Real_timePCR技術(shù)在食物中毒副溶血性弧菌快速檢測(cè)中.

1、CHINA TROPICAL M EDICINE Vol.lONo.llNovem ber 2010 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)2010年第10卷第11期論著細(xì)菌性食物中毒是常見(jiàn)的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，食物中毒事件病原菌的快速檢測(cè)是 疾病預(yù)防控制工作的重要內(nèi)容。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒 光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程,最后通 過(guò) 標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析口，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的技術(shù)特點(diǎn)，近年來(lái) 在生物因子導(dǎo)致的突發(fā)公共衛(wèi)生事件病原學(xué)診斷中得到廣泛應(yīng)用。將傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)技術(shù)與Real-time PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)工作,有

2、利于分子生物學(xué)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用和推廣?，F(xiàn)就一起食物中毒事件處理中應(yīng)用 Real-time PCR技術(shù)快速檢測(cè)副溶血性弧菌的結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1材料1.1.1儀器MINI OPT ICO N實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)BIORAD公司；VITEK 2-COM PACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分 析儀及GN細(xì)菌生化鑒定卡（法國(guó)生物梅 里 埃公司。1-1.2培養(yǎng)基及試劑CHROM agar弧菌顯色分離培養(yǎng)基（鄭州安圖公司,營(yíng)養(yǎng)肉 湯、3.5%氯化鈉堿性陳水、哥倫比亞血瓊脂平板、革蘭氏染色液（北京陸橋公司、氧 化酶試劑（美國(guó)BD公司。副溶血弧菌Real-time PCR檢測(cè)試劑盒（廣州中ill達(dá)安基

3、因 生物公司。以上試劑均在有效期內(nèi)使用。1-1.3樣本來(lái)源2008年9月16日23時(shí)，接柳州市食源性疾監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院一柳州 市第三人民醫(yī)院報(bào)告：柳州鐵路運(yùn)輸學(xué)校 有20多名學(xué)生食用同學(xué)自北海市家中帶 來(lái)的 海蝦和貝類后26h發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉癥狀陸續(xù)到該院就診，匸不 疑細(xì)菌性食物中毒。柳州市疾病預(yù)防控制中心突發(fā)事件應(yīng)急處理小組及時(shí)開(kāi)展了現(xiàn)場(chǎng)流調(diào)，因?yàn)闆](méi)有剩余食物，未采到食剩的海蝦貝類，僅對(duì)4位住院學(xué)生采集肛拭子 送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)食源性致病菌。1 -2方法1.2.1樣本處理 根據(jù)流調(diào)結(jié)果和患者發(fā)病前共同進(jìn)食的食 物特點(diǎn)和發(fā)病癥狀， 對(duì)肛拭子開(kāi)展副溶血性弧菌檢測(cè)。121.1增菌前樣本處理 將肛拭

4、子樣本置3.5%氯化鈉堿性 豚水中用微型振蕩器振蕩 30s洗脫肛拭子上附著糞便樣本與增菌培養(yǎng)基混勻，從中取約0.5ml置4C冰箱保存。 此為增菌前 樣本液,4份增菌前樣本液編號(hào)為080916a、080916b、080916c、080916d。1.2.1.2樣本增菌液制備 參照WS/T271 -20072分別用3.5%氯化鈉堿性陳水對(duì)樣本增菌6h后制得樣本增菌液，采用Real-time PCR技術(shù)和細(xì)菌培養(yǎng)分離與儀器鑒定試驗(yàn)技術(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。4份增菌后的樣本增菌液編號(hào)為080916A、080916B、080916C、080916D。122Real-time PCR 檢測(cè)試驗(yàn)1-2.2.1核酸提取

5、取每份增菌前樣本液和樣本增菌液各50卩加入副溶血弧菌熒光定 量PCR檢驗(yàn)試劑盒配套的核酸提取試劑50卩I混勻置100C裂解10min后，12000轉(zhuǎn)/min分高 速離心5min,取上清液2卩作為模板用于Real-time PCR檢測(cè)畐IJ 溶血性弧菌核酸。1.222Real-time PCR檢測(cè)副溶血性弧菌核酸采用/MINIReal-time PCR技術(shù)在食物中毒副溶血性弧菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用陳柳軍，秦景新，鄒碧，余鈞池,蒙曉輝摘要：目的介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR技術(shù)快速食物中毒檢測(cè)的應(yīng)用。方法運(yùn)用Real-time PCR檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)增菌前后的食物中毒事件樣本檢測(cè)副溶 血性

6、弧菌的保守基因片段。結(jié)果Real-time PCR檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)增菌后的樣本檢測(cè)到 的副溶血性弧菌核酸的熒光強(qiáng)度均高于增菌前的樣本，證實(shí)樣本增菌后目標(biāo)菌生長(zhǎng)繁殖, 樣本中存在具有生物學(xué)活性感染力的副溶血性弧菌。結(jié)論在食物中毒致病菌的篩查確 證工作中，與傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的Real-time PCR技術(shù)值得應(yīng)用和推廣。1-2.3.1細(xì)菌培養(yǎng)分離取樣本增菌液接種CHROM agar弧菌顯色分離培養(yǎng)基36.5C培養(yǎng)20h后挑取培養(yǎng)基上紫紅色可疑目的菌落接種哥倫比亞血瓊脂平板純 培養(yǎng),36.5C培養(yǎng)20h后取平板上培養(yǎng)物做革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)做氧化酶試驗(yàn)。1.2.3.2菌懸液制備 分別來(lái)自4份樣本的

7、可疑菌落在哥倫比亞血瓊脂平板上純培養(yǎng) 物革 蘭氏染色鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性短小桿菌，氧化酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性。取培養(yǎng) 物與 0.85%NaCI配成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙禾畛銰N細(xì)菌生化鑒定卡，用VIT EK 2-COM PACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀檢測(cè)鑒定。2結(jié)果2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果力INI OPT ICON實(shí)時(shí)熒光 定量PCR儀在上 樣 2h后對(duì)4份增菌前樣本液和4份樣本增菌 液的檢測(cè)結(jié)果熒光強(qiáng)度曲線圖均顯示檢出副 溶血弧菌DNA,但樣本增菌后的熒光強(qiáng)度明顯高于樣本增菌前（樣本增菌前后Real time PCR檢測(cè)結(jié)果熒光強(qiáng)度曲線見(jiàn)圖1 , Ct值則相反,說(shuō)明樣本增菌后其中存在 的副

8、溶血性弧菌有生長(zhǎng)繁殖現(xiàn)象，從而證明樣本中存在具有生物學(xué)活性感染力的副溶血 性弧菌。圖14份樣本增菌前后Real time PCR檢測(cè)結(jié)果熒光強(qiáng)度曲線2.2細(xì)菌培養(yǎng)分離與儀器鑒定試驗(yàn)結(jié)果 填充菌液后GN細(xì)菌生化鑒定卡置VITEK2 - COM PACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀檢測(cè)箱中，儀器按程序開(kāi)展檢測(cè)工 作。 上機(jī)4h后細(xì)菌鑒定儀報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，4份樣本均檢出副溶血性弧菌，id為99% （很好的鑒定。234份肛拭子檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：均檢出副溶血性弧菌。3討論雖然本次事件調(diào)查沒(méi)有剩余食物檢驗(yàn)結(jié)果的旁證，只有疑似食物中毒患者的肛拭子 樣本檢出副溶血性弧菌，但根據(jù)食物中毒流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀、副溶血 性

9、弧菌的生 物學(xué)特性等，可以判斷該事件是一起食用了副溶血性弧菌污染的海產(chǎn)品引起的食物中 毒。副溶血性弧菌是主要的食源性致病菌之一，其引發(fā)的食物中毒在南方地區(qū)經(jīng)常發(fā)生。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法存在中間環(huán)節(jié)多、速度慢、準(zhǔn)確性差、時(shí)效性明顯不能滿足檢測(cè)快速及時(shí)要求的缺陷3,如食品污染畐IJ溶血性弧菌檢測(cè)鑒定通常需要經(jīng)過(guò)增菌、選擇性分離、目的菌純培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清凝 集試驗(yàn)鑒定確認(rèn)等步驟，操作繁瑣，耗時(shí)一般為57d,甚至更長(zhǎng)時(shí)間。使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀檢測(cè)鑒定細(xì)菌，縮短了生化試驗(yàn)時(shí)間，但該儀器需根據(jù)細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢和氧化酶試驗(yàn)結(jié)果選擇儀器配套生化鑒定卡開(kāi)展以生化反應(yīng)結(jié) 果為依據(jù)的細(xì)菌鑒定工作，無(wú)法節(jié)省目的菌

10、分純培養(yǎng)的一系列實(shí)驗(yàn)工作，對(duì)食品污染副 溶血性弧菌檢測(cè)鑒定約需23d。Real-time PCR檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)食品污染副溶血性弧菌的 鑒定，由于特殊的檢測(cè)工作原理，無(wú)需針對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，樣本采集后34h內(nèi)就能檢測(cè)出樣 本是否存在副溶血性弧菌的典型基因片段。但由于PCR技術(shù)主要針對(duì)生物因子核酸片段檢測(cè)而言，檢測(cè)結(jié)果得不到可以進(jìn)行活體保存的 病原體幵展研究工作4,從而無(wú)法確定檢測(cè)到的核酸片段是否來(lái)源于具有生物學(xué)活性和感 染力的病原菌，對(duì)于證實(shí)感染食源性致病菌引發(fā)食物中毒不能直接舉證,因此檢驗(yàn)結(jié)果有時(shí)不能作為公共衛(wèi)生突發(fā)事件病原學(xué)診斷依據(jù)。為了證實(shí)樣 本中確實(shí)存在具有生物活性感染力的致病菌,必須

11、將Real-time PCR技術(shù)與傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)適當(dāng)?shù)脑鼍绞椒敝硺颖局械臋z測(cè)目的菌后，對(duì)增菌前 后的樣本同時(shí)運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)目的菌核酸。由于核酸擴(kuò)增指數(shù)期取決于 PCR模板的相對(duì)量，原始模板越多，達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增期所需的擴(kuò)增循環(huán)周期數(shù)(Ct值越少5,如果目的菌增菌后的核酸模板在PCR達(dá)到指數(shù)循環(huán)時(shí)的Ct值低于增菌 前的核酸模板在PCR達(dá)到指數(shù)循環(huán)時(shí)的Ct值，表明增菌后的核酸原始模板量高于增菌前的核酸原始模板量，即細(xì)菌通過(guò)增菌得到增殖，則可以證實(shí)該病原體是具有 生物活性的病原菌。本次食物中毒事件處理，由于流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果傾向于副溶血性弧菌是導(dǎo)致本 次事 件發(fā)生的主要致病微生物，因此實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)忽略其他食源性致病菌的檢測(cè)。在流行病學(xué)證據(jù)很難支持判斷引發(fā)事件的病原生物因子范疇時(shí)，應(yīng)加大食源性致病生物 因子的檢測(cè)范圍，而Real-time PCR檢測(cè)技術(shù)操作手續(xù)簡(jiǎn)單、診斷時(shí)間耗時(shí)短、靈敏度高、特異性強(qiáng)的先進(jìn)技術(shù)優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)更加明顯。因此，在食物中毒致病菌的篩 查確證工作中，與傳統(tǒng)微 生物檢驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的Real-time PCR技術(shù)值得應(yīng)用和推廣。參考文獻(xiàn):趙煥英，包金鳳實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展J中國(guó)組 織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007, 16(4 :4924972中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). 感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)S 北京,2007