沉淀生長沉淀生長 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類 型型 配制特點配制特點主要應(yīng)用主要應(yīng)用 化化 學(xué)學(xué) 成成 分分 合成培養(yǎng)合成培養(yǎng) 基基

6、由已知成分配制而由已知成分配制而 成，培養(yǎng)基成分明成，培養(yǎng)基成分明 確確 菌種分類、鑒定菌種分類、鑒定 天然培養(yǎng)天然培養(yǎng) 基基 由天然成分配制而由天然成分配制而 成，培養(yǎng)基成分不成，培養(yǎng)基成分不 明確明確 工業(yè)生產(chǎn)，降低工業(yè)生產(chǎn)，降低 成本成本 目目 的的 用用 途途 鑒別培養(yǎng)鑒別培養(yǎng) 基基 添加某種指示劑或添加某種指示劑或 化學(xué)藥劑化學(xué)藥劑 菌種的鑒別菌種的鑒別 選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng) 基基 添加（或缺少）某添加（或缺少）某 種化學(xué)成分種化學(xué)成分 菌種的分離菌種的分離 根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法 模擬合成的。模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要

7、成分是合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合氨基酸、維生素、碳水化合 物、無機(jī)鹽物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 缺點：缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長 需要。需要。 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基: : 天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞 胚和牛胚浸液）。胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：缺點：來源受限；成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)來源受限；成分復(fù)雜，影響對某

8、些實驗產(chǎn) 物的提取和實驗結(jié)果的分析；易發(fā)生支原體污染物的提取和實驗結(jié)果的分析；易發(fā)生支原體污染 。 天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基： 血清中含有：血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子；多種金屬離子； 激素；激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等 。 各種生長因子各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分不明成分 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì) 胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如 血

9、清）。血清）。 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基 加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: : 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: :分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: : 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入伊紅在培養(yǎng)基中加入伊紅- -美藍(lán)美藍(lán): :用于大腸桿菌的鑒別用于大腸桿菌的鑒別 在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑：用于分解尿素細(xì)菌的鑒定用于分解尿素細(xì)菌的鑒定 分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌 分離固氮菌分離固氮菌 分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物 （二）（

10、二）. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì) 1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽碳源、氮源、水、無機(jī)鹽 碳源碳源 無機(jī)碳源：無機(jī)碳源： 有機(jī)碳源：有機(jī)碳源： COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- - 牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等 自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物 異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物 氮源氮源 無機(jī)氮源無機(jī)氮源 ： 有機(jī)氮源有機(jī)氮源 ： N N2 2、 、NH NH3 3、 、NH NH4 4 、 、NONO3 3- -（為硝化細(xì)菌提供 （為硝化細(xì)菌提供N N源源 和能源）和能源） 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白

11、胨、酵母膏、尿素 等等 注：含注：含CHONCHON的的有機(jī)物有機(jī)物是是異異養(yǎng)型微生物的養(yǎng)型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源 思考：微生物“吃”什么？ 2. 2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 ( 參考教材附錄內(nèi)容參考教材附錄內(nèi)容P83) 3.3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源 、 無機(jī)鹽無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對 pHpH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)特殊營養(yǎng)物質(zhì), ,例如：例如：生長因子（生長因子（即細(xì)菌生長必即細(xì)菌生長必 需，而自身不能合成的化

12、合物，如維生素、某些氨基需，而自身不能合成的化合物，如維生素、某些氨基 酸、嘌呤、嘧啶酸、嘌呤、嘧啶) )以及以及氧氣氧氣、二氧化碳二氧化碳、滲透壓滲透壓等的要等的要 求。求。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方 H2O 定容至定容至1000ml Nacl 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 5g 瓊脂瓊脂20.0g 分析營養(yǎng)構(gòu)成？分析營養(yǎng)構(gòu)成？ 5. 5. 配制原則配制原則 目的明確：目的明確： 營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)營養(yǎng)

13、全面、濃度適宜、比例恰當(dāng) 適宜的適宜的pHpH值：值： 有機(jī)碳源有機(jī)碳源異養(yǎng)型：異養(yǎng)型： 根據(jù)微生物的根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的種類、培養(yǎng)目的選擇原料選擇原料 自養(yǎng)型：自養(yǎng)型： 不加碳源不加碳源 加入緩沖劑（加入緩沖劑（KHKH2 2POPO4 4，K K2 2HPOHPO4 4） 細(xì)菌偏堿，真菌偏酸細(xì)菌偏堿，真菌偏酸 （COCO2 2碳源）碳源） 生產(chǎn)生產(chǎn)科研科研 【典例解析典例解析】 例例2 2關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（ ） A.A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量 C.C.除水

14、以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.D.無機(jī)氮源也能提供能量無機(jī)氮源也能提供能量 D 例例1 1下列敘述正確的是（下列敘述正確的是（ ） A.A.為微生物的生長繁殖提供營基質(zhì)的是固體培養(yǎng)基為微生物的生長繁殖提供營基質(zhì)的是固體培養(yǎng)基 B.B.培養(yǎng)基只有兩類培養(yǎng)基只有兩類: :液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基 C.C.固體培養(yǎng)基中加入少量水及可制成液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中加入少量水及可制成液體培養(yǎng)基 D.D.微生物在固體培養(yǎng)基上生長時，可以形成肉眼可見的菌落微生物在固體培養(yǎng)基上生長時，可以形成肉眼可見的菌落 D 例例3 3下表是對四種微生物的能源、碳源、氮源新陳代謝

15、類下表是對四種微生物的能源、碳源、氮源新陳代謝類 型的敘述，正確的是（型的敘述，正確的是（ ） 選項選項項目項目硝化細(xì)菌硝化細(xì)菌乳酸菌乳酸菌根瘤菌根瘤菌衣藻衣藻 A能源能源NH3乳酸乳酸N2光能光能 B碳源碳源CO2糖類等糖類等糖類等糖類等CO2 C氮源氮源NH3N2N2NO3 D代謝代謝 類型類型 自養(yǎng)自養(yǎng) 需氧型需氧型 異樣異樣 厭氧型厭氧型 自養(yǎng)自養(yǎng) 需氧型需氧型 自養(yǎng)自養(yǎng) 需氧型需氧型 B （三）無菌技術(shù)（三）無菌技術(shù) 1.1.無菌技術(shù)的概念無菌技術(shù)的概念 無菌操作泛指無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜 菌污染的方法。菌污染的方法。無論是隨后將

16、要學(xué)到的無論是隨后將要學(xué)到的倒平板倒平板、平板平板 劃線劃線操作，還是操作，還是平板稀釋涂布法平板稀釋涂布法，其操作中的每一步，其操作中的每一步 都需要做到都需要做到“無菌無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、，即防止雜菌污染。只有熟練、 規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。 消毒定義：消毒定義： 利用化學(xué)或物理方法，殺死物體表面或內(nèi)部的利用化學(xué)或物理方法，殺死物體表面或內(nèi)部的 部份微生物部份微生物（不含芽胞和孢子不含芽胞和孢子）的過程。）的過程。 2.2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別 滅菌的定義：滅菌的定義： 以化學(xué)

17、或物理方法消滅物體內(nèi)外所有微生物，包以化學(xué)或物理方法消滅物體內(nèi)外所有微生物，包 括所有細(xì)菌的括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到，而達(dá)到完完 全無菌全無菌之過程。之過程。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是 最重要的技術(shù)。最重要的技術(shù)。 1 1. .煮沸消毒法煮沸消毒法：100100煮沸煮沸5-6min5-6min 2.2.巴氏消毒法巴氏消毒法：70-7570-75下煮下煮30min30min或或 80 80 下下 煮煮15min15min 3 3. .化學(xué)藥劑消毒法化學(xué)藥劑消毒法：用：用75%75%酒精、新潔爾

18、滅等進(jìn)酒精、新潔爾滅等進(jìn) 行皮膚消毒；氯氣消毒水源行皮膚消毒；氯氣消毒水源 4.4.紫外線消毒紫外線消毒 消毒的方法：消毒的方法： 3.3.常用的消毒與滅菌的方法常用的消毒與滅菌的方法 1.1.灼燒滅菌灼燒滅菌 2.2.干熱滅菌干熱滅菌：160-160- 170170下加熱下加熱1-2h1-2h。 3.3.高壓蒸氣滅菌高壓蒸氣滅菌： 100kPa100kPa、121121下下 維持維持15-30min15-30min。 滅菌的方法：滅菌的方法： 1.1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他 外來微生物污染外，還有什么目的？外來微生物污染外，還有什么目

19、的？ 2.2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌 。如果需要，請選擇合適的方法。如果需要，請選擇合適的方法。 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 玻棒、玻棒、 試試 管、燒瓶和吸管管、燒瓶和吸管 實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手 答：無菌技術(shù)還能答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染有效避免操作者自身被微生物感染 答：、需要滅菌；需要消毒答：、需要滅菌；需要消毒。 例例5 5下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解的是（的是（ ） A.A.防止雜菌污染防止雜菌污染 B.B.消滅雜菌消滅雜菌 C.C.培養(yǎng)基和發(fā)酵

20、設(shè)備都必須滅菌培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.D.滅菌必須在接種前滅菌必須在接種前 B 例例6 6下列關(guān)于消毒和滅菌的說法，下列關(guān)于消毒和滅菌的說法，的是（的是（ ） A.A.滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽胞和孢子滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽胞和孢子 B.B.消毒和滅菌實質(zhì)上是相同的消毒和滅菌實質(zhì)上是相同的 C.C.接種環(huán)用灼燒的方法滅菌接種環(huán)用灼燒的方法滅菌 D.D.常用消毒方法有煮沸法、紫外線法、化學(xué)藥品法常用消毒方法有煮沸法、紫外線法、化學(xué)藥品法 B 例例7 7高溫滅菌的原理是（高溫滅菌的原理是（ ） A.A.每種微生物生長的最適溫度是一定的每種微生物生長的最適溫度

21、是一定的 B.B.微生物對于高溫環(huán)境不適應(yīng)微生物對于高溫環(huán)境不適應(yīng) C.C.高溫破壞的細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸高溫破壞的細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸 D.D.高溫降低了環(huán)境中氧的濃度高溫降低了環(huán)境中氧的濃度 C 器具的器具的滅菌滅菌 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 倒平板倒平板 微生物微生物接種接種 恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng) 菌種的保存菌種的保存 1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方 H2O 定容至定容至1000ml Nacl 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 5g 瓊脂瓊脂20.0g 大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)： 制備牛肉膏蛋白

22、胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 1.1.計算：計算：培養(yǎng)基用量培養(yǎng)基用量 依配方計算各成分的用量依配方計算各成分的用量 2.2.稱量：稱量： 3.3.溶化：溶化： 牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取 牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋 牛肉膏、稱量紙牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解、少量水加熱溶解 取紙取紙 蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl瓊脂瓊脂 補(bǔ)水定容補(bǔ)水定容 4.4.調(diào)調(diào)pHpH、分裝、封口：、分裝、封口： 5.5.滅菌：滅菌： 6.6.倒平板：倒平板： 培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿 分散成單個細(xì)胞分散成單個細(xì)胞, ,形成單個菌落形成

23、單個菌落 約約50 防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染 灼燒滅菌，灼燒滅菌， 防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基 1.1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 50 左右時，才能左右時，才能 用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 答：答：可以可以用手觸摸用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫 度下降到度下降到剛剛不燙手剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。時，就可以進(jìn)行倒平板了。 2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形

24、瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基 。 3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿 蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生 物嗎？為什么？物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面 的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培

25、養(yǎng)基表面的水分更 好地?fù)]發(fā)，又可以好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋的培養(yǎng)基上滋 生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。 例例8.制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟是（制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟是（ ） A.計算、稱量、倒平板、溶化、滅菌計算、稱量、倒平板、溶化、滅菌 B.計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌 C.計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板 D.計算、

26、稱量、滅菌、溶化、倒平板計算、稱量、滅菌、溶化、倒平板 C 例例9.有關(guān)倒平板操作錯誤的是（有關(guān)倒平板操作錯誤的是（ ） A.將滅過菌的培養(yǎng)基放在火焰旁的桌面上將滅過菌的培養(yǎng)基放在火焰旁的桌面上 B.使打開的錐形瓶的瓶口迅速通過火焰使打開的錐形瓶的瓶口迅速通過火焰 C.將培養(yǎng)皿打開，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌面上將培養(yǎng)皿打開，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌面上 D.等待平板冷卻凝固后需要倒過來放置等待平板冷卻凝固后需要倒過來放置 C 二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)： 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 純化大腸桿菌：純化大腸桿菌： 平板劃線法：平板劃線法： 菌種菌種 劃劃3 3個平

27、板個平板 1 1個不劃線個不劃線 1.1.純化大腸桿菌的方法：純化大腸桿菌的方法：平板劃線法平板劃線法和稀釋涂布平板法和稀釋涂布平板法 接種環(huán)接種環(huán) 防止劃破培養(yǎng)基防止劃破培養(yǎng)基 （重復(fù)實驗）（重復(fù)實驗） （空白對照）（空白對照） 第一區(qū)域第一區(qū)域 第二區(qū)域第二區(qū)域 第三區(qū)域第三區(qū)域 第四區(qū)域第四區(qū)域 第五區(qū)域第五區(qū)域 平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表 面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到 培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由分離到由 一個細(xì)胞繁殖而來

28、的肉眼可見的子細(xì)胞群體一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體。 2：每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的：每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的： 3：劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)的目的：劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)的目的： 答案：避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基答案：避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基 答案：殺死上次劃線結(jié)束后殘留的菌種答案：殺死上次劃線結(jié)束后殘留的菌種 答案：及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染答案：及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染 環(huán)境和操作者。環(huán)境和操作者。 1：第一步灼燒接種環(huán)的目的：第一步灼燒接種環(huán)的目的： 4.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行 劃線？ 答：以免接種環(huán)溫度太高，殺

29、死菌種。 5.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從 上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要 少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目 隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個 細(xì)菌繁殖而來的菌落。 稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法 原理：原理： 將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，并將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，并 將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊 脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀 釋倍數(shù)足夠高時，即可獲得單個釋倍數(shù)足夠高時，即可獲得單個 細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。 6 6支試管，分別加入支試管，

30、分別加入9ml9ml無菌水無菌水 1ml 101 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法： a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液： 菌液菌液 微量微量 移移 液器液器 浸浸 稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法： a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液： b.b.涂布平板：涂布平板： 不超過不超過0.1ml0.1ml 各梯度分別涂布各梯度分別涂布3個平板個平板 1 1個不涂布作空白對照個不涂布作空白對照 滴滴 灼灼 涂涂 稀稀 釋釋 10103 3 倍倍 稀稀 釋釋 10104 4 倍倍 稀稀 釋釋 10105 5 倍倍 注意：移液管

31、需要經(jīng)過滅菌。操作時，試 管口和移液管離火焰12cm處. 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。 結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想 一想，第一想，第2 2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？ 應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌無菌”。例如，。例如， 酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接 觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等 等。等。 3平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較

32、 優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點適用范圍適用范圍 平板劃線平板劃線 分離法分離法 可以觀察菌落特可以觀察菌落特 征，對混合菌進(jìn)征，對混合菌進(jìn) 行分離行分離 不能計數(shù)不能計數(shù)適用于好氧菌適用于好氧菌 稀釋涂布稀釋涂布 平板法平板法 可以計數(shù)，可以可以計數(shù)，可以 觀察菌落特征觀察菌落特征 吸收量較少、吸收量較少、 較麻煩，平板較麻煩，平板 不干燥效果不不干燥效果不 好，容易蔓延好，容易蔓延 適用于厭氧菌適用于厭氧菌 和兼性厭氧菌和兼性厭氧菌 平板劃線法：平板劃線法： 二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)： 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 純化大腸桿菌：純化大腸桿菌： 1.1.接

33、種：接種： 稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法： 2.2.培養(yǎng)：培養(yǎng)：將將接種后接種后的培養(yǎng)基和一個的培養(yǎng)基和一個未接種未接種的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基 放入放入3737恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)12h12h24h24h后，后， 觀察并記錄觀察并記錄 稀稀 釋釋 10103 3 倍倍 稀稀 釋釋 10104 4 倍倍 稀稀 釋釋 10105 5 倍倍 （三）菌種的保藏：（三）菌種的保藏： 1.1.臨時保藏：臨時保藏： 試管固體斜面培養(yǎng)基上試管固體斜面培養(yǎng)基上 ，培養(yǎng)長成菌落，培養(yǎng)長成菌落 44冰箱保存冰箱保存 2.2.長期保存：長期保存： 菌種易被污染、變異菌種易被污染、變異 甘油管藏甘油管藏 1ml1ml甘

34、油（滅菌）甘油（滅菌）1ml1ml菌液菌液 2020 擱置斜擱置斜 面面 四、課題成果評價四、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1 12 d2 d后無菌落后無菌落 生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備 。 （二）接種操作是否符合無菌要求（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一 致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則

35、說明接種操作是符 合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種 過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次 練習(xí)。練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)培養(yǎng)12 h12 h與與24 h24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不 同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其 他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)

36、生良好 的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。 微微 生生 物物 的的 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基礎(chǔ)基礎(chǔ) 知識知識 實驗操作實驗操作 結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 定義：定義： 分類：分類： 人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的 不同需求，配置出供其生長繁不同需求，配置出供其生長繁 殖的營養(yǎng)物質(zhì)殖的營養(yǎng)物質(zhì) 固體培養(yǎng)固體培養(yǎng) 基基 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 基基 無菌技術(shù)無菌技術(shù) 培養(yǎng)微生物的操作中，所有防培養(yǎng)微生物的操作中，所有防 止雜菌污染的方法止雜菌污染的方法 定義：定義： 消毒與滅菌消毒與滅菌 常用滅菌方法常用滅菌方法 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 純化

37、大腸桿菌純化大腸桿菌 課堂小結(jié)課堂小結(jié) 編號編號成分成分含量含量 粉狀硫粉狀硫10g10g （NHNH4 4） 2 2SO SO4 4 0.4g0.4g K K2 2HPOHPO4 44.0g4.0g MgSOMgSO4 49.25g9.25g FeSOFeSO4 40.5g0.5g CaClCaCl2 20.5g0.5g HH2 2OO100ml100ml 例例1212右表是某微生物培右表是某微生物培 養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答： 右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生 物類型是物類型是 。 若不慎將過量若不慎將過量NaClNaCl加入加入 培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)培

38、養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng) 基，可再加入基，可再加入 . . 自養(yǎng)型微生物自養(yǎng)型微生物 含碳有機(jī)物含碳有機(jī)物 若除去成分，加入（若除去成分，加入（CHCH2 2OO），該培養(yǎng)基可用于），該培養(yǎng)基可用于 培養(yǎng)培養(yǎng) 。 表中營養(yǎng)成分共有表中營養(yǎng)成分共有 類。類。 不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要 進(jìn)行的是進(jìn)行的是 。 右表中各成分重量確定的原則是右表中各成分重量確定的原則是 。 若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分是若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分是 。 固氮微生物固氮微生物 3 調(diào)整調(diào)整pHpH 依微生物的生長依微生物的生長 需要確定需要確定 瓊脂（或凝固劑）瓊脂（或凝固劑） 學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo) 1.了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識； 2.掌握無菌操作技術(shù)； 3.了解純化大腸桿菌的基礎(chǔ)知識。 單個單個或少數(shù)細(xì)菌在或少數(shù)細(xì)菌在固體固體培養(yǎng)基上大量繁殖培養(yǎng)基上大量繁殖 時，就會形成一個肉眼