色譜法分離原理

1、色譜法分離原理教學(xué)內(nèi)容1.色譜分離的基本原理和基本概念2.色譜分離的理論基礎(chǔ)3.色譜定性和定量分析的方法重點(diǎn)與難點(diǎn)1.塔板理論，包括流出曲線方程、理論塔板數(shù)(n)及有效理論塔板 數(shù) ( neff) 和 塔 板 高 度 ( H) 及 有 效 塔 板 高 度 ( Heff) 的 計(jì) 算2.速率理論方程3.分離度和基本分離方程教學(xué)要求1.熟練掌握色譜分離方法的原理2.3.掌握色譜流出曲線（色譜峰）所代表的各種技術(shù)參數(shù)的準(zhǔn)確含能夠利用塔板理論和速率理論方程判斷影響色譜分離各種實(shí)驗(yàn)因素4.學(xué)會(huì)各種定性和定量的分析方法四.學(xué)時(shí)安排 4學(xué)時(shí)第一節(jié) 概述色譜法早在1 903年由俄國植物學(xué)家茨維特分離植物色素時(shí)

2、采用。他在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳 酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各 組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜 法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”二字雖已失去原 來的含義.但仍被人們沿用至今。在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體 或液體）稱為固定相；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體） 稱為流動(dòng)相；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜 柱_。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作 用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、 強(qiáng)弱也有差異，因此在同一

3、推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留 時(shí)間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。從不同角度，可將色譜法分類如下：1. 按 兩 相 狀 態(tài) 分 類氣 體 為 流 動(dòng) 相 的 色 譜 稱 為 氣 相 色 譜 （ GC）根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。液 體為 流動(dòng) 相 的色 譜 稱 液相 色 譜 （ LC）同 理液 相色 譜 亦 可分 為 液 固 色 譜 （ LSC） 和 液 液 色 譜 （LLC） 。超 臨界 流體 為 流動(dòng) 相的 色譜 為 超 臨界 流 體 色 譜 （ SFC） 。 隨著 色 譜工

4、 作的 發(fā)展 ，通 過化 學(xué)反 應(yīng) 將 固 定液 鍵 合 到載 體 表 面，這 種 化 學(xué) 鍵合 固 定 相的 色 譜又 稱化 學(xué)鍵 合相 色譜 （ CBPC） .2. 按 分 離 機(jī) 理 分 類利 用組 分 在吸 附劑（ 固 定 相）上 的 吸附 能力 強(qiáng)弱 不同 而得 以 分 離 的 方法 ， 稱 為 吸附 色 譜 法。利 用組 分 在固 定液（ 固 定 相）中 溶 解度 不同 而達(dá) 到分 離的 方 法稱 為分配色譜法。利 用組 分 在離 子交 換劑（ 固 定 相）上 的 親和 力大 小不 同而 達(dá) 到分 離 的方 法， 稱 為 離 子交 換色 譜 法 。利用大小不同的分子在多孔固定相中的

5、選擇滲透而達(dá)到分離的 方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最 近 ，又 有 一 種 新 分 離 技 術(shù) ，利 用 不 同 組 分 與 固 定 相（ 固 定 化 分 子 ）的 高 專 屬 性 親 和 力 進(jìn) 行 分 離 的 技 術(shù) 稱 為 親 和 色 譜 法 ，常 用 于 蛋 白 質(zhì)的分離。3. 按 固 定 相 的 外 型 分 類固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。固 定 相 呈 平 板 狀 的 色 譜 ，稱 為 平 板 色 譜 ，它 又 可 分 為 薄 層 色 譜 和 紙色譜。4. 按 照 展 開 程 序 分 類按照展開程序的不同，可將色譜法分為洗脫法、頂替法、和迎頭法。洗脫法也稱沖洗法。工

6、作時(shí)，首先將樣品加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。這 種 方 法 能 使 樣 品 的 各 組 分 獲 得 良 好 的 分 離 ，色 譜 峰 清 晰 。此 外 ， 除 去 沖 洗 劑 后 ，可 獲 得 純 度 較 高 的 物 質(zhì) 。目 前 ，這 種 方 法 是 色 譜 法 中 最常用的一種方法。頂 替 法 是 將 樣 品 加 到 色 譜 柱 頭 后 ，在 惰 性 流 動(dòng) 相 中 加 入 對 固 定 相 的 吸 附 或 溶 解 能 力 比 所 有 試 樣 組 分 強(qiáng)

7、的 物 質(zhì) 為 頂 替 劑（ 或 直 接 用 頂 替 劑 作 流 動(dòng) 相 ），通 過 色 譜 柱 ，將 各 組 分 按 吸 附 或 溶 解 能 力 的 強(qiáng) 弱 順 序 ， 依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出， 最強(qiáng)的最后流出。此法適于制備純物質(zhì)或濃縮分離某一組分；其缺點(diǎn)是經(jīng)一次使用 后 ，柱 子 就 被 樣 品 或 頂 替 劑 飽 和 ，必 須 更 換 柱 子 或 除 去 被 柱 子 吸 附 的物質(zhì)后，才能再使用。迎 頭 法 是 將 試 樣 混 合 物 連 續(xù) 通 過 色 譜 柱 ，吸 附 或 溶 解 能 力 最 弱 的 組 分 首 先 一 純 物 質(zhì) 的 狀 態(tài) 流

8、出 ，其 次 則 以 第 一 組 分 和 吸 附 或 溶 解 能 力 較 弱 的 第 二 組 分 混 合 物 ，以 此 類 推 。該 法 在 分 離 多 組 分 混 合 物 時(shí) ，除組 分 外 ，其 余 均 非 純 態(tài) ，因 此 僅 適 用 于 從 含 有 微 量 雜 質(zhì) 的 混 合 物 中 切 割 出 一 個(gè) 高 純 組 分 （ 組 分 A） ， 而 不 適 用 于 對 混 合 物 進(jìn) 行 分 離 。第二 節(jié) 色 譜流 出曲 線及 有關(guān) 術(shù)語一）色譜流出曲線和色譜峰由檢 測 器輸 出的 電信 號(hào)強(qiáng) 度對 時(shí)間 作圖 ，所 得曲 線稱 為 色 譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進(jìn)樣量很

9、小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。二）基線在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時(shí)的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（h）表示?；€1.不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積，因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相流動(dòng)速度相近。測定流動(dòng)相平均線速U時(shí)，可用柱長L與to的比值 計(jì)算，即U = L/t 02. 保留時(shí)間t r試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過的時(shí)間，稱為保留時(shí)3. 調(diào)整保留時(shí)

10、間t r 某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保留時(shí)間，由于組分在色譜柱中的保留時(shí)間tr包含了組分隨流動(dòng)相通過柱 子所須的時(shí)間和組分在固定相中滯留所須的時(shí)間，所以t r實(shí)際上是組分在固定相中保留的總時(shí)間。保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時(shí)間常受 到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積來表示保留4. 死體積V指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與色譜柱出口的載氣流速Fco(cm min-1)計(jì)算。Vo= t 0 Fc o式中Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫

11、度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。5. 保留體積Vr指從進(jìn)樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積。保留時(shí)間與保留體積關(guān)系：Vr = t r Fco6. 調(diào)整保留體積Vr -某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。Vr = Vr - Vo7. 相對保留值2,1某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。r2,1= tr2 / t r1 = 5 2、/ VlM由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣 泛用作定性的依據(jù)。在 定性 分析中，通 常固

12、定個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i ）對這個(gè)峰的相對保留 值，此時(shí)可用符號(hào)a表示，即a = t r -( i )/ t r ( s)式中t r（i ）為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以a總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。（五）區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ卸N方法。1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差b即0. 607倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬WZ/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為W/2=2. 354cr3. 峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上截距間的

13、距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差O的關(guān)系是 W = 4 c從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i )根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；(i i )根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；(i i i )根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(i V)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依(V)色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(或流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。第三節(jié)色譜法基本原理(一)分配系數(shù)K和分配比k1. 分配系數(shù)

14、K分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次的分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次的吸附-脫附過程 。這 種 分 離 過 程 經(jīng) 常 用 樣 品 分 子 在 兩 相 間 的 分 配 來 描 述 ，而 描 述 這 種 分 配 的 參 數(shù) 稱 為 分 配 系 數(shù) K 。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即K=溶質(zhì)在固定相中的濃度 / 溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度Cs / Cm分配 系數(shù)是由組分和固定相的熱力學(xué)性質(zhì) 決定的，它是每溶質(zhì)的特征值，它僅與兩個(gè)變量有關(guān)：固定相和溫度。與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關(guān)。2.分配 比 k分配 比又稱

15、容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組 分在兩間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即k = 組分在固定相中 的質(zhì)量 / 組分在流動(dòng)相中 的質(zhì)量ms / mmk值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能 力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱 溫、柱壓變化而變化， 而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。k = ms / mm = Cs VS / CmVm式中Cs, Cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度；Vm為柱中流動(dòng)相的體積， 近似等于死體積。 Vs 為柱中固 定相的體積， 在各種不同 的類型的

16、色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。P.分配比k值可直接從色譜圖中測得（推導(dǎo)過程教材296 297）。(t rt 0 ) / t 0 = t / t 0 = V / V 04.分配系數(shù)K與分配比 k的關(guān)系其中卩稱為相比率，它是反映各種色譜柱柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參。例如，對填充柱，其卩值一般為635;對毛細(xì)管柱，其卩值為60600。4. 分配系數(shù) K及分配比k與選擇因子a的關(guān)系對A、B兩組分的選擇用下式表示:(A)=k ( A)/ k ( B) =K ( A)/ K(B)通過選擇因子a把實(shí)驗(yàn)測量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來

17、，a對固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的K或k 值相等，則a =1 ,兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分 的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系 數(shù)是色譜分離的先決條件。圖 中 KAKB ，因 此，A組分在移動(dòng)過程中滯后。隨著兩組分在色譜 柱中 移 動(dòng) 距 離的 增加 ，兩 峰 間 的 距 離逐 漸變 大，同 時(shí) ，每 一 組 分 的濃度輪廓（即區(qū)域?qū)挾龋┮猜?慢變 寬。 顯然 ，區(qū) 域擴(kuò) 寬對 分離 是 不利的，但又是不可避免的。若 要 使 A 、 B 組 分 完 全 分 離 ， 必 須 滿 足 以 下三點(diǎn)：八、，兩組分的分配系數(shù)必須有差異； ，區(qū)域擴(kuò)寬的

18、速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度； ，在 保 證 快 速 分 離 的 前 提 下 ，提 供 足 夠 長 的 色 譜 柱 。第 一、 二點(diǎn) 是完 全分 離的 必要 條件 。 作為 一個(gè) 色譜 理論 ， 它 不僅 應(yīng)說 明組 分 在色 譜柱 中 移 動(dòng) 的 速率 ，而且 應(yīng)說 明組 分 在 移動(dòng) 過 程中 引 起區(qū) 域擴(kuò) 寬 的各 種因 素。塔 板理 論 和 速率 理論 均以 色 譜 過程 中 分 配 系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。二）塔板理論把色 譜 柱比 作一 個(gè) 精 餾塔 ，沿用 精餾 塔中 塔板 的 概 念來 描 述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指 標(biāo) ，即 色

19、譜 柱是 由一 系列 連續(xù) 的 、相 等 的 水 平 塔板 組成 。每 一 塊 塔板 的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。塔板理論假設(shè)：1. 在 柱 內(nèi) 一 小 段 長 度 H 內(nèi) ， 組 分 可 以 在 兩 相 間 迅 速 達(dá) 到 平 衡 。 這小 段 柱長 稱為 理 論 塔板 高 度 H。2. 以 氣 相 色 譜 為 例 ，載 氣 進(jìn) 入 色 譜 柱 不 是 連 續(xù) 進(jìn) 行 的 ，而 是 脈 動(dòng) 式 ，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（A Vm）。3.4.所有 組分開始時(shí)存在于第 0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（ 縱）向擴(kuò) 散可忽略。分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)， 與組分在某一塔板上的量無關(guān)。簡單地認(rèn)為

20、：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：n稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。塔板理論指出：第一， 當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)， 即理論塔板數(shù) n 大于 50時(shí)，可得到基本對稱的峰形曲線。在色譜柱中，n值一般很大，如氣相色譜柱的 n 約為 103 106， 因而這時(shí)的流出曲線可趨近于正態(tài)分 布曲線。第二， 當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后， 只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。第三n 與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：5

21、. 54( t r /W1/2)216 (t r / W)2式中 t r 與W1/ 2 ( W )應(yīng)采用同一單位（時(shí)間或距離）。 從公式可以看出， 在 tr 一定時(shí)，如果色譜峰很窄，則說明n越大，H越小，柱效能越高。16 ( t r / W) 2計(jì)算出來的的n和H值有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)椴捎胻 R計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間t M，所以常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：n有效=5. 54( t J / W/2)216( t / W) 2有效板高H有效=L / n有效因?yàn)樵谙嗤纳V條件下，對不同的物質(zhì)計(jì)算的塔板數(shù)不一樣，因此，在說明柱效時(shí)，除注明色譜條件外，還應(yīng)指出用什么物質(zhì)進(jìn)行已知

22、某組分峰的峰底寬為40 s，保留時(shí)間為400 S ，計(jì)算此色譜柱的理論塔板數(shù)。解： n = 16 ( t R / W)216(400 / 40)21600 塊塔板理論是一種半經(jīng)驗(yàn)性理論。它用熱力學(xué)的觀點(diǎn)定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計(jì)算 和評(píng)價(jià)柱效高低的參數(shù)。但是，色譜過程不僅受熱力學(xué)因素的影響， 而且還與分子的擴(kuò)散、傳質(zhì)等動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)，因此塔板理論只能定 性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明 為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它 的應(yīng)用。（三）速率理論1 956年荷蘭學(xué)者van Deemt er （范第姆特

23、）等在研究氣液色譜時(shí) ，提 出 了 色 譜 過 程 動(dòng) 力 學(xué) 理 論 速 率 理 論 。他 們 吸 收 了 塔 板 理 論 中 板 高 的 概 念 ，并 充 分 考 慮 了 組 分 在 兩 相 間 的 擴(kuò) 散 和 傳 質(zhì) 過 程 ，從 而 在 動(dòng) 力 學(xué) 基 礎(chǔ) 上 較 好 地 解 釋 了 影 響 板 高 的 各 種 因 素 。該 理 論 模 型 對 氣 相、 液相色譜都適用。 van Deemter 方程的數(shù)學(xué)簡化式為H = A + B / U + C U式中U為流動(dòng)相的線速度；A、B、C、為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散系數(shù)、 分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、 傳質(zhì)阻力 項(xiàng)系數(shù)。第三節(jié)色譜法基本原理1. 渦流擴(kuò)

24、散 項(xiàng) A在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似渦流的流動(dòng)， 故稱渦流擴(kuò)散。由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一， 因而同時(shí)進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱口時(shí)間并不一致，引 起了色譜峰的變寬。色 譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：A = 2 入 dp上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子入有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對 于 空 心 毛 細(xì) 管 ， 不 存 在 渦 流 擴(kuò) 散 。

25、因 此 A = 0 。2. 分 子 擴(kuò) 散 項(xiàng) B / u ( 縱 向 擴(kuò) 散 項(xiàng) )縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組 分從柱入口加入，其 濃度 分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“ 塞子”必然自發(fā)的向前和向后擴(kuò)散， 造成譜帶展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為B = 2 YDgY是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。,分子擴(kuò)散項(xiàng)與組分Dg為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)(cm傳 質(zhì) 阻 力 項(xiàng)Cu由于氣相色譜以氣體為流動(dòng)相， 液相色譜以液體為流動(dòng)相， 它們的傳質(zhì)過程不完全相同。 s-1)在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)Dg成正比.

26、Dg 與 流 動(dòng) 相 及 組 分 性 質(zhì) 有 關(guān) ：(a)相對分子質(zhì)量大的組分Dg小，Dg反比于流動(dòng)相相對分子質(zhì)量的平方根，所以采用相對分子質(zhì)量較大的流動(dòng)相，可使B項(xiàng)降低；( b ) Dg 隨 柱 溫 增 高 而 增 加 ， 但 反 比 于 柱 壓 。另外縱向擴(kuò)散與組分在色譜柱內(nèi)停留時(shí)間有關(guān)，流動(dòng)相流速小，組分停留時(shí)間長，縱 向擴(kuò)散就大 。因 此為降低縱向擴(kuò)散影響，要 加大 流動(dòng)相速度。對 于液相色譜，組 分在流動(dòng)相中縱向擴(kuò)散可以忽略。傳 質(zhì) 阻 力 系 數(shù) C 包 括 氣 相 傳 質(zhì) 阻 力 系 數(shù) Cg 和 液 相 傳 質(zhì) 阻 力 系 數(shù)C1 兩 項(xiàng) ， 即C = Cg+ C1氣 相 傳

27、質(zhì) 過 程 是 指 試 樣 組 分 從 氣 相 移 動(dòng) 到 固 定 相 表 面 的 過 程 。這過 程 中 試 樣 組 分 將 在 兩 相 間 進(jìn) 行 質(zhì) 量 交 換 ，即 進(jìn) 行 濃 度 分 配 。有 的 分子還來不及進(jìn)入兩相界面， 就 被 氣 相 帶 走 ；有 的 則 進(jìn) 入 兩 相 界 面 又 來 不 及 返 回 氣 相 。這 樣 使 得 試 樣 在 兩 相 界 面 上 不 能 瞬 間 達(dá) 到 分 配 平 衡 ，引 起 滯 后 現(xiàn) 象 ，從 而 使 色 譜峰 變 寬 。 對 于 填 充 柱 ， 氣 相 傳 質(zhì) 阻 力 系 數(shù) Cg 為 ：Cg= 0. 01k2 / ( 1 + k) 2d

28、 p / Dg式 中 k 為 容 量 因 子 。 由 上 式 看 出 ， 氣 相 傳 質(zhì) 阻 力 與 填 充 物 粒 度d p 的 平 方 成 正 比 ， 與 組 分 在 載 氣 流 中 的 擴(kuò) 散 系 數(shù) Dg 成 反 比 。 因 此 ， 采 用 粒 度 小 的 填 充 物 和 相 對 分 子 質(zhì) 量 小 的 氣 體（ 如 氫 氣 ）做 載 氣 ，可 使 Cg 減 小 ， 提 高 柱 效 。液相傳質(zhì)過程是指試樣組分從固定相的氣/液界面移動(dòng)到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達(dá)到分配平衡，然后又返回氣/液界面的傳 質(zhì) 過 程 。這 個(gè) 過 程 也 需 要 一 定 的 時(shí) 間 ，此 時(shí) ，氣 相 中 組

29、 分 的 其 它 分 子 仍 隨 載 氣 不 斷 向 柱 口 運(yùn) 動(dòng) ，于 是 造 成 峰 形 擴(kuò) 張 。液 相 傳 質(zhì) 阻 力 系 數(shù) C1為：C1 = 2 / 3k / ( 1 + k) 2df 2 / Dl由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù)Di大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會(huì)使Ci增大。當(dāng)固定液含量一定時(shí)，液膜厚度 隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體 來降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分 離。雖然提高柱溫可增大Di，但會(huì)使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腃i 值，應(yīng)控制適宜的柱

30、溫。（2）液液分配色譜傳質(zhì)阻力系數(shù)（C）包含流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cm）和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs），即Cm + Cs其中Cm又包含流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力，即：2 2Cm = 00 md p/ Dm + smdp /Dm中右邊第一項(xiàng)為流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。當(dāng)流動(dòng)相流過色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒的流動(dòng)相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內(nèi)流動(dòng)相的流速是不均勻的。這種傳質(zhì)阻力對板高的影響與固定相粒度dp的平方成正比，與試樣質(zhì)決定分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比，3 m是由柱和填充的性的因子。 右邊第二項(xiàng)為滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。這是由 于固定相的多孔性，會(huì)造

31、成某部分流動(dòng)相滯留在一個(gè)局部，滯留在固 定相微孔內(nèi)的流動(dòng)相一般是停滯不動(dòng)的流動(dòng)相中的試樣分子要與固 定相進(jìn)行質(zhì)量交換，必須首先擴(kuò)散到滯留區(qū)。如果固定相的微孔既小 又深，傳質(zhì)速率就慢，對峰的擴(kuò)展影響就大（如教材P. 302圖15. 6所示）。式中3 m是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。顯然，固定相的粒度愈小，微孔孔徑愈大，傳 質(zhì)速率就愈快，柱效就高。對高效液相色譜固定相的設(shè)計(jì)就是基于這考慮。液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs）可用下式表示：2Cs =CO sd f / D s公式說明試樣分子從流動(dòng)相進(jìn)入固定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換的傳質(zhì)過程 與液膜厚度df平方成正比，與試樣

32、分子在固定液的擴(kuò)散系數(shù)Ds成反 比。式中3 s是與容量因子k有關(guān)的系數(shù)。氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì)，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。4.流動(dòng)相線速度對板高的影響1) L C和GC的H- u圖根據(jù)van Dee mt er公式作LC和 GC的H- u圖，LC和 GC的H- u十分相似，對應(yīng)某一流速都有一個(gè)板高的極小值，這個(gè)極小值就是 柱效最高點(diǎn)；LC板高極小值比GC的極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說明 液相色譜的柱效比氣相色譜高得多；LC的板高最低點(diǎn)相應(yīng)流速比起GC的流速亦小一個(gè)數(shù)量級(jí)，說明對于LC，為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。

33、（2）分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)對板高的貢獻(xiàn)較低 線 速時(shí) ，分 子擴(kuò) 散 項(xiàng) 起主 要作 用； 較 高 線 速時(shí) ，傳 質(zhì)阻力 項(xiàng)起 主要 作 用 ；其中 流動(dòng) 相 傳質(zhì) 阻 力 項(xiàng)對 板高 的 貢 獻(xiàn)幾 乎是 一 個(gè)定 值 。在 高 線 速 度 時(shí) ，固 定 相 傳 質(zhì) 阻 力 項(xiàng) 成 為 影 響 板 高 的 主 要 因 素 ，隨 著速度增高，板高值越來越大，柱效急劇下降。5. 固 定 相 粒 度 大 小 對 板 高 的 影 響粒度 越 細(xì)，板 高越 小，并 且 受線 速度 影響 亦小 。這就是為什么在HPLC中采用細(xì)顆粒作固定相的根據(jù)。當(dāng)然，固定相 顆 粒 愈 細(xì) ，柱 流 速愈 慢。只 有

34、 采 取 高 壓 技術(shù) ，流 動(dòng)相 流速 才能 符 合實(shí)驗(yàn)要求。第四節(jié)分離度值之差分離程分離度R是一個(gè)綜合性指標(biāo)。分 離度 是 既 能反 映柱 效率 又 能反 映選 擇性 的 指 標(biāo) ， 稱總 分 離 效能 指標(biāo) 。分 離度 又叫 分辨 率，它 定 義為 相 鄰 兩 組 分色 譜峰 保留 與 兩組 分色 譜 峰底 寬總 和之 半的 比值 ， 即R = 2 (t r2 - t r1) / W1 +W2R 值 越 大 ， 表 明 相 鄰 兩 組 分 分 離 越 好 。 一 般 說 ， 當(dāng) R1 0時(shí)，隨容量因子增大，分離度的增長是微乎其微的。般取k為210最宜。對于GC,通過提高溫度，可選擇合適的

35、k值， 以改進(jìn)分離度。而對于LC,只要改變流動(dòng)相的組成，就能有效地控 制k值。它對LC的分離能起到立竿見影的效果。4.分離度與分析時(shí)間的關(guān)系當(dāng)k在25時(shí)，可在較短的分析時(shí)間，取得良好的分離度。第六節(jié) 色譜定性和定量分析、色譜的定性分析色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種 定性指標(biāo)。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。但是不同物質(zhì) 在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專屬的。因此僅根據(jù)保留值對一個(gè)完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的基礎(chǔ)上，對樣品組成作初步的 判斷，

36、再結(jié)合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。（一）利用純物質(zhì)對照定性在一定的色譜條件下，一個(gè)未知物只有一個(gè)確定的保留時(shí)間。因此將已知純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保留時(shí)間與未知物的保留 時(shí)間進(jìn)行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能 是已知的純物質(zhì)；不 同，則未知物就不是該純物質(zhì)。純 物質(zhì)對照法定 性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡單，且有純物質(zhì)的未知（二）相對保留值法相對保留值a is是指組分i與基準(zhǔn)物質(zhì)s調(diào)整保留值的比值a is = t ri / t rs = V r/ V r s它僅隨固定液及柱溫變化而變化，與 其它操作條件無關(guān)。相對保留值測定方法：在某一固定相及柱溫下

37、， 分別測出組分i 和基準(zhǔn)物質(zhì) s 的調(diào)整保留值，再按上式計(jì)算即可。用已求出的相對保留值與文獻(xiàn)相應(yīng)值比較即可定性。環(huán)己醇、環(huán)己酮通常選容易得到純品的，而且與被分析組分相近的物質(zhì)作基準(zhǔn)物質(zhì)， 如正 丁烷、環(huán)己烷 、正戊烷、苯、對二甲苯、 等。三） 加入已知物增加峰高法當(dāng)未知樣品中組分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易辨首先作出未知樣認(rèn) 時(shí) ，或 僅 作 未 知 樣 品 指 定 項(xiàng) 目 分 析 時(shí) 均 可 用 此 法 。品的色譜圖，然 后在未知樣品加入某已知物，又 得到一個(gè)色譜圖。峰 高增加的組分即可能為這種已知物。第六節(jié) 色譜定性和定量分析四）保留指數(shù)定性法保留指數(shù)又稱為柯瓦（Kov dt s

38、）指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是 目 前 使 用 最 廣 泛 并 被 國 際 上 公 認(rèn) 的 定 性 指 標(biāo) 。它 具 有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)。保留指數(shù)也是一種相對保留值，它是把正構(gòu)烷烴中某兩個(gè)組分的調(diào)整保留值的對數(shù)作為相對的尺度，并假定正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為n 100。被測物的保留指數(shù)值可用內(nèi)插法計(jì)算。例如，若確定物質(zhì)i在某固定液X上的保留指數(shù)Ii X的數(shù)值。個(gè)為先選取兩個(gè)正構(gòu)烷烴作為基準(zhǔn)物質(zhì)， 其中一個(gè)的碳數(shù)為 Z， 另,使被測物質(zhì)iZ+ 1 ,它們的調(diào)整保留時(shí)間分別為t *R(Z)和t * R( Z + 1 )的調(diào)整保留時(shí)間t，R( i )恰好于兩者之間，即t，R

39、( Z) t，R( i ) C t * R( Z+1 ) o將含物質(zhì)i和所選的兩個(gè)正構(gòu)烷烴的混合物注入其固定液X的色譜 柱，在一定溫度條件下繪制色譜圖。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，化合物調(diào)整 保留時(shí)間的對數(shù)值與其保留指數(shù)間的關(guān)系基本上是一條直線關(guān)系。據(jù) 此，可用內(nèi)插法求算Ii Xrx= 100z +( i g t R(i)l g t r(Z) )/( l g t r( z+ 1)- l g t r(Z)保留指數(shù)的物理意義在于：它是與被測物質(zhì)具有相同調(diào)整保留時(shí)間的假想的正構(gòu)烷烴的碳數(shù)乘以100。保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實(shí)驗(yàn)條件無關(guān)。其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。只 要柱溫與固定相相同，就可應(yīng)用

40、文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物質(zhì)相 對照。五)其它方法、定量分析定量分析的任務(wù)是求出混合樣品中各組分的百分含量。色譜定的依據(jù)是，當(dāng)操作條件一致時(shí)，被測組分的質(zhì)量(或濃度)與檢測器給出的響應(yīng)信號(hào)成正比。即 :Ci = f iAi式中Bi為被測組分i的質(zhì)量；Ai為被測組分i的峰面積；f i為被測組分i的校正因子。可見，進(jìn)行色譜定量分析時(shí)需要：(1)準(zhǔn)確測量檢測器的響應(yīng)信號(hào)一峰面積或峰高；3)正 確選 擇合 適的 定量 計(jì)算 方法 ，將 測得 的峰 面 積 或 峰 高 換算 為組分的百分含量。一)峰面積測量方法峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測量的準(zhǔn)確與否直 接 影 響 定 量 結(jié) 果 。對

41、于 不 同 峰 形 的 色 譜 峰 采 用 不 同 的 測 量 方 法 。1 ) 對 稱 形 峰 面 積 的 測 量 峰 高 乘 以 半 峰 寬 法對稱峰的面積 A = 1. 065 hW1/ 22 ) 不 對 稱 形 峰 面 積 的 測 量 峰 高 乘 平 均 峰 寬 法對于不對稱峰的測量如仍用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。A = 1/ 2h( W0. 15 + W0. 85)式中W0.15和 W0.85分別為峰高0. 15倍和0. 85倍處的峰寬。二)定量校正因子色譜 定 量分 析的 依據(jù) 是被 測組 分的 量與 其 峰面 積成 正比 。但是峰 面 積 的 大 小

42、不 僅 取 決 于 組 分 的 質(zhì) 量 ，而 且 還 與 它 的 性 質(zhì) 有 關(guān) 。即 當(dāng) 兩個(gè)質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測器進(jìn)行測定時(shí)， 所 得 的 峰 面 積 卻 不 相 同 。因 此 ，混 合 物 中 某 一 組 分 的 百 分 含 量 并 不 等 于 該 組 分 的 峰 面 積 在 各 組 分 峰 面 積 總 和 中 所 占 的 百 分 率 。這 樣 ，就 不 能 直 接 利 用 峰 面 積 計(jì) 算 物 質(zhì) 的 含 量 。為 了 使 峰 面 積 能 真 實(shí) 反 映 出 物 質(zhì)的質(zhì)量，就要對峰面積進(jìn)行校正，即 在定量計(jì)算是引入校正因子。校正因子分為絕對校正因子和相對校正因子

43、。f i = m / Ai式中f i值與組分i質(zhì)量絕對值成正比，所以稱為絕對校正因子。在定量分析時(shí)要精確求出fi值是比較困難的。一方面由于精確測量 絕對進(jìn)樣量困難；另一方面峰面積與色譜條件有關(guān)，要保持測定fi 值時(shí)的色譜條件相同，既不可能又不方便。另外即便能夠得到準(zhǔn)確的f i值，也由于沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而無法直接應(yīng)用。為此提出相對校正因的概念來解決色譜定量分析中的計(jì)算問題。1.相對校正因子相對校正因子定義為即某組分i的相對校正因子f i 為組分i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)因子之比。(mi / Ai ) / ( ms/ As)= ( m / ms)( As可見，相對校正因子fi-就是當(dāng)組分i的質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s相等時(shí)

44、，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積是組分i峰面積的倍數(shù)。若某組分質(zhì)量為m ,峰 面積Ai ，則fi Ai的數(shù)值與質(zhì)量為m的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積相等。也就是說，通過相對校正因子，可以把各個(gè)組分的峰面積分別換算成與 其質(zhì)量相等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，于是比較標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一了。這就是歸法求算各組分百分含量的基礎(chǔ)。2.相對校正因子的表示方法上面介紹的相對校正因子中組分和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是以質(zhì)量表示的，故又稱為相對質(zhì)量校正因子；若以摩爾為單位，相對摩爾校正因 子；另外相對校正因子的倒數(shù)還可定義為相對響應(yīng)值S（分別為相對 質(zhì)量響應(yīng)值Sw 相對摩爾響應(yīng)值Sn 。通常所指的校正因子都是相 對校正因子。3. 相對校正因子的測定方法相對校正因子值只與被測物和標(biāo)準(zhǔn)物以及檢測器的類型有關(guān)，而與操作條件無關(guān)。因此，fi值可自文獻(xiàn)中查出引用。若文獻(xiàn)中 查不到所需的f i值，也 可以自己測定。常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對 熱導(dǎo)檢 測器（TCD）是苯，對氫焰檢測器（FID）是正庚烷。測定相對校正因子最好是用色譜純試劑。若無純品，也要確知該物質(zhì)的百分含量。測定時(shí)首先準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測物，然后將 它們混合均勻進(jìn)樣，分別測出其峰面積，再進(jìn)行計(jì)算。（三）定量計(jì)算方法1. 歸