儀器分析毛細(xì)管電泳

1、第五章 毛細(xì)管電泳 主要內(nèi)容 High performance capillary electrophoresis,HPCE 5.1 毛細(xì)管電泳的基本原理 5.2 毛細(xì)管電泳儀 5.3 毛細(xì)管電泳的分離模式 5.4 影響分辨率的因素及操作條件選擇 5.5 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用 5.1 5.1 毛細(xì)管電泳的基本原理 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作 用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn) 象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷 移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。 1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖 溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，

2、第一次將人血 清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)； 5.1.1 概 述 經(jīng)典電泳分析 利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方 法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、 自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無 法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管 進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本 變革，迅

3、速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析 技術(shù)高效毛細(xì)管電泳。 高效毛細(xì)管電泳分析 high performance capillary electrophoresis 高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了0.050.05mmmm內(nèi)徑的毛細(xì)管, ,； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減 小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。 電壓升高，電場推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小， 柱長增加， 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔 板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。 電壓：030kV； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或

4、激光誘導(dǎo)熒光檢測器； （可檢測到：10-1910-21 mol/L） 高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書P144有6 點(diǎn)） 1.儀器簡單、易自動(dòng)化儀器簡單、易自動(dòng)化 電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶 2.分析速度快、分離效率高分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種 陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)； 3.操作方便、消耗少，成本低操作方便、消耗少，成本低 進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行； 4.應(yīng)用范圍極廣應(yīng)用范圍極廣 有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等； 5、高靈敏度。、高靈敏度。 6、進(jìn)

5、樣量少。、進(jìn)樣量少。 5.1.2 高效毛細(xì)管電泳(HPCE)基本原 理 電泳是指帶電離子在電場中的定向移動(dòng)，不同離子具有 不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？ 當(dāng)帶電離子以速度 在電場中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、 方向相反的電場推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。 電場力：FE = qE 阻 力：F = f 故： qE = f q離子所帶的有效電荷； E 電場強(qiáng)度； 離子在電場中的遷移速度； f 平動(dòng)摩擦系數(shù) ( 對于球形離子： f =6； 離子的表觀液態(tài)動(dòng)力 學(xué)半徑； 介質(zhì)的粘度； ) 所以，遷移速度： E q f qE 6 （球形離子） 物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。 淌度 ：單位電場

6、強(qiáng)度下的平均電泳速度。 6 q E 電滲現(xiàn)象與電滲流 1.1.電滲流現(xiàn)象電滲流現(xiàn)象 當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電 荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界 面形成雙電層，二者之間存在電位差（ZetaZeta電位）。 當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)， 就會發(fā)生液體相對于固體表面 的移動(dòng)，這種液體相對于固體 表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的 液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。 2.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流 石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH3時(shí)，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁 帶負(fù)電荷，形成雙電層。 在高電場的作用下，帶正電荷的

7、溶液表面及擴(kuò)散層向陰極 移動(dòng)，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的 溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流。 3.HPCE中電滲流的大小與方向 電滲流的大小用電滲流速度電滲流表示，取決于電滲淌 度和電場強(qiáng)度E E。即 電滲流 = = E E 電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的ZetaZeta電勢，即 = = 0 0 0真空介電常數(shù)；介電常數(shù)；毛細(xì)管壁的Zeta電勢。 電滲流 = = 0 0 E E 實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算 電滲流 = = L Lef ef/t /teo eo Lef 毛細(xì)管有效長度； teo電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。 HPCE中電滲流的方向

8、電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極； 改變電滲流方向的方法： （1 1）毛細(xì)管改性 表面鍵合陽離子基團(tuán)； （2 2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì) 管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽極。 4. HPCE中電滲流的流形 電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式 流動(dòng)（譜帶展寬很?。?； 液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流 速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬 較大）。 5.

9、HPCE中電滲流的作用 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5 57 7倍； 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： + + = =電滲流 + + +ef +ef 陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致； - - = =電滲流 - - -ef -ef 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反； 0 0 = =電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致； （1 1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離； （2 2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性， 如同改變LCLC中的流速； （3 3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性； 在HPCEHPCE中，控制電滲流非常重要。 HPCE中影響電滲流的因素 factors i

10、nfluenced electroosmosis 1.1.電場強(qiáng)度的影響電場強(qiáng)度的影響 電滲流速度和電場強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時(shí)， 電滲流速度正比于工作電壓。 2.2.毛細(xì)管材料的影響毛細(xì)管材料的影響 不同材料毛細(xì)管的表面電 荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大 小不同； 3. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響 （1 1）溶液pHpH的影響 對于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密 度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大； pH 電泳時(shí), ,陰離子在 負(fù)極最后流出, ,在這種情況下, ,不但 可以按類分離, ,同種類離子由于差 速遷移被相互分離。 最基本、應(yīng)用廣的分離模式； 二

11、、毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分 離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNADNA等的電荷/ /質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZECZE模 式很難分離，采用CGECGE能獲得良好分離。 特點(diǎn)：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘 度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。 1.1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界 濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。 三、 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色

12、譜（MECC ， MEKC） micellar electrokinetic capillary chromatography， MEKC 在電場力的作 用下，膠束在柱中 移動(dòng)。 2. 2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ， 負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)； 5.5.色譜與電泳分離模式 的結(jié)合。 3. 3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng) 的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長； 4. 4.可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用 范圍； 1. 1. 根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)； 2. 2. 毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍 的脂

13、肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6 68 8V V）時(shí)， 管內(nèi)將建立一個(gè)由陽極到陰極逐步升高的pHpH梯度； 3. 3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pHpH有關(guān)，在 酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中 性，淌度為零； 四、毛細(xì)管等電聚焦 capillary isoelectric focusing，CIEF 4. 聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷 移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止 移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離； 5. 陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液； 6. 加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；

14、7. 電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。 5.5 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用 陽離子分析 遷移方向和電滲流方 向一致； 4.5min內(nèi)分離了24種 金屬離子； 陽極進(jìn)樣，陰極檢測； 具有很高的靈敏度； 陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流 方向相反、速度接近，分析 時(shí)間長、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離 子如：SO4-2、Cl-、F-等，電 泳速率大于電滲流，陽極端 流出，在陰極端無法檢測； 加入電滲流改性劑，十六 烷基三甲基溴化胺等，使電 泳方向和電滲流方向一致， 可在3.1min內(nèi)分離36種陰離 子；陰極進(jìn)樣，陽極檢測； 離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析； 藥物分析 analysis of pharmac

15、eutics 檢測體液或細(xì)胞中某 些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨基酸含量 作為臨床診斷糖尿病的 輔助手段； 采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳 方式，在11min內(nèi)分離17 種藥物； 采用MEKC模式， 鑒定違禁藥物； 效果優(yōu)于HPLG 法 手性化合物分析 合成獲得單一手性化合物相當(dāng)困難；528種手性合成藥物， 61中以單一對映體形式銷售，其他為外消旋體；檢測分析也 相當(dāng)困難；研究熱點(diǎn)； R-反應(yīng)停是安眠藥，S-式致胎兒畸形； HPCE分離分析手性化合物的方法：加入手性選擇劑； 形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)有差異，結(jié)合HPCE的高效率； 常用手性選擇劑：環(huán)糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表 面活性劑（氨基酸衍生物、膽酸

16、鈉、?；敲撗跄懰峒捌溻c鹽、 低聚糖等天然手性表面活性劑） 氨基酸與蛋白質(zhì)分析 采用MEKC模式，在25分鐘內(nèi)分離了23種丹?；被?； HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀； 問題：吸附和檢測； 蛋白質(zhì)分析 核酸分析及DNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA 重要分析手段； 圖，酶解的雙螺旋 DNA限制性片段的 分離； 新進(jìn)展 advances and special topics 1.1.微型化微型化 整體化學(xué)分析系統(tǒng)（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作為毛細(xì)管，理論塔板數(shù)105/m； 2.2.聯(lián)用儀器聯(lián)用儀器 CE-MS

17、； 3.3.陣列毛細(xì)管凝膠電泳陣列毛細(xì)管凝膠電泳 應(yīng)用于人類基因DNA測序； 510萬個(gè)基因，30億個(gè)堿基對，目前最有效的DNA序列 分析儀，10小時(shí)/次；可同時(shí)電泳24個(gè)樣品；速度1200堿基對 /小時(shí)，提高速度！ 100支毛細(xì)管陣列電泳；速度280堿基對/小時(shí)/支 Thank you! 高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)（書P144有6 點(diǎn)） 1.儀器簡單、易自動(dòng)化儀器簡單、易自動(dòng)化 電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶 2.分析速度快、分離效率高分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種 陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)； 3.操作方便、消耗少，

18、成本低操作方便、消耗少，成本低 進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行； 4.應(yīng)用范圍極廣應(yīng)用范圍極廣 有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等； 5、高靈敏度。、高靈敏度。 6、進(jìn)樣量少。、進(jìn)樣量少。 所以，遷移速度： E q f qE 6 （球形離子） 物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。 淌度 ：單位電場強(qiáng)度下的平均電泳速度。 6 q E 3.HPCE中電滲流的大小與方向 電滲流的大小用電滲流速度電滲流表示，取決于電滲淌 度和電場強(qiáng)度E E。即 電滲流 = = E E 電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的ZetaZeta電勢，即 = = 0 0 0真空介電常