超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母-葡聚糖的研究

1、超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母 -1,3-葡聚糖的研究摘 要： 采用超聲-酶-堿法從啤酒廢酵母中提取 -1,3-葡聚糖，在超聲波預(yù)處理和酶解最佳條件的同時(shí)，利用響應(yīng)曲面法研究分析 NaOH 濃度、溫度、用量和時(shí)間對(duì) -1,3-葡聚糖得率、純度和蛋白質(zhì)含量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波處理后破壁率為 94.22 %；酶解后蛋白質(zhì)去除率為 62.82 %；當(dāng)加入 2.05 %的 NaOH 30.50 mL，74 處理5.7 h，-1,3-葡聚糖的得率為 10.21 %，純度為 88.14 %，蛋白質(zhì)含量為 1.19 %。超聲-酶-堿法處理工藝具有 -1,3-葡聚糖得率、純度高、蛋白質(zhì)含量低及提取時(shí)間短

2、的特點(diǎn)。關(guān)鍵詞： 綜合利用； 超聲-酶-堿法； 啤酒廢酵母； -1,3-葡聚糖； 響應(yīng)曲面法Resarch on the Extraction of -1,3-glucan from WasteBeer Barm by Ultrasonic-enzyme-alkali MethodAbstract: -1,3-glucan was extracted from waste beer barm by ultrasonic-enzyme-alkali method. In addition to the research on the optimumconditions of ultrasound

3、 pretreatment and zymolysis, the effects of NaOH concentration, temperature, use level and reaction time on the yield,the purity and protein content of -1,3-glucan were studied by response surface method. The results showed that the broken rate of barm cells byultrasound was 94.22 %, the removal rat

4、e of protein after zymolysis was 62.82 %, when 30.50 mL 2.05 % NaOH was added for 5.7 h treatmentat 74 , the yield of -1,3-glucan was 10.21 %, the purity was 88.14 % and protein content was 1.19 %. The ultrasonic-enzyme-alkali methodhad the advantages including high -1,3-glucan yield and high purity

5、, low protein content as well as short extracition time.Key words: comprehensive utilization; ultrasonic-enzyme-alkali method; waste beer barm; -1,3-glucan; response surface method酵母 -1,3-葡聚糖是一種良好的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑BRMS， 在增強(qiáng)機(jī)體抗輻射和促進(jìn)傷口愈合等方面有顯著作用1。 酵母 -1,3-葡聚糖除因不溶性使其在抗腫瘤等臨床應(yīng)用上受到限制外，抗氧化、保濕、無刺激和免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，使其在食品、化妝品和醫(yī)

6、學(xué)方面有廣泛應(yīng)用23。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007 年中國啤酒產(chǎn)量為 3931.4 萬 t，產(chǎn)生廢酵母約 58.97 萬 t（干重），而 -1,3-葡聚糖含量達(dá)到酵母細(xì)胞壁的 29 %，開發(fā)潛力巨大。 目前，提取 -1,3-葡聚糖的方法主要有酸-堿法、酶-堿法和自溶-酶-堿法45。 其中，酸-堿法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，酶-堿法試劑用量較大，而自溶-酶-堿法雖能得到得率和純度較高的-1,3-葡聚糖，但提取時(shí)間過長(zhǎng)。本文主要研究的是超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母-1,3-葡聚糖工藝，即在常規(guī)的酶-堿法之前，對(duì)酵母進(jìn)行了超聲波預(yù)處理，使細(xì)胞壁松散、破碎，增大溶劑作用面積，以縮短提取時(shí)間和提高提取率。 首先對(duì)超聲波破壁

7、和酶解除蛋白效果進(jìn)行研究，再采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化堿溶條件（NaOH 濃度、溫度、用量和時(shí)間），建立堿溶與-1,3-葡聚糖之間的數(shù)學(xué)模型，以期獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，為啤酒廢酵母綜合利用提供理論數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料：新鮮啤酒廢酵母（廣西南寧青島啤酒有限公司提供）；木瓜蛋白酶（食品級(jí)）；NaOH、無水乙醇等（分析純）。實(shí)驗(yàn)儀器：丹麥 FOSS 自動(dòng)定氮儀；美國貝克曼超速離心機(jī)；日本島津 UV-2051PC 紫外可見分光光度計(jì)；96真空冷凍干燥機(jī)。1.2 提取 -1,3-葡聚糖工藝流程啤酒廢酵母預(yù)處理超聲波處理酶解堿溶醇洗、水洗真空冷凍干燥-1,3-葡聚糖1.3 工藝要點(diǎn)1.3.

8、1 預(yù)處理新鮮啤酒廢酵母置于 0 冷水中絮凝， 回收啤酒（上清液）后過 200 目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得水分含量為 20 %25 %的凈酵母，40 烘箱鼓風(fēng)干燥后磨粉，待用。1.3.2 超聲波處理取干酵母 5 g，加入 15 mL 水，在功率為 140 W、頻率為 42 kHz 的條件下，處理 1080 min，再加入同體積的無水乙醇于 70 恒溫提取， 離心后測(cè)定上清液海藻糖和蛋白質(zhì)含量。1.3.3 酶解取破壁后的酵母殘?jiān)?5 g，先加入 50 mL 水，再添加208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，于 50 、pH6.0 條件下酶解8 h，離心后測(cè)定沉淀蛋白質(zhì)含量。1.4 堿溶響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)采用 Box

9、-Behnken 設(shè)計(jì)，選取 NaOH 濃度（x1）、溫度（x2）、用量（x3）和時(shí)間（x4）4 個(gè)因素為自變量，以 -葡聚糖的純度（Y1）、 蛋白質(zhì)含量 （Y2） 和得率 （Y3） 為響應(yīng)值。按照方程 xi=（Xi-Xo）/X 對(duì)自變量進(jìn)行編碼。 式中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，X 為變量的變化步長(zhǎng)。 試驗(yàn)因素的水平編碼見表 1。設(shè)該模型通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為：Y=+4i = 1iXi+4i=1,jiXiXj+4i = 1iiX2ij其中： 為常數(shù)項(xiàng)，i為線性系數(shù)，ij為交叉項(xiàng)系數(shù)，ii為二次項(xiàng)系數(shù)。1.5 分析方法用 FOSS

10、 自動(dòng)定氮儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量， 蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量6。得率 =成品質(zhì)量原料質(zhì)量100 %純度 =多糖質(zhì)量成品質(zhì)量100 %2 結(jié)果與分析2.1 超聲波處理超聲波主要通過空化效應(yīng)， 使液體中產(chǎn)生空化泡，空化泡長(zhǎng)到一定程度或強(qiáng)烈震蕩將發(fā)生崩潰，會(huì)在局部小區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生高溫高壓， 形成微射流及高速剪切力，使細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物瀉出。 海藻糖和蛋白質(zhì)作為細(xì)胞內(nèi)主要內(nèi)容物，能用來評(píng)價(jià)超聲波破壁的效果。 試驗(yàn)結(jié)果見圖 1。由圖 1 可知，海藻糖提取率和蛋白質(zhì)含量隨著超聲輔助提取時(shí)間的加長(zhǎng)而迅速上升， 到 60 min 后達(dá)到穩(wěn)定， 海藻糖最大提取率和蛋白質(zhì)含量分別達(dá)到 94.22 %和 5.27 %，說明超

11、聲波處理達(dá)到了破壁的目的。2.2 酶解試驗(yàn)蛋白酶能夠去除酵母殘?jiān)写罅康牡鞍踪|(zhì)，為后續(xù)提純分離 -1,3-葡聚糖奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，可以回收營養(yǎng)豐富的氨基酸、多肽蛋白液，提高酵母綜合利用水平。 研究表明，取破壁后的酵母殘?jiān)?5 g，加入 50 mL 水，添加208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在 50 、pH6.0 條件下酶解8 h，蛋白質(zhì)去除率達(dá)到最大值 62.82 %，且回收到 0.348g/L 的蛋白液。2.3 堿溶響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果影響 -1,3-葡聚糖品質(zhì)的指標(biāo)有純度、蛋白質(zhì)含量和得率，結(jié)果見表 2。從表 2 可以知道， 純度的變化范圍為 60.27 %90.40 %，蛋

12、白質(zhì)含量變化范圍為 1.15 %2.99 %，得率變化范圍為 8.98 %12.10 %， 其中純度變化趨勢(shì)較明顯。2.3.2 方差分析用統(tǒng)計(jì)軟件 SAS9.1.3 對(duì)表 2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表 3表 6。 回歸參數(shù)方差分析和回歸模型誤差分析主要用來判斷所得方程是否能預(yù)測(cè)相關(guān)指標(biāo)走向，并分析各因素對(duì)目標(biāo)指標(biāo)的影響。由表 3表 4 可知，Y1，Y2和 Y3回歸方程的一次項(xiàng)、Y1的二次項(xiàng)以及失擬項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)都是極其顯著的（P0.01）。 Y2的二次項(xiàng)是顯著的 （0.01P0.05），但Y3的二次項(xiàng)不顯著（P0.05）。 Y1的模型檢驗(yàn)極顯著，擬 合 系 數(shù) R2為 0.9347；Y2的

13、 模 型 檢 驗(yàn) 顯 著 ，R2為1 0 1NaOH (%) x1X11.5 2 2.5x2X260 70 80NaOH (mL) x3X330 45 60(h) x4X45 6 7圖 1 超聲波處理時(shí)間對(duì)酵母破壁的影響馬 森，盧家炯,高俊永，初蘭娜，杜林繁超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母 -1,3-葡聚糖的研究97釀酒科技 2009 年第 2 期（總第 176 期）LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY 2009 No2(Tol176)0.8123，說明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，適合分析-1,3-葡聚糖純度和蛋白質(zhì)含量。 而 Y3模型檢驗(yàn)為不顯著，且 R2為 0.70

14、38，不適合分析得率。響應(yīng)曲面的因素方差分析和參數(shù)估計(jì)與顯著性分析主要用來評(píng)價(jià)獨(dú)立變量對(duì)響應(yīng)值的影響，以及各變量系數(shù)對(duì)響應(yīng)值的影響程度，從而得出主要影響因素。由表 5 可知，濃度和溫度對(duì)純度和蛋白質(zhì)含量影響極其顯著，但對(duì)得率不顯著，而用量和時(shí)間對(duì)這 3 個(gè)指標(biāo)影響均不顯著。由表 6 可知，對(duì)于純度，常數(shù)項(xiàng)、溫度的一、二次項(xiàng)系數(shù)以及時(shí)間的二次項(xiàng)系數(shù)極其顯著，濃度的一次項(xiàng)系數(shù)顯著，二次項(xiàng)系數(shù)極其顯著，其他均不顯著；對(duì)于蛋白質(zhì)含量，常數(shù)項(xiàng)、濃度的一次項(xiàng)、溫度的一、二次項(xiàng)系數(shù)是極其顯著的，濃度的二次項(xiàng)系數(shù)是顯著的，其他均不顯著；對(duì)于得率，僅有常數(shù)項(xiàng)、濃度和處理溫度的一次項(xiàng) X1X2X3X4Y1Y2Y3

15、1 -1 -1 0 0 62.31 2.34 12.102 -1 1 0 0 71.93 2.10 11.873 1 -1 0 0 70.15 2.24 10.114 1 1 0 0 81.21 1.73 9.035 0 0 -1 -1 90.40 1.26 11.006 0 0 -1 1 84.47 1.38 10.587 0 0 1 -1 82.35 1.23 10.138 0 0 1 1 81.33 1.21 10.019 0 0 0 0 88.42 1.23 10.3110 -1 0 0 -1 77.30 2.64 10.4211 -1 0 0 1 74.99 2.23 10.3212

16、 1 0 0 -1 82.09 1.28 10.0513 1 0 0 1 79.25 1.15 10.1014 0 -1 -1 0 66.60 2.01 10.8815 0 -1 1 0 70.37 2.99 10.1516 0 1 -1 0 83.78 1.22 9.5517 0 1 1 0 80.52 1.21 8.9818 0 0 0 0 88.62 1.23 10.3119 -1 0 -1 0 80.80 2.69 10.6520 -1 0 1 0 78.25 2.34 10.4221 1 0 -1 0 80.02 1.22 10.2622 1 0 1 0 83.46 1.19 9.4

17、623 0 -1 0 -1 61.15 2.33 11.3124 0 -1 0 1 60.27 2.23 11.5125 0 1 0 -1 81.44 1.93 10.1226 0 1 0 1 80.48 1.15 9.9127 0 0 0 0 88.60 1.23 10.31R2P4 755.045 0.4132 0.00014 925.022 0.5062 0.0001 6 27.9425 0.0153 0.8191Y1 14 1708.01 0.9347 0.00014 4.63795 0.5133 0.00204 2.26574 0.2508 0.0273 6 0.43585 0.04

18、82 0.7870Y2 14 7.33954 0.8123 0.01434 8.66381 0.6095 0.00624 1.00214 0.0705 0.5982 6 0.33840 0.0238 0.9827Y3 14 10.0043 0.7038 0.1119 x1 x2 x3 1x4 x1 x2 x3 2x4 x1 x2 x3 3x4 98Y1Y2NaOH (%) 2.05 2.02( ) 73.68 88.87(mL) 30.46 102.27( h) 5.72 9.41 Max Min (%) 90.60 0.72 (%) 88.14 0.75圖 3 濃度和溫度對(duì)蛋白質(zhì)含量的響應(yīng)曲

19、面和等高面圖 2 濃度和溫度對(duì)純度的響應(yīng)曲面和等高面馬 森，盧家炯,高俊永，初蘭娜，杜林繁超聲-酶-堿法提取啤酒廢酵母 -1,3-葡聚糖的研究極其顯著，其他均不顯著。 因此，濃度和溫度的一、二次項(xiàng)系數(shù)是影響 -1，3-葡聚糖的主要因素。2.3.3 響應(yīng)曲面模型建立應(yīng)用 SAS9.1.3 通過最小二乘法擬合得到二次多項(xiàng)式回歸模型：Y1=88.5466 -2.55x1-7.3758x2-0.8158x3-1.1616x4-5.9250x12+0.36x2x1-12.3687x22+1.4975x3x1-1.7575x3x2-0.8512x32-0.1325x4x1-0.02x4x2+1.2275x

20、4x3-4.205x42Y2=1.233333 -0.460833x1-0.401667x2+0.032500x3-0.108333x4+0.472083x1x12- 0.0675x1x2+ 0.515833x22+0.08 x3x1- 0.2475x3x2+ 0.072083x32+ 0.07x4x1- 0.175x4x2-0.035000x4x3+0.083333 x422.3.4 響應(yīng)面分析三維響應(yīng)曲面圖可以直觀反映影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響，曲面較陡說明影響顯著，曲線平緩說明影響不顯著。 等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示不顯著。 濃度和溫度對(duì)純度

21、的響應(yīng)曲面和等高面見圖 2，濃度和溫度對(duì)蛋白質(zhì)含量的響應(yīng)曲面和等高面見圖 3。由圖 2圖 3 的曲面圖所示，溫度（X2）對(duì)純度（Y1）的影響較大，濃度（X1）對(duì)蛋白質(zhì)含量（Y2）的影響較大 ，濃度和溫度的交互作用對(duì)純度較明顯。為進(jìn)一步確定穩(wěn)定點(diǎn)，對(duì)模型進(jìn)行了典型分析。 運(yùn)用數(shù)學(xué)的方法來查找響應(yīng)曲面的穩(wěn)定點(diǎn)，能夠檢驗(yàn)出穩(wěn)定點(diǎn)是最大點(diǎn)、最小點(diǎn)還是鞍點(diǎn)，結(jié)果見表 7。由表 7 可知，純度的穩(wěn)定點(diǎn)是最大值，蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)定點(diǎn)是最小值。 在濃度為 2.05 %、溫度為 74 、用量為 30.50 mL 和時(shí)間為 5.7 h 條件下，純度理論最大值達(dá)到 90.60 %；當(dāng)濃度為 2.02 %、溫度為 88

22、.87 、用量為 102.27 mL 和時(shí)間為 9.41 h 時(shí)，蛋白質(zhì)理論含量最小值為 0.72 %。 因此，為了得到高純度、低蛋白質(zhì)含量、合適的得率以及節(jié)約試劑和便于控制等問題，選取濃度為2.05 %、溫度為 74 、用量為 30.50 mL 和時(shí)間為 5.7 h進(jìn)行分析是合適的。 此時(shí)，實(shí)際測(cè)定 3 次，得純度平均值為 88.14 %，于預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)偏差為 1.04 %；蛋白質(zhì)含量為 1.19 %，得率為 10.21 %。3 結(jié)論提出了超聲-酶-堿法提取酵母 -1,3-葡聚糖的工藝。 采用 Box-Behnken 設(shè)計(jì)， 響應(yīng)曲面分析法研究NaOH 濃度、溫度、用量和時(shí)間對(duì) -1,3-葡聚糖的影響，并建立了純度和蛋白質(zhì)含量的二次多項(xiàng)式回歸模型。 通過相關(guān)方差分析證明模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)啤酒酵母 -1,3-葡聚糖的評(píng)價(jià)指標(biāo)。得到最優(yōu)工藝條件為：功率為 140 W 的超聲波處理 60 min 后，破壁率達(dá)到 94.22 %；添加 208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在 50 、pH6.0 的條件下酶解 8 h， 蛋白質(zhì)去除率達(dá)到最大值62.82 %； 加入 30.50 mL 濃度為 2.05 %的 NaOH，74 處理 5.7 h，最終 -1,3-葡聚糖的得率為 10.21 %，純度為 88.14 %，蛋白質(zhì)含量為 1.19 %