原核生物基因表達與操作

1、原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 重組基因表達的目的重組基因表達的目的 1. 1. 蛋白質(zhì)功能研究蛋白質(zhì)功能研究 2. 2. 生物制藥和疫苗生產(chǎn)生物制藥和疫苗生產(chǎn) 3.3. 疾病的基因治療疾病的基因治療 4.4. 食品、化工用酶制劑食品、化工用酶制劑 5.5. 抗蟲、抗逆植物改良抗蟲、抗逆植物改良 6. 6. 細胞代謝產(chǎn)物的富集細胞代謝產(chǎn)物的富集 1. 原核體系 2. 真核體系 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作

2、原核生物基因表達與操作 4. 4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過 轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝）， 而大多數(shù)的這類修飾作用在細菌細胞中而大多數(shù)的這類修飾作用在細菌細胞中 并不存在；并不存在； 5. 5. 細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基 因所表達的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。因所表達的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物

3、基因表達與操作 報告基因（報告基因（reporter genereporter gene）：特指那些編）：特指那些編 碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單 元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢 光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。 追蹤某種特定的追蹤某種特定的DNADNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否 已經(jīng)導(dǎo)入寄主細胞、抑或是器官和組織；也已經(jīng)導(dǎo)入寄主細胞、抑或是器官和組織；也 可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其可用來同任何

4、一種目的啟動子連接，因此其 表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 大腸桿菌的大腸桿菌的LacLac啟動子啟動子 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 大腸桿菌的大腸桿菌的trptrp啟動子啟動子 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 TacTac啟動子啟動子 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 1.非融合型表達載體非融合型表達載體pKK223-3 載體載體 1）強啟動子）強啟動子: tac（trp

5、-lac） 2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng) trp的的-35區(qū)區(qū) lacUV5的的-10區(qū)區(qū) laclac操縱基因操縱基因 常用大腸桿菌表達載體常用大腸桿菌表達載體 3）表達誘導(dǎo)物：）表達誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）（乳糖的類似物，不會被降解） 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 條件：條件： 必須選擇一個有必須選擇一個有 lacI的宿主菌。的宿主菌。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 2. 分泌型表達載體分泌型表達載體 載體表達出的外源蛋白

6、質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一 起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 1）強啟動子：）強啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。啟動子。 2）調(diào)節(jié)基因：）調(diào)節(jié)基因：lac I 。 3）S-D序列和起始密碼序列和起始密碼ATG。 4）分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因）分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位點區(qū)（多克隆位點）。）插入位點區(qū)（多克隆位點）。 原核生物基因表達與操作原核生物基

7、因表達與操作 3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)融合蛋白表達載體系統(tǒng) 表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋 白連接在一起的。白連接在一起的。 如：如：pGEX、pET系列系列 優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化。優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化。 組成結(jié)構(gòu)：組成結(jié)構(gòu)： 1）啟動子：）啟動子：tac 2）操縱基因：）操縱基因：lacP 3）調(diào)節(jié)基因：）調(diào)節(jié)基因：lacI 4）S-D序列序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：）融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶） 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 融合蛋白表達系統(tǒng)

8、的構(gòu)建的三個原則：融合蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建的三個原則： 首先，受體細菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達，且其首先，受體細菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達，且其 表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。 其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游 區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個 結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接 決定了融合蛋白的裂解方法。決定了融合蛋白的裂解方法。 最后，當兩個蛋白編碼序列融合在一起時，外最后，當兩個蛋白編

9、碼序列融合在一起時，外 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 用融合載體組合表達融合蛋白質(zhì)：用融合載體組合表達融合蛋白質(zhì)： 以以Ecoli. lacZ為靶基因的組合最典型，含三個不同為靶基因的組合最典型，含三個不同 載體，每個載體都有一個載體，每個載體都有一個lacZ啟動子和啟動子和SD序列，且在序列，且在 lacZ基因下游部位具有一基因下游部位具有一EcoR識別序列識別序列 (GAATTC) 5上游存在著不同數(shù)量的上游存在著不同數(shù)量的G-C堿基對。三種情況必有一堿基對。三種情況必有一 個保持著正確的讀碼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生

10、出真實的融合蛋白質(zhì)。個保持著正確的讀碼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生出真實的融合蛋白質(zhì)。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 第二節(jié)第二節(jié)外源基因在原核細胞中的表達外源基因在原核細胞中的表達 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從因子可以把外源蛋白從GST上切下來上切下來 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 pGEX-2XpGEX-2X的插入?yún)^(qū)的插入?yún)^(qū) pGEX-1XpGEX-1X的插入?yún)^(qū)的插入?yún)^(qū) pGEX-3XpGEX-3X的插入?yún)^(qū)的插入?yún)^(qū) 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 4.其他

11、融合蛋白系統(tǒng)其他融合蛋白系統(tǒng) His-tag（組氨酸標簽）（組氨酸標簽） 在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6個組氨酸（個組氨酸（His）。）。 His-tag能與能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被柱結(jié)合，但很容易被EDTA （或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他 DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這 樣的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或具有其他功能的 多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與

12、操作 外源基因在原核細胞中的表達外源基因在原核細胞中的表達 位于位于 細胞質(zhì)細胞質(zhì) 細胞周質(zhì)細胞周質(zhì) 細胞外細胞外 表達產(chǎn)物表達產(chǎn)物 形式形式 包涵體蛋白包涵體蛋白 融合蛋白融合蛋白 整合型外源蛋白整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是：目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是： 表達質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單；表達質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單； 能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細 胞總蛋白的胞總蛋白的20%20%40%40%。 目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種：目標

13、蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種： 在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中 在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借 助于身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最助于身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最 終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 包涵體蛋白包涵體蛋白 本質(zhì)：細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集本質(zhì)：細胞內(nèi)蛋

14、白質(zhì)的不斷聚集 包括：包括：1. 1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 2.2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 3.3.蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點：易于分離純化優(yōu)點：易于分離純化 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集 簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，包涵體的

15、水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分， 菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從 細菌裂解物中分離出來細菌裂解物中分離出來 能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標蛋白能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標蛋白 包涵體表達形式的優(yōu)點包涵體表達形式的優(yōu)點 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有

16、正確空間構(gòu)象（因而具有生 物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標產(chǎn)物的收物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標產(chǎn)物的收 率至關(guān)重要。率至關(guān)重要。 經(jīng)過復(fù)性處理的目標蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，經(jīng)過復(fù)性處理的目標蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性， 有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當目標蛋白分子中的有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當目標蛋白分子中的Cys 殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)停话悴怀^殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)?，一般不超過 30% 復(fù)性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。復(fù)性處理工藝可使目標蛋白的制備

17、成本上升。 包涵體表達形式的缺點包涵體表達形式的缺點 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 分離純化細菌包涵體蛋白質(zhì)的分離純化細菌包涵體蛋白質(zhì)的： 破碎細胞破碎細胞 ( (Disruption of cell) ) 分離包涵體分離包涵體 (Seperation of inclusion body) 溶解包涵體溶解包涵體 (Dissolve inclusion body) 蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原等。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原等。 (Recovery of target protein conformation) 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 包涵體的復(fù)性前準備 洗滌：洗滌：由于脂

18、體及部分破碎的細胞膜及膜蛋 白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前 要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如 2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、 1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑 TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 包涵體的溶解 1.采用高濃度的變性劑變性劑，使其形成伸展 的肽鏈。常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍 （GuaHCl 6-8M），通過離子間的相互作用， 破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。尿素的 增溶效果稍差，異氰硫酸胍（GuaSCN）最強。 變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏堿性的 環(huán)境中如p

19、H8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。有些 蛋白只能用鹽酸胍。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍 在37度1小時便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 2.去垢劑去垢劑：如強的陰離子去垢劑SDS，可 以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，避免蛋白形成疏水 核心，可以增溶幾乎所有的蛋白。但由于 （研究）。 3.極端極端pH：可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶 蛋白。如在pH9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋 白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。 這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 4.還原劑：還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在，在增

20、 溶時一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般 是50-100mM DTT，也有使用5mM濃度。實際， 還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)， 而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響。 對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶， 有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二 硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。 含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原 劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯 合劑合劑EDTA去除金屬離子。去除金屬離子。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 (伸展態(tài))U(中間態(tài))I(自然態(tài))N A（包涵體） 從中間體

21、轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢。 當溶液中離子強度或變性劑濃度很低，又無其它 輔助手段存在時，聚集趨勢占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋 白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。 蛋白質(zhì)折疊的三態(tài)模型 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 復(fù)性目的 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 復(fù)性：通過緩慢去除變性劑（避免折疊 中間體重新聚集）使目標蛋白從變性的完全伸 展狀態(tài)（？）恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去 除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度 4M左右時復(fù)性過程開始，到2M左右時結(jié)束。 對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時 復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 蛋白質(zhì)的復(fù)性

22、是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和 最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的 環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一 個蛋白質(zhì)都有一個最佳的復(fù)性條件，只有選個蛋白質(zhì)都有一個最佳的復(fù)性條件，只有選 擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確 折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完 成。成。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 包含體蛋白復(fù)性方法包含體蛋白復(fù)性方法 幾個要求：幾個要求： 活性蛋白的回收率高活性蛋白的回收

23、率高 正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤的折疊蛋白質(zhì)正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤的折疊蛋白質(zhì) 分離。分離。 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品 復(fù)性過程耗時少復(fù)性過程耗時少 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 復(fù)性常用方法性常用方法 1.1.稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺 點是體積增加較大，后續(xù)處理困難。點是體積增加較大，后續(xù)處理困難。 稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體 （較低的復(fù)性收率）。有時需低于（較低的復(fù)性收率）。有時需低于0.01mg/mL0.01mg/mL。 脈沖流

24、加復(fù)性：分批次加入到緩沖液中，使脈沖流加復(fù)性：分批次加入到緩沖液中，使 折疊中間體保持在較低的水平。例：在折疊中間體保持在較低的水平。例：在5-5- 10mg/mL10mg/mL終濃度下，溶菌酶復(fù)性收率終濃度下，溶菌酶復(fù)性收率可達可達80%80% 以上以上。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 2.2.透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降 低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢， 不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。 3. 3. 超濾復(fù)性：選擇合適載留分子量的膜

25、，允超濾復(fù)性：選擇合適載留分子量的膜，允 許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過。在生產(chǎn)中較多許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過。在生產(chǎn)中較多 的使用，規(guī)模較大，缺點是不適合樣品量較少的的使用，規(guī)模較大，缺點是不適合樣品量較少的 情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變 性（蛋白聚集于膜上）。性（蛋白聚集于膜上）。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 4.4.色譜復(fù)性：輔助手段，兼具分離。色譜復(fù)性：輔助手段，兼具分離。 4.1 4.1 凝膠過濾復(fù)性：除了蛋白質(zhì)在膠粒凝膠過濾復(fù)性：除了蛋白質(zhì)在膠粒 中傳質(zhì)和擴散外，蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間并沒有發(fā)中傳質(zhì)和擴散外，蛋白

26、質(zhì)與介質(zhì)之間并沒有發(fā) 生其他作用。該法可以起到一定的抑制凝集作生其他作用。該法可以起到一定的抑制凝集作 用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對 較慢，對有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。較慢，對有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 4.2 4.2 吸附型層析復(fù)性：離子交換、疏水層吸附型層析復(fù)性：離子交換、疏水層 析、親和層析和擴張床層析均屬于吸附層析。其析、親和層析和擴張床層析均屬于吸附層析。其 基本復(fù)性原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣基本復(fù)性原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣 并吸附

27、在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未并吸附在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未 吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸 附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復(fù)性。附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復(fù)性。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 IBin E. coli IB(solid)IB(solid) Solubilized IBSolubilized IB (unfolded)(unfolded) AggregateAggregate Refolded Refolded Bioactive B

28、ioactive monomer monomer RefoldingRefolding Solution-stateSolution-state Solid-state Solid-state refoldingrefolding 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 5. 5.分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異 構(gòu)酶、肽酰一輔氨酰順反異構(gòu)酶等。分子伴侶和構(gòu)酶、肽酰一輔氨酰順反異構(gòu)酶等。分子伴侶和 折疊酶等不僅可在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚折疊酶等不僅可在細

29、胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚 集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質(zhì)的折疊集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質(zhì)的折疊 復(fù)性。復(fù)性。 體內(nèi)復(fù)性主要是在工程菌培養(yǎng)過程中同時加體內(nèi)復(fù)性主要是在工程菌培養(yǎng)過程中同時加 入分子伴侶的基因進行共表達；體外復(fù)性主要是入分子伴侶的基因進行共表達；體外復(fù)性主要是 將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫 助折疊。助折疊。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 復(fù)性過程中的添加劑復(fù)性過程中的添加劑 低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折 疊，但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性或疊，但

30、可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性或 增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù) 性產(chǎn)率。可防止不可逆聚集體的出現(xiàn)。性產(chǎn)率?？煞乐共豢赡婢奂w的出現(xiàn)。 鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類等鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類等， 在非變性濃度下是有效的促進劑。在非變性濃度下是有效的促進劑。 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 S S S S S S S S S S S S S SS S S S S S S SS S S S S S S S S S S S S S S S S S 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 IB Dissolve

31、d Refolding 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作6161 包涵體分離純化過程 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 收獲細胞收獲細胞 細胞破碎細胞破碎 離心離心 5 - 10 000g 沉淀物沉淀物 沖洗和離心沖洗和離心 分離包涵體分離包涵體 親和純化和復(fù)性親和純化和復(fù)性 溶解溶解 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作6262 包涵體-細胞破碎,沖洗和分離 每每100ml培養(yǎng)液重新懸浮細胞沉培養(yǎng)液重新懸浮細胞沉 淀物於淀物於4ml20mMTris-HCl pH8.0 在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細 胞，并在胞，并在+4C下高速離心下高速離心10分鐘分鐘 重

32、新懸浮細胞沉淀物於重新懸浮細胞沉淀物於2ml含含e.g. urea的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩 并在并在+4C下高速離心下高速離心10分鐘分鐘 用沖洗緩沖液沖洗細胞沉淀物用沖洗緩沖液沖洗細胞沉淀物 2 M UREA 20 mM Tris HCl 2% Triton X100 0.5 M NaCl 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作6363 溶解和準備樣品 重新懸浮細胞沉淀物於重新懸浮細胞沉淀物於5ml溶溶 解緩沖液解緩沖液(e.g.): 20mMTris-HCl,0.5MNaCl, 5mM咪唑,6M鹽酸胍, 1mM2-巰基乙醇巰基乙醇pH8 在室溫等在室溫等

33、30-60 分鐘分鐘 在在+4C 離心離心 15 分鐘分鐘 用用 0.22 m 或或 0.45 m 濾膜過濾膜過 濾濾 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 載體和標記純化 pGEX 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GSTMicroSpinPurification Module, GSTrap,GlutathioneSepharose FastFlow PQE 6x組氨酸HisMicroSpinPurificationModule pETHisTrap,HiTrapChelating, 6x組氨酸ChelatingSepharoseFastFlow pEZZ18(非誘導(dǎo)性表達) 蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)

34、IgGSepharose6FastFlow pRIT2T(利用溫度改變誘導(dǎo)) 蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)IgGSepharose6FastFlow 親和層析純化親和層析純化 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作6565 GST融合蛋白的純化 GST重組蛋白重組蛋白 酶切位點酶切位點 FactorXa:Mr17-20000/ 28-30000 Thrombin:Mr37000 PreScissionProtease:Mr46000 GlutathioneSepharose Mr26000 10C 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作6666 SDS PAGE analysis 0 20

35、 40 60 80 100 % Elution buffer 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 5.010.015.020.0 ml min Wash Elution buffer 2.7mg pureGST fusion protein 5.010.015.020.0 A280 kD 94 14.4 20.1 30 43 67 123 柱柱:GSTrap1ml 樣品樣品:8ml大腸桿菌表達含GST融合蛋白胞漿萃取 液 結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液:PBS,pH7.3 洗脫緩沖液洗脫緩沖液50mMTris-HCl,pH8.010mM還原谷 胱甘肽 流速流速:1ml/min 層

36、析層析 步驟步驟:4CV結(jié)合緩沖液,8ml樣品,10CV結(jié)合緩沖液, 5CV洗脫緩沖液,5CV結(jié)合緩沖液(CV=柱體 積) 系統(tǒng)系統(tǒng):KTAexplorer10 1:低分子量標記(LMW)Calibrationkit, 還原,AmershamPharmaciaBiotech 2:胞漿萃取液,1g/10ml 3:洗脫GST融合蛋白 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作6767 (His)6融合蛋白的純化和檢測 重組蛋白重組蛋白 His HisHis Ni2+ HisHis HisHis Ni2+ Ni2+ Ni2+ 原核生物基因表達與操作原核生物基因表達與操作 原核生物基因表達與操作原核

37、生物基因表達與操作6969SDS PAGE Flowthrough 加樣結(jié)合液洗脫液結(jié)合液 A A 280 280 A A 405 405 1.0 0.5 0.0 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.05.010.015.020.0Volume(ml) Eluted pool Wash kDa 94.0 67.0 43.0 20.1 14,4 12345678 樣品樣品:5 ml大腸桿菌表達含(His)-標記谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶， GST-(His)6 柱柱:HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+ 結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液: 1X 磷酸緩沖液, 20 mM 咪唑 pH 7.4 洗脫緩沖液洗脫緩沖液: 1X