一種佐劑新材料在嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫異育銀鯽

1、一種佐劑新材料在嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫異育銀鯽（以下同，全文統(tǒng)一）鯽中的應(yīng)用效果任 燕1，時云朵1,2,3，石存斌1收稿日期：20165-12-21 修回日期：2017-04-10資助項(xiàng)目：廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（A201501C12）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-46）；國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD25B02）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（A201501C12）*通信作者：石存斌，E-mail: shicunbin2006，吳淑勤11. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部漁藥漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510

2、3802. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 2013063. 四川省水產(chǎn)學(xué)校，四川 成都 611730摘 要：為研究蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷（Castor oil polyethylene glycol monoester glucoside，CPMG）在細(xì)菌滅活疫苗浸泡免疫中的佐劑作用，將CPMG和嗜水氣單胞菌滅活疫苗聯(lián)合施用，二次浸泡免疫異育銀鯽后飼養(yǎng)在室內(nèi)玻璃缸中，用實(shí)時熒光定量PCR檢測加強(qiáng)免疫后2 d、4 d、7 d、11 d、14 d和21 d脾臟中IgM、IL-1、C3、C-凝集素和溶菌酶的mRNA表達(dá)量，首次免疫30天后用同源菌株活菌攻擊試驗(yàn)魚。同時，用含CPMG、山莨菪堿

3、復(fù)合佐劑的滅活疫苗浸泡免疫異育銀鯽鯽魚一次后飼養(yǎng)在池塘網(wǎng)箱中，定期抽取血液檢測血清抗體效價并用同源菌株活菌攻擊人工感染試驗(yàn)魚。結(jié)果顯示，CPMG佐劑組和無佐劑組的5個免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量顯著高于對照組（P0.05），CPMG組IgM基因較無佐劑組更早表達(dá)，補(bǔ)體C3、C-凝集素以及溶菌酶的基因表達(dá)量更高或表達(dá)持續(xù)時間更長。血清抗體效價在免疫后2 w達(dá)到160，6 w達(dá)到峰值640，12 w降低為40。室內(nèi)玻璃缸中二次免疫30 d后，CPMG組的平均相對保護(hù)率達(dá)到70.6%，復(fù)合佐劑組的達(dá)到88.2%，均顯著高于無佐劑組的56.0%（P0.05）。池塘網(wǎng)箱中一次浸泡免疫30 d、60 d、和1

4、20 d后，平均相對保護(hù)率分別為54.6%、44.0% 、和12.5%。結(jié)果表明，CPMG與嗜水氣單胞菌滅活疫苗共同浸泡免疫異育銀鯽，增強(qiáng)了脾臟中IgM、IL-1、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表達(dá)，提高了異育銀鯽抗嗜水氣單胞菌感染的能力。關(guān)鍵詞：異育銀鯽；蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷；山莨菪堿；滅活疫苗；浸泡免疫 漁用疫苗，尤其是細(xì)菌滅活疫苗的浸泡免疫操作方便，適用于無鱗魚、魚苗等免疫。利用免疫佐劑、細(xì)胞滲透劑等材料，結(jié)合高滲浸泡、超聲波處理等透皮方法，增強(qiáng)魚體對抗原的攝入量，從而提高免疫效果是浸泡免疫的發(fā)展方向和趨勢1?；诖?，開發(fā)應(yīng)用高效、安全、使用方便、環(huán)境友好的的浸泡材料提高疫苗浸泡免

5、疫效果，可大大推動漁用疫苗的應(yīng)用，進(jìn)而推動水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷（Castor oil polyethylene glycol monoester glucoside，CPMG）是由一種由可再生植物原料蓖麻油依次經(jīng)酸化、酯化和糖苷化而合成的一種非離子表面活性劑，。CPMG可被具有良好的生物降解性，無毒，界面張力低，水溶性好，具有分散、乳化等作用，能使不溶于水的油類或不溶性抗原（如：細(xì)菌、病毒等）顆粒性物質(zhì)在水溶液中分散更均勻和穩(wěn)定（已申請專利）。文獻(xiàn)？可有哪些疫苗應(yīng)用其作為佐劑？效果如何？。山莨菪堿的作用？那些應(yīng)用？為什么用復(fù)合佐劑？ 本文評價CPMG新材料在嗜水氣單

6、胞菌滅活疫苗浸泡免疫異育銀鯽中的應(yīng)用效果，旨在尋找適合在漁業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的佐劑材料。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)魚和菌株異育銀鯽（Carassius auratus gibelio拉丁學(xué)名）購于廣東省佛山市三水區(qū)某養(yǎng)殖場，體重體質(zhì)量（8 1）g，體長（7.5 0.5）cm。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)2 w周，觀察攝食活動狀態(tài)，確認(rèn)健康后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間池塘水溫（26 3），室內(nèi)玻璃缸水溫（26 1）。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila拉丁學(xué)名）菌株YYK090901為本研究室自行分離、鑒定并保藏的細(xì)菌，為本次實(shí)驗(yàn)的疫苗制備株和活菌攻擊人工感染菌株。1.2 主要試劑和儀器蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄

7、糖苷CPMG由廣州市瑞洋表面活性劑有限公司合成，TSB培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，山莨菪堿為河南普瑞制藥有限公司產(chǎn)品，PrimeScript RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex Taq II購自大連寶生物工程有限公司，Trizol Reagent購自英濰捷基公司，鼠抗鯉科魚IgM單抗為Aquatic Diagnostic Ltd.產(chǎn)品，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為美國Jackson公司產(chǎn)品，其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。ABI 7500熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品，冷凍離心機(jī)為美國Sigma公司產(chǎn)品，核酸蛋白測定儀為美國BE

8、CKMAN COULTER公司產(chǎn)品，溫控?fù)u床SPH-2112F為中國SHIPING公司產(chǎn)品，生化培養(yǎng)箱MIR-153為日本SANYO公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀infinite M200 PRO為瑞士Tecan公司產(chǎn)品。1.3 嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備將YYK090901菌株接種到TSB液體培養(yǎng)基中28 搖床活化18 h，再轉(zhuǎn)接到500 mL TSB培養(yǎng)基中28 擴(kuò)大培養(yǎng)18 h，然后用3福爾馬林溶液28 滅活72 h。無菌檢驗(yàn)合格后，即為嗜水氣單胞菌滅活疫苗。1.4 二次浸泡免疫試驗(yàn)（室內(nèi)玻璃缸養(yǎng)殖）將異育銀鯽銀鯽分為4組，每組80尾。各免疫組在1.5%鹽水中充氣浸泡5 min后，分別在含10g/mL

9、 CPMG的疫苗溶液、復(fù)合佐劑（10g /mL CPMG+15 g /mL山莨菪堿）的疫苗溶液及無佐劑的疫苗溶液中充氣浸泡15 min。首次免疫7 d后同法進(jìn)行加強(qiáng)免疫，對照組僅在1.5%鹽水中浸泡5 min。免疫后每組魚隨機(jī)分成2個平行組，放置在室內(nèi)玻璃缸中充氣飼養(yǎng)。每組浸泡體積為5 L，浸泡疫苗溶液中細(xì)菌抗原濃度為5.2108 CFU/mL。1.5 RT-PCR樣品制備及檢測按照時云朵等2方法進(jìn)行RT-PCR樣品制備及檢測：加強(qiáng)免疫后2 d、4 d、7 d、11 d、14 d和21 d分6次取各組異育銀鯽銀鯽脾臟組織，每組每次分別隨機(jī)取3尾。提取脾臟組織RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲

10、線，以18S rRNA為內(nèi)參，實(shí)時熒光定量PCR檢測異育銀鯽銀鯽IgM、IL-1、補(bǔ)體C3、C-凝集素和溶菌酶5個基因的表達(dá)量。1.6 一次浸泡免疫試驗(yàn)（池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖）將異育銀鯽分為2組，每組200尾，免疫組受免魚在含有復(fù)合佐劑（10 g/mL CPMG和15 g/mL山莨菪堿）的疫苗溶液中充氧浸泡15 min，對照組魚僅在1.5%鹽水浸泡5 min。浸泡體積為30 L，且浸泡疫苗混合溶液中細(xì)菌終濃度不小于3.0 108 CFU/mL。1.7 血清采集及抗體效價測定池塘網(wǎng)箱中的試驗(yàn)魚免疫后每兩周采一次血，持續(xù)8 w后每隔4 w采血一次，直到16 w。每次隨機(jī)采集3-5尾血液，室溫放置2 h，4

11、靜置過夜，8000 g離心10 min，提取血清4保存?zhèn)溆谩４郎y血清預(yù)先稀釋10倍，以棋盤法確定細(xì)菌抗原的最佳包被濃度和二抗（鼠抗鯉科魚IgM單抗）最佳使用濃度，間接ELISA測定血清抗體效價。以S/N（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（陰性對照組OD值-空白組OD值）2.1（S表示樣品OD值，N表示陰性對照的OD值）判為陽性。1.8 活菌攻擊人工感染試驗(yàn)室內(nèi)玻璃缸試驗(yàn)魚在首次免疫30 d，用半數(shù)致死量LD50（8.7106 CFU/mL，0.1mL）的嗜水氣單胞菌菌株YYK090901腹腔注射攻擊各試驗(yàn)組試驗(yàn)魚。池塘網(wǎng)箱試驗(yàn)魚在免疫30 d、60 d、120 d，分別用嗜水氣單胞菌YYK090

12、901菌株（8.7106 CFU/mL, 0.1 mL; 1.5107 CFU/mL, 0.1 mL; 4.0107 CFU/mL, 0.2 mL）腹腔注射攻擊各試驗(yàn)組試驗(yàn)魚。每天觀察記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察14 d。計(jì)算相對免疫保護(hù)率RPS。計(jì)算相對免疫保護(hù)率（RPS）：RPS=（1-免疫組死亡率/對照組死亡率） 100%。1.9 數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差（mean SD）表示，用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），以LSD方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)。2 結(jié)果與分析2.1 IgM、C3、IL-1、C-凝集素和溶菌酶基因的表達(dá)量變化免疫組IgM的基因表達(dá)量明顯高

13、于對照組（P0.05），且免疫組都出現(xiàn)上升下降再回升現(xiàn)象，其中CPMG組在4 d達(dá)到第一個高峰（34.7倍，P0.05），而后下降，在14 d又上升達(dá)到最高值（115.2倍，P0.05）；無佐劑組11 d出現(xiàn)最高值（56.1倍，P0.05），然后14 d呈現(xiàn)下降趨勢（27.8倍，P0.05），在21 d時又出現(xiàn)上升（48.0倍，P0.05）（圖1-1）。免疫組的IL-1的表達(dá)量變化與IgM相似（圖1-2）。CPMG組補(bǔ)體C3在免疫后在7 d達(dá)到最高值（432.9倍，P0.05）；無佐劑組中補(bǔ)體C3在4 d時迅速上升至最高值（135.2倍，P0.05），7 d呈現(xiàn)下降趨勢（80.4倍，P0.05

14、），免疫組的C3表達(dá)量都顯著高于對照組（P0.05）（圖1-3）。CPMG組的C-凝集素基因表達(dá)量同C3相對表達(dá)量的變化趨勢相似，2 d、4 d與對照組相比，并未顯著差異，在7 d達(dá)到最高值（20.7倍，P0.05）；無佐劑組在2 d就達(dá)到最高值（16.4倍，P0.05），然后呈現(xiàn)下降趨勢（圖1-4）。CPMG組的溶菌酶基因在7 d時出現(xiàn)上升（4.6倍，P0.05），14 d達(dá)到最高值（6.6倍，P0.05），在第21 d時還保持高表達(dá)狀態(tài)（4.8倍，P0.05）；無佐劑組中溶菌酶第2 d出現(xiàn)急劇上升現(xiàn)象，并達(dá)到了最高值（12.9倍，P0.05）（圖1-5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫組5個免疫相關(guān)基

15、因的相對表達(dá)量顯著高于對照組（P0.05），）；其中并且CPMG組可以使IgM在免疫后快速表達(dá)，并且使補(bǔ)體C3、C-凝集素以及溶菌酶等免疫相關(guān)基因的表達(dá)量更高或表達(dá)持續(xù)時間更長。（5）（4）（3）（12）（21）（2）（1） （3）（4） （5） 圖1 不同實(shí)驗(yàn)組銀鯽脾臟中各免疫基因的相對表達(dá)量提供未縮小的圖，這些圖清晰度都達(dá)不到本刊要求注：（1）IgM相對表達(dá)量；（2）IL-1相對表達(dá)量；（3）C3相對表達(dá)量；（4）C-凝集素相對表達(dá)量；（5）溶菌酶相對表達(dá)量?！癮”表示對照組與無佐劑組的相對表達(dá)量具有顯著差異（P0.05），“b”表示對照組與山莨菪堿組具有顯著差異（P0.05），“c”表示

16、無佐劑組與山莨菪堿組具有顯著差異（P0.05）Fig.1 The relative expression level of genes in the gibel carp spleen in different experimental groupsNotes: （(1) 1）the relative expression level of IgM; (2)； （2）the relative expression level of IL-1；（3）; (3) the relative expression level of C3； （4）; (4) the relative expressio

17、n level of C-lectin； （5）; (5) the relative expression level of lysozyme. “a” indicates that the relative expression level is significantly different between control group and adjuvant-free vaccine group（(P0.05)P0.05）,” “b”b” indicates that it is significantly different between control group and anis

18、odamine-aadjuvant vaccine group（(P0.05),P0.05）, “c” indicates that it is significantly different between adjuvant-free vaccine group and anisoodamine-adjuvant vaccine group（(P0.05)P0.05）2.2 血清抗體效價ELISA測定血清抗體效價結(jié)果發(fā)現(xiàn)：復(fù)合佐劑和滅活疫苗聯(lián)用一次浸泡免疫異育銀鯽銀鯽，2 w血清抗體效價達(dá)到160，6 w達(dá)到峰值640，8 w為320，12 w降低為40。結(jié)果顯示，復(fù)合佐劑免疫組免疫時間越長

19、，血清抗體效價也越高，在6周達(dá)到最高值，且復(fù)合佐劑浸泡免疫組一次浸泡免疫8 w（約2個月）均有較高的血清抗體效價（圖2）。圖2血清抗體效價一個系列不必用顏色填充注：2 w和4 w的抗體效價是相同的，無顯著差異；12 w和16 w的抗體效價是相同的，無顯著差異；“a”表示6 w與2 w、4 w的抗體效價具有顯著差異（P0.05），“b”表示8 w與2 w、4 w具有顯著差異（P0.05），“c”表示12 w、16 w與2 w、4 w具有顯著差異（P0.05），“d”表示6 w與8 w具有顯著差異（P0.05），“e”表示6 w與12 w、16 w具有顯著差異（P0.05），“f”表示8 w與12

20、 w、16 w具有顯著差異（P0.05） Fig.2 Serum antibody titerNote: The antibody titer is no significantly different between 2 w and 4 w; And it is also no significantly different between 12 w and 16 w; “a” indicates that the antibody titer is significantly different between 6 w and 2 w, 4 w (P0.05) ,“b” indicates

21、 that it is significantly different between 8 w and 2 w, 4 w(P0.05), “c” indicates that it is significantly different between12 w, 16 w and 2 w, 4 w（P0.05）, “d” indicates that it is significantly different between 6 w and 8 w(P0.05), “e” indicates that it is significantly different between 6 w and 1

22、2 w,16 w(P0.05), “f” indicates that it is significantly different between 8 w and 12 w,16 w(P0.05)注：2 w和4 w的抗體效價是相同的，無顯著差異；12 w和16 w的抗體效價是相同的，無顯著差異；“a” 表示6 w與2 w、4 w的抗體效價具有顯著差異（P0.05），“b” 表示8 w與2 w、4 w具有顯著差異（P0.05），“c” 表示12 w、16 w與2 w、4 w具有顯著差異（P0.05），“d” 表示6 w與8 w具有顯著差異（P0.05），“e” 表示6 w與12 w、16 w具有

23、顯著差異（P0.05），“f” 表示8 w與12 w、16 w具有顯著差異（P0.05） Fig.2 Serum antibody titerNote: The antibody titer is no significantly different between 2 w and 4 w; And it is also no significantly different between 12 w and 16 w; “a”indicates that the antibody titer is significantly different between 6 w and 2 w, 4 w

24、（P0.05）, “b”indicates that it is significantly different between 8 w and 2 w, 4 w（P0.05）, “c”indicates that it is significantly different between12 w, 16 w and 2 w, 4 w（P0.05）, “d”indicates that it is significantly different between 6 w and 8 w（P0.05）, “e”indicates that it is significantly different

25、 between 6 w and 12 w,16 w（P0.05）, “f” indicates that it is significantly different between 8 w and 12 w,16 w（P0.05）2.3 加強(qiáng)加強(qiáng)免疫組后的活菌攻擊人工感染試驗(yàn)結(jié)果（室內(nèi)玻璃缸）人工感染活菌攻擊室內(nèi)玻璃缸中二次加強(qiáng)浸泡免疫的異育銀鯽銀鯽顯示，各組集中死亡時間在活菌攻擊后12-48 h，2 d后無死亡現(xiàn)象發(fā)生。CPMG組、復(fù)合佐劑組、無佐劑組和對照組的累計(jì)死亡率分別為25.00%、10.00%、36.67%、83.33%（表1）。CPMG組的相對免疫保護(hù)率RPS為70.6%，復(fù)合

26、佐劑組的相對免疫保護(hù)率可高達(dá)88.2%，均顯著高于無佐劑疫苗組的56.0%（P0.05）。表1 各試驗(yàn)組的相對保護(hù)率Tab.1 The relative percent survival in the different experimental groups組別groups攻擊人工感染數(shù)/尾challenged fish number死亡數(shù)/尾dead fish number死亡率%mortality平均死亡率%average mortalityRPS%CPMG組CPMG-adjuvant vaccine 30723.3325.0070.630826.67復(fù)合佐劑組CPMG and anis

27、odamine- adjuvant vaccine30310.0010.0088.230310.00無佐劑組adjuvant-free vaccine 301033.3336.6756.0301240.00對照組saline control302686.6683.33/302480.002.4 一次浸泡免疫組的活菌攻擊人工感染結(jié)果（池塘網(wǎng)箱）活菌攻擊池塘網(wǎng)箱中一次浸泡免疫的異育銀鯽感染銀鯽結(jié)果顯示，每次（免疫30 d、60 d、120 d）活菌攻擊人工感染后，各組試驗(yàn)魚集中死亡時間在12 h-72 h，4 d后無死亡現(xiàn)象。免疫30 d的平均相對保護(hù)率為54.6%，60 d為44.0%，120

28、d下降為12.5%（表2）。表2 各試驗(yàn)組的相對保護(hù)率Tab.2 The relative percent survival in the different experimental groups組別groups活菌攻擊人工感染時間challenging time攻擊感染數(shù)/尾challenged fish number死亡數(shù)/尾dead fish number死亡率%mortality平均死亡率%average mortalityRPS%復(fù)合佐劑組CPMG and anisodamine- adjuvant vaccine30 d2073537.554.620840對照組saline co

29、ntrol20168082.5/201785復(fù)合佐劑組CPMG and anisodamine- adjuvant vaccine60 d2073535.044.020735對照組saline controsaline control20126062.5/201365復(fù)合佐劑組CPMG and anisodamine- adjuvant vaccine120 d20178587.512.5201890對照組saline control2020100100.0/20201003. 討 論本研究將蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷(CPMG)與嗜水氣單胞菌滅活疫苗聯(lián)用，浸泡免疫異育銀鯽，并通過RT-PCR

30、測定了先天性免疫因子IL-1、補(bǔ)體C3、C-凝集素以及溶菌酶基因和獲得性免疫因子IgM基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CPMG組和無佐劑組中5種免疫相關(guān)因子的表達(dá)量都顯著高于對照組（pP0.05）。CPMG組補(bǔ)體C3和C-凝集素基因的相對表達(dá)量均顯著高于無佐劑疫苗組（P0.05）和對照組（P0.05），且溶菌酶基因表達(dá)持續(xù)時間更長。盡管目前對某一功能基因表達(dá)量與其編碼蛋白的表達(dá)量的關(guān)系還沒有定論，但隨著RT-PCR技術(shù)的興起，國內(nèi)外許多學(xué)者評價佐劑在漁用疫苗中的功效時，將先天性和獲得性免疫相關(guān)因子的基因表達(dá)情況作為一項(xiàng)評價指標(biāo)。大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridov

31、irus , ，TRBIV)的殼聚糖核酸納米粒疫苗（pDNA-CS-NPs）口服免疫大菱鲆（Turbot），能誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的先天性和特異性免疫應(yīng)答，MHC-I、MHC-Ii、IFN-1、IFN-、Mx-1、IL-8和Mx基因表達(dá)量顯著上調(diào)，免疫90 d仍可檢測到抗體3。鞭毛蛋白（flagellin）能刺激大西洋鮭魚（Atlantic salmon）TNF、IL-6、IL-8和IL-1基因表達(dá)量顯著上調(diào)，但不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著的抗體4。遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)的重組主要菌毛亞單位蛋白（rFimA）作為佐劑與哈維氏弧菌(Vibrio harveyi) 重組亞單位疫苗rV

32、hhP2同時注射免疫比目魚(Turbot)，免疫1 d脾臟中IgM基因相對表達(dá)量比對照組顯著提高5。Diao等6將-葡聚糖、脂多糖（LPS）分別與遲緩愛德華菌的3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase, ，GAPDH) 重組蛋白注射免疫牙鲆，IgM、IFN-、IL-1、IL-6、TCR、MHC-II和溶菌酶基因表達(dá)量均上調(diào)，且脂多糖、-葡聚糖組的顯著高于無佐劑組。本研究中CPMG組與無佐劑組的IgM和IL-1表達(dá)量都呈現(xiàn)上升、下降再回升的表現(xiàn)，這與用山莨菪堿佐劑與疫苗共浸泡免疫鯽的IgM和IL-1基因表達(dá)量變化相似2，也與LPS作

33、為佐劑免疫牙鲆IgM基因表達(dá)量變化相似6。Paulsen等7將-葡聚糖和脂多糖腹腔注射大西洋鮭（Atlantic salmon），7 d、14 d、21 d頭腎、脾臟和腸的溶菌酶mRNA表達(dá)量都顯著上調(diào)，且21 d仍有較高表達(dá)量。但Selvaraj等8將-葡聚糖和脂多糖混合物注射、浸泡和口服鯉（Carp），發(fā)現(xiàn)三種途徑免疫24 h、48 h的 IL-1基因相對表達(dá)量均與對照組差異不顯著。Jiao等9用遲緩愛德華菌 (Edwardsiella tarda)滅活疫苗免疫牙鲆（Japanese flounder），弗氏不完全佐劑（FIA）能增強(qiáng)IgM、C3、MHC- I、MHC- II、CD8、CD

34、40、Mx、IFN-、TNF- 及IL-6基因表達(dá)量，而無佐劑疫苗組僅能引起IgM、MHC-、MHC-MHC I、MHC II、Mx基因表達(dá)。 基因小寫，斜體浸泡免疫途徑實(shí)用性強(qiáng)，國外已有殺鮭弧菌、魯氏耶爾森氏菌等浸泡型商品化菌苗10。研究表明超聲波預(yù)先處理受免魚、高滲溶液浸泡，可以增強(qiáng)抗原的遞呈和抗體產(chǎn)生：，：Navot等11研究發(fā)現(xiàn)超聲波能提高金魚（Goldfish）皮膚對牛血清白蛋白（BSA）的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)能力和魚體抗體的產(chǎn)生。Zhou等12用脈沖式超聲波處理石斑魚(grouper)可以顯著提高溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）全菌滅活疫苗浸泡免疫效果，保護(hù)率與注射免疫的相

35、當(dāng)（95%）。Huising 等13研究發(fā)現(xiàn)高滲浸泡比直接浸泡能激起鯉魚（Common carp）更強(qiáng)的先天性免疫應(yīng)答和特異性黏膜免疫應(yīng)答。另外，通過添加適量佐劑和載體也能提高各類滅活疫苗、亞單位疫苗的浸泡免疫效果：Kai等14將甲醛滅活的野田村病毒（formalin- inactivated betanodavirus）制備成納米粒，浸泡免疫斜帶石斑魚魚種，相對保護(hù)率可以從39%-%-43%提高到85%，有效降低病毒性神經(jīng)壞死（viral nervous necrosis, VNN）造成的死亡率。王秀華等15研究發(fā)現(xiàn)皂角苷(saponin )提高牙鲆鰻弧菌(Vibrio anguillaru

36、m)滅活疫苗浸泡免疫效果，皂角苷組的相對保護(hù)率為72%，且以皂角苷為主的多組合佐劑組可以達(dá)到83%，而無佐劑組僅有27%；皂角苷提高羅非魚(Tilapia)點(diǎn)狀氣單胞菌(Aeromonas punctata)滅活疫苗浸泡免疫效果，相對保護(hù)率分別為78.5%，而無佐劑組的分別為54.1%。吳宗福等16用嗜水氣單胞菌-hemA -ISCOMs疫苗浸泡免疫鰻鱺(Eel)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和抗體效價均顯著高于IMS 1312 佐劑組與無佐劑組。Fan等17應(yīng)用含氫氧化鋁膠的虹彩病毒滅活疫苗(Inactivated iridovirus vaccine)兩次浸泡免疫大菱鲆(Turbot)，相對保護(hù)率達(dá)到9

37、0.5%。張吉紅等將18 IMS 1312與嗜水氣單胞菌滅活疫苗合用浸泡免疫銀鯽，相對保護(hù)率RPS可達(dá)67%，而無佐劑疫苗組的為56%。本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)山莨菪堿能顯著提高嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫銀鯽效果，使相對保護(hù)率RPS 從56.0%提高到80.0%2。本研究中，二次浸泡免疫顯示，CPMG使受免魚相對保護(hù)率達(dá)到70.6%，且CPMG和山莨菪堿復(fù)合佐劑組的RPS達(dá)到88.0%，均顯著高于無佐劑組的56.0%。網(wǎng)箱試驗(yàn)中，CPMG和山莨菪堿復(fù)合佐劑與嗜水氣單胞菌滅活疫苗一次浸泡免疫鯽魚，也可產(chǎn)生較高的血清抗體效價和免疫保護(hù)率。山莨菪堿能使平滑肌松弛并解除血管痙攣，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和擴(kuò)張微血管作用

38、19，已有研究表明其作為浸泡佐劑能顯著提高疫苗免疫效果2,20。本研究中，加強(qiáng)免疫后CPMG組的相對保護(hù)率達(dá)到70.6%，且CPMG和山莨菪堿復(fù)合佐劑組的達(dá)到88.0%，均顯著高于無佐劑組的56.0%?？梢姡珻PMG和山莨菪堿聯(lián)合使用的效果更好，這可能是因?yàn)閮烧叩膮f(xié)同作用是否，因?yàn)镃PMG的親水親脂特性有利用顆粒性抗原或其他佐劑（如：山莨菪堿）進(jìn)入魚體，從而激發(fā)魚體相關(guān)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，還有待進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn):格式不對，參照本刊網(wǎng)站左側(cè)寫作模板的要求修改，1 WU S Q,TAO J F,GONG H, et al. Status and future strategy of vaccin

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