提高缺氧耐受力功能評(píng)價(jià)方法及修訂說明

1、附件 5： 提高缺氧耐受力功能評(píng)價(jià)方法（征求意見稿） 保健食品評(píng)價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 試驗(yàn)項(xiàng)目 體重 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)：存活時(shí)間 常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)：紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白，丙二醛（MDA）,總抗氧化能力（T-AOC 亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)： 1.4.1 缺氧損傷實(shí)驗(yàn) : 高鐵血紅蛋白含量（ MetHb ） 1.4.2 缺氧存活實(shí)驗(yàn) : 存活時(shí)間 2 試驗(yàn)原則 所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目 3 結(jié)果判定 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)、常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任兩 項(xiàng)結(jié)果陽性可判定受試樣品具有提高缺氧耐受力功能

2、。 其中缺氧存活實(shí)驗(yàn)、缺氧損傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性可判定亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí) 驗(yàn)結(jié)果陽性。 提高缺氧耐受力功能檢驗(yàn)方法 Method for the Assessment of Enhancing Anoxia Endurance Function 1.常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 原理 缺氧對(duì)機(jī)體是一種緊張性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧 化供能，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的心、腦等主要器官缺氧供能不足而死亡。 材料 250mL 磨口瓶、秒表、凡士林、鈉石灰（或等量氫氧化鈉和碳酸鈣） 。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 推薦用近交系成年小鼠，單一性別，小鼠體重 1822 克，每組 10-15 只。 實(shí)驗(yàn)方法 1.4.1 劑量和分組

3、 至少設(shè)三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。以人體推薦量的 10 倍為其中的一個(gè)劑 量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，最高劑量不得超過人體推薦量的 30 倍。 1.4.2 受試樣品的給予 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時(shí)將受試樣品摻入飼料，并記錄每只動(dòng) 物的飼料攝入量。受試樣品給予時(shí)間 30 天，必要時(shí)可以延長至 45天。 1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，對(duì)照組給予純凈水。將動(dòng)物每周稱重兩次， 按體重調(diào)整給予受試樣品的量。各組于末次灌胃后 1 小時(shí)，將各組小鼠分別放 入盛有5g鈉石灰的250mL磨口瓶內(nèi)（每瓶1只），用凡士林封瓶口，蓋嚴(yán)，使 之不漏氣，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠死亡的時(shí)間。

4、 1.4.4 檢測(cè)指標(biāo) 小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一 個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適 當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果判定 受試樣品組與對(duì)照組比較，存活時(shí)間延長，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定該 實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。 注意事項(xiàng)： 1.7.1 每個(gè)磨口瓶內(nèi)只放 1 只小鼠。 1.7.2 磨口瓶一定要密閉封嚴(yán)，以防漏氣，否則會(huì)影響

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1.7.3磨口瓶必須等容量（誤差1ml），實(shí)驗(yàn)前先用水加以校正。 1.7.4 每批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重應(yīng)盡量保持一致。 2 常壓缺氧損傷模型實(shí)驗(yàn) 原理 在總大氣壓保持不變的情況下，降低空氣中氧的百分含量，機(jī)體吸入氧量 降低，導(dǎo)致血液中氧含量降低，組織細(xì)胞不能從血液中獲得充足的氧而使能量 代謝障礙，導(dǎo)致重要臟器組織細(xì)胞的損傷。 儀器 低氧分壓呼吸效應(yīng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、血細(xì)胞分析儀、可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、 微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 推薦用近交系成年小鼠，單一性別，體重 18-22g,每組10-15只。 實(shí)驗(yàn)方法 2.4.1 劑量和分組 至少設(shè)

6、三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組二個(gè)對(duì)照組。以人體 推薦量的 10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，最高劑量不得超過人體 推薦量的 30 倍。 2.4.2 受試樣品的給予 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，受試樣品給予時(shí)間 30 天，必要時(shí)可以延長至 45 天。 2.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟 2.4.3.1 造模方法 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組給予同等容量溶劑。 將動(dòng)物每周稱重兩次，以調(diào)整受試樣品劑量。每次給予樣品后，將模型對(duì)照組 與各劑量組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依次放入常壓缺氧裝置中，通過充入氮?dú)夥椒ò蜒b置內(nèi) 的氧含量從 21%大氣氧含量調(diào)整下降至 % 氧含量，維持此低氧含量處理樣品 組和

7、模型對(duì)照組動(dòng)物68 h/天，每周56 次,連續(xù)23周。末次缺氧處理后， 采血并取腦進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。 2.4.4 指標(biāo)檢測(cè) 體重、血紅蛋白含量（Hb）、腦勻漿丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOQ。 2.4.4.1 血紅蛋白含量測(cè)定方法 EDTA- K2能與血液中的鈣離子結(jié)合成為螯合物，從而阻止血液凝固，全血 抗凝后用一般血常規(guī)檢驗(yàn)的血細(xì)胞分析儀檢測(cè) （儀器法 ）。 2.4.4. 試劑配制 乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2 2H2O,）,稱量8mg EDTAK?加純凈水至100ml 制成抗凝劑，50卩抗凝劑可抗凝1ml小鼠全血。的EDTAK2可阻止1ml血液 凝固。 2.44采血 以摘除小

8、鼠眼球的方法采集全血，采用干凈無菌的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè) 或雙側(cè)眼球，讓血液自由滴入裝有抗凝劑的離心管（或商品化的抗凝管）中， 采血過程中不斷混勻血液與抗凝劑防止血液凝固，每只動(dòng)物采集抗凝全血約 1ml。 2.4.4. 檢測(cè)分析 上機(jī)前血液顛倒混勻，注意檢查是否存在凝塊。在24h內(nèi)以全血細(xì)胞分析 儀檢測(cè)血液紅Hb。上機(jī)操作參照儀器說明書。 2.4.4.2組織中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測(cè)定 2.4.4. 原理 MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測(cè)其含量可 間接估計(jì)脂質(zhì)過氧化的程度。1個(gè)丙二醛（MDA）分子與2個(gè)硫代巴比妥酸（TBA） 分子在酸性

9、條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)在波長532nm有極大吸收 峰?？捎梅止夤夥ㄟM(jìn)行測(cè)定。 2.4.4. 試劑 0.2M乙酸鹽緩沖液 0.2M乙酸溶液 185mL 0.2M乙酸鈉溶液15mL 1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4 C保存3個(gè)月），臨用前用水稀釋 成 40nmol/mL %十二烷基硫酸鈉SDS %硫代巴比妥酸TBA 0.2M磷酸鹽緩沖液 0.2M磷酸氫二鈉1920mL 0.2M磷酸二氫鉀480mL 2.4.4. 實(shí)驗(yàn)步驟 2.4.4. 樣品制備 組織勻漿樣品：取一定量的大腦組織，生理鹽水沖洗、拭干、稱重，置勻 漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，

10、間歇30s,反復(fù)進(jìn) 行3次，制成10%組織勻漿（W/V），3000r/min離心5- 10min，取上清液待測(cè)。 試劑 空白管 樣品管標(biāo)準(zhǔn)管 2.4.4. 樣品測(cè)定 4乙氧基丙烷四 0.2 %TBA 混勻,H避光沸水浴 60min，流水冷卻，： 注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求 進(jìn)行 .B - A =x Cx K = 2.44計(jì)算 （nmol/mg組織）F - A F - Ax 10%x 1000 A:空白管吸光度 B:樣品管吸光度 F:四乙氧基丙烷吸光度 C:四乙氧基丙烷濃度（40nmol/mL ） K:稀釋倍數(shù) 2.443組織中總抗氧化能力（T-AOC測(cè)定方法 2.4.4. 原理 機(jī)體

11、中有許多抗氧化物質(zhì)，能使 F+還原成Fe3：后者可與菲啉類物質(zhì)形成 穩(wěn)定的橙黃色絡(luò)合物，通過在 520nm比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。 2.4.4. 試劑 采用商品試劑盒：抗氧化能力（T-AOC測(cè)定試劑盒。 2.4.4. 樣品制備 準(zhǔn)確稱取腦組織重量，按重量體積比加9倍生理鹽水，以20000r/min勻漿 10s,間歇30s,反復(fù)進(jìn)行3次，制成10%組織勻漿（W/V ）, 20002500r/min 離心10min，取上清液待測(cè)。同時(shí)用雙縮脲試劑測(cè)定10%腦組織勻漿蛋白。 2.44樣品測(cè)定：按試劑盒的操作要求進(jìn)行。 如： 試劑 對(duì)照管樣品管 10 %腦組織勻 （mL）（mL） 試劑 漩渦混勻

12、器、 、亠、E浴30分鐘 待試劑四本a * 卡丿冊(cè)放置、盼 零1cm光徑，520 考取樣量： 37C 水 mL 鐘，蒸餾水調(diào) nm測(cè)各管吸光度。 *參考取樣量：10%組織勻漿參 a 2.4.4. 計(jì)算 ODu-ODc 位定管吸I數(shù)（反應(yīng)液總體積/ 30 （單位化能力亡 取樣量反應(yīng)體系 （樣船）稀釋倍數(shù)待測(cè)樣本蛋白濃度 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值，各組均數(shù)間差異無顯著性；F值，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照 組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖?量轉(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變

13、量轉(zhuǎn)換 后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果判定 模型對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，Hb、MDA升高、T-AOC含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué) 顯著性意義（P）,表示模型成立。在模型成立的前提下，受試樣品組MDA含 量降低或T-AOC含量升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P）,且Hbv 210g/L,判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果陽性。 注：紅細(xì)胞增多癥評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考值 Hb 210g/L。 3 亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn) 原理 亞硝酸鈉使二價(jià)鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)鐵血紅蛋白，生成高鐵血紅蛋白 （MetHb）,破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織細(xì)胞缺氧，隨著亞硝酸鈉劑量的 增加， MetHb 含量增加，導(dǎo)致組織缺氧直至死亡。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)

14、物 推薦使用近交系成年雄性小鼠，體重 1822g,每組1015只。 材料 亞硝酸鈉,20卩毛細(xì)管，1ml注射器，秒表。 劑量分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性對(duì)照組，以人體推薦量的 1 0倍為其中的一個(gè) 劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組。受試樣品給予時(shí)間 30天。 缺氧損傷實(shí)驗(yàn) 3.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟 各劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，陰性對(duì)照組按等同容量灌胃給予溶 劑，連續(xù)30天,于末次給樣后1小時(shí)，各組按80100mg/kg BW劑量腹腔注射 亞硝酸鈉（注射量為10g BW）,1h、2h各采血一次，測(cè)全血高鐵血紅蛋白（MetHb） 含量。 3.5.2全血高鐵血紅蛋白（MetHb）含量測(cè)定方法 （參照 G

15、B 87881988 高鐵血紅蛋白定量測(cè)定法 ） 3.5.2.1 原理 高鐵血紅蛋白在波長 630nm 處有一特有的吸收光帶，當(dāng)加入氰化物后，高 鐵血紅蛋白即轉(zhuǎn)化為氰化血紅蛋白，此吸收光帶亦隨即消失。因此加入氰化物 前后用分光光度計(jì)（或光電比色計(jì)）測(cè)定其吸光度之差，按標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算高鐵血紅 蛋白的含量。 3.5.2.2 試劑 1/15M磷酸氫二鈉溶液：準(zhǔn)確稱取 Na2HPO432H20 23.87g,用蒸餾水溶解稀 釋至 1L。 1/15M磷酸二氫鉀溶液：準(zhǔn)確稱取KH2PO4 9.07g,用蒸餾水溶解稀釋至 1L。 1/60MpH 磷酸鹽緩沖液：量取 1/15M 磷酸氫二鈉溶液, 1/15M 磷酸二

16、氫 鉀溶液，蒸餾水30m1,混合后即可使用（此液用時(shí)配制）。 5（ W/V ）氰化鉀（鈉）溶液。 5（ W/V ）高鐵氰化鉀溶液。 1 triton X 1 00 （辛烷基酚聚氧乙烯醚）溶液。 3.5.2.3 操作步驟 取2支小試管，以“A” “ B編號(hào)，各加1/60M磷酸鹽緩沖液，被檢查末 梢血40卩,1% triton X 100?！癆”管于630nm波長，以磷酸鹽緩沖液或蒸餾 水調(diào)零測(cè)得吸光度為D1后，加入5%氰化鉀（鈉）溶液50卩,1混勻，放置2min， 以同樣波長測(cè)得吸光度為 D2。 “ B”管加入5%高鐵氰化鉀溶液50門在25min 后，在630nm波長處測(cè)得吸光度為D3,然后加入

17、5%氰化鉀（鈉）液50,1混 勻，放置2min，以同樣波長測(cè)得吸光度為 D4。 3.5.2.4 計(jì)算方法 D1D2 高鐵血紅蛋白 / 總血紅 蛋白（%） X 100 D3D4 3.5.2.5 方法說明 高鐵血紅蛋白形成后，由于紅細(xì)胞中還原酶的存在，可使高鐵血紅蛋白逐 漸還原消退，因此必須立即采樣，若現(xiàn)場(chǎng)不能分析，可將抗凝血直接采于緩沖 液內(nèi)，貯存在24C冰壺內(nèi)（保存期不超過10h）,帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定。抗凝劑以 肝素為佳，禁用草酸鹽，因其會(huì)導(dǎo)致高鐵血紅蛋白生成。 本法必須使用分辨能力強(qiáng)的分光光度計(jì)，而且在使用前必須校驗(yàn)分光器的 波長是否準(zhǔn)確。 全血在加入試劑后，血細(xì)胞破壞。由于少量碎片的存在，使溶

18、液發(fā)生混濁， 影響吸光度（尤其是正常人會(huì)出現(xiàn)負(fù)值） ，使用非離子表面活性劑 triton X 100 稀釋液，或經(jīng)過離心步驟可克服血紅蛋白的混濁。 缺氧存活實(shí)驗(yàn) 3.6.1 實(shí)驗(yàn)步驟 各劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，陰性對(duì)照組按等同容量灌胃給予溶 劑，連續(xù) 30天,于末次給樣后 1 小時(shí)，各組按 200240mg/kg BW 劑量腹腔注射 亞硝酸鈉（注射量為10g）,立即計(jì)時(shí)，記錄動(dòng)物存活時(shí)間。 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值，各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照 組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)非正態(tài)或方差不齊

19、的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖?量轉(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換 后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果判定 亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)： 缺氧損傷實(shí)驗(yàn)、 缺氧存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性可判定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。 其中受試樣品組MetHb含量在1h和2h任一時(shí)點(diǎn)的降低與陰性對(duì)照組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定缺氧損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性 。 受試樣品組與對(duì)照組比較， 存活時(shí)間延長，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定缺氧存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。 4 提高缺氧耐受力結(jié)果斷定 : 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)和亞硝酸鈉缺氧實(shí)驗(yàn)中的任二項(xiàng)陽性， 可判定受試樣品具有提高缺氧耐受力功能作用。 提高

20、缺氧耐受力功能評(píng)價(jià)方法修訂說明 一、承擔(dān)單位 廣東省疾病預(yù)防控制中心為主要承擔(dān)單位。任務(wù)來源于國家食品藥品監(jiān)督 管理局保健食品化妝品監(jiān)管司的委托， 對(duì)保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 （2003 年版）中“提高缺氧耐受力功能評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”進(jìn)行修訂。 二、主要工作過程 國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司于 2009年 4 月召開了“保 健食品功能評(píng)方法及有關(guān)程序修訂”課題協(xié)作組工作會(huì)議，參會(huì)的有中國疾病 預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、廣東省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾病預(yù)防 與控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院、中國中 醫(yī)研究院東直門醫(yī)院和國家食品藥品監(jiān)督管理局保健

21、食品審評(píng)中心的專家近 15 人，會(huì)上對(duì)“保健食品功能評(píng)價(jià)方法及有關(guān)程序修訂”修訂的原則和框架作了 充分的討論，又分別征求了相關(guān)專家對(duì)修訂內(nèi)容的意見。為了做好本次檢驗(yàn)方 法的修訂工作，廣東省疾病預(yù)防控制中心成立了“提高缺氧耐受力功能評(píng)價(jià)和 檢驗(yàn)方法”修訂的起草工作小組，經(jīng)查閱國內(nèi)外相關(guān)資料，參考國家食品藥品 監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司召開的工作會(huì)議的精神，咨詢有關(guān)專家和實(shí) 驗(yàn)室同行的意見和建議，形成了本次任務(wù)的工作方案，總體上要提高檢驗(yàn)方法 的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和客觀性，提高保健食品功能的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)；修訂的方法要與 當(dāng)前國內(nèi)外研究的理論基礎(chǔ)相一致。本次修訂在去除“急性腦缺血性缺氧模型” 的基礎(chǔ)上，

22、新增“常壓缺氧”模型，并改良“亞硝酸鈉中毒存活模型” ，以反映 保健食品對(duì)缺氧耐受力功能的輔助保護(hù)作用。經(jīng)過起草工作小組開展的大量條 件探索和實(shí)驗(yàn)方法研究，對(duì)各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較和取舍，形成了修訂初稿 后，起草工作小組召開了多次專家研討會(huì)，征求專家意見，對(duì)初稿進(jìn)行了反復(fù) 修改，形成征求意見稿。方法驗(yàn)證工作由廣東省疾病預(yù)防控制中心、湖南省疾 病預(yù)防控制中心、湖北省疾病預(yù)防控制中心、福建省疾病預(yù)防控制中心分別進(jìn) 行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，征集、整理和歸納了相關(guān)意見 國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司于2010年8月再次召開了 “保健食品功能評(píng)價(jià)方法及有關(guān)程序修訂”課題協(xié)作組工作會(huì)議，參會(huì)的

23、有中 國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、廣東省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾 病預(yù)防與控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院、 中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院的專家近 10人，會(huì)上針對(duì)驗(yàn)證過程中存在的技術(shù)問題 及可操作性作了充分討論并提出修改意見，起草工作小組根據(jù)會(huì)議精神對(duì)修訂 方案做了進(jìn)一步完善，綜合了方法驗(yàn)證單位的意見后形成了征求意見稿。 2011年7月22日國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司在北京宣 武門商務(wù)酒店召開了“保健食品功能評(píng)價(jià)方法及有關(guān)程序修訂”定稿專家研討 會(huì)，參會(huì)的有中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、北京大學(xué)、廣東省疾 病預(yù)防控制中心、北京市疾病預(yù)防控

24、制中心、上海市疾病預(yù)防控制中心、中國 中藥研究院、中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院、北京醫(yī)院、國家食品藥品監(jiān)督管理局 保健食品審評(píng)中心的專家14人，會(huì)上對(duì)修訂后的“提高缺氧耐受力功能評(píng)價(jià)和 檢驗(yàn)方法”的科學(xué)性、客觀性和可操作性給予肯定，并提出修改意見，對(duì)征求 意見稿做了進(jìn)一步完善。 三、編制原則 1、總原則，提高保健食品“提高缺氧耐受力功能檢驗(yàn)方法”的科學(xué)性、準(zhǔn) 確性和規(guī)范性，適應(yīng)當(dāng)前法規(guī)對(duì)加強(qiáng)保健食品監(jiān)管的要求。 2、要符合當(dāng)前缺氧損傷的基礎(chǔ)理論，既考慮原規(guī)范合理的方法，又要提高 保健食品功能檢驗(yàn)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，選擇保留、改良或新增加的指標(biāo)要在國內(nèi)外已 經(jīng)廣泛應(yīng)用并得到普遍的認(rèn)可，可以反映保健食品的對(duì)缺氧

25、損傷的輔助保護(hù)作 用。 3、在撰寫過程中，注意科學(xué)性、合理性、和適用性。 四、確定相關(guān)技術(shù)內(nèi)容及新舊方法的對(duì)比 編 原方法 現(xiàn)方法 修 號(hào) 序 號(hào) 內(nèi)容 序 號(hào) 內(nèi)容 訂理 由 1 2 亞硝酸 鈉中毒 存活實(shí) 驗(yàn) 常壓缺氧模： 型實(shí)驗(yàn) 增加 常壓 缺氧 模型 2 原理 在總大氣壓 不變的情況 下，降低空 氣中氧的百 分含量，組 織細(xì)胞不能 從血液中獲 得充足的氧 而進(jìn)行正常 常壓 缺氧 模型 的機(jī) 理 的氧化代 謝，影響動(dòng) 物的各項(xiàng)生 理功能。 3 材料 2.2.1 常壓缺氧 儀、血球計(jì) 數(shù)儀、酶標(biāo) 儀 4 實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物 2.2.2 增加“建議 使用雄性” 雄性 實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物 對(duì)缺 氧更 敏感 些 5 劑量分 組 2.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè) 劑量組、 個(gè)模型對(duì)照 組和一個(gè)溶 劑對(duì)照組， 以人體推薦 量的10倍為 其中的一個(gè) 劑量組，另 設(shè)兩個(gè)劑量 組，受試樣 品給予時(shí)間 為30天。 6 實(shí)驗(yàn)步 驟 2.2.4 各劑量組經(jīng) 口連續(xù)給予 不同濃度受 試樣品，對(duì) 照組按同等 容量灌胃給 予溶劑，每 次給予樣品 后，將各劑 量組與模型 對(duì)照組實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物依次放 入常壓缺氧 儀中，同時(shí) 充入氮?dú)馀c 空氣，調(diào)節(jié) 氧百分含量 達(dá)到%,每 日6h，每周 6次。末次缺 氧后，采血 檢測(cè)紅細(xì)胞 數(shù)及血紅蛋 白含量，取 腦進(jìn)行MDA 與TOAC的 檢測(cè)。 7 統(tǒng)計(jì)方 法