培養(yǎng)基組成、類型與配制和滅菌

1、 第二節(jié) 培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌 一、培養(yǎng)基的組成和作用 培養(yǎng)基（medium）是植物組織培養(yǎng)的 重要材料，是外植體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 只有配制出適宜的培養(yǎng)基，才能使組織 培養(yǎng)獲得成功。 通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以 下六大類成分，即礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)成分 、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其 他附加物等。 培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是營(yíng)養(yǎng)成分及植物 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度。 （一）礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)： 礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)又稱無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，是指植物生長(zhǎng)發(fā)育 所需要的各種化學(xué)元素。 礦質(zhì)元素的生理作用： （1）組成各種化合物，成為結(jié)構(gòu) 物質(zhì)； （2）構(gòu)成特殊物質(zhì)，參與代謝； （3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及 電荷平衡等電化學(xué)作用； （4

2、）影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官 的建成等。 根據(jù)植物對(duì)元素的吸收量，可以把植 物必需元素分為大量元素和微量元素。 國(guó)際植物生理學(xué)會(huì)建議將植物所需濃 度大于0.5 mmol/l的的元素稱為大量元 素。低于0.5 mmol/l的元素稱為微量元 素。 根據(jù)此規(guī)則大量元素種類包括C、H、 O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中C、H 、O為氣體元素，其余六種為礦質(zhì)元素 ，分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為18、10 、70、0.3%、0.07、0.3%、0.3 、0.07%、0.05。 微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、 Cu、Co、Cl等。 1、大量元素： 組織培養(yǎng)中，各種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)主要從培養(yǎng) 基中獲得，N、P

3、、K、Ca、Mg、S等6種 大量元素依靠各種無(wú)機(jī)鹽提供。 不同植物種類和不同試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)元素 的使用量要求不同，需經(jīng)試驗(yàn)確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物 組織培養(yǎng)。其中以MS應(yīng)用最廣泛。 以MS為例6中礦質(zhì)元素分別由KNO3、 NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2 . 2H2O提供。 大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或 銨態(tài)氮的形式被使用，但銨態(tài)氮濃度 過(guò)高會(huì)對(duì)有些植物培養(yǎng)物造成傷害， 不適宜使用過(guò)高的濃度。而常用MS培 養(yǎng)基中既有硝態(tài)氮又有銨態(tài)氮。 2、微量元素： 植物組織的對(duì)其需要量極少，過(guò)多會(huì)產(chǎn)生毒 害，如造成蛋白質(zhì)變性、酶系失活。代謝障 礙等。 各種微量元素

4、均具有特定的生理功能，如硼 與蛋白質(zhì)的合成及糖類的運(yùn)輸有關(guān)；銅能促 進(jìn)離體根的形成；錳參與植物的光合作用和 呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。 微量元素中，鐵的用量較大，它對(duì)葉綠 素的合成起重要作用，由于在較高pH下 ，F(xiàn)eCl3極易形成Fe（OH）3 沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四 乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物， 并且單獨(dú)配制。 （二）有機(jī)成分： 主要包括各種維生素和氨基酸，如硫 胺素（VB1）、煙酸（VB3）、吡哆醇（ VB6）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺 素（VB12）、葉酸等以及甘氨酸、谷氨 酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天 冬酰氨、丙氨酸等。有時(shí)添加水解乳蛋 白或水解酪

5、蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的 水解產(chǎn)物，含有20種氨基酸的混合物， 用量101000mg/L, 通常用于原生質(zhì)體 等培養(yǎng)。 此外肌醇是另外一種重要的有機(jī)成分 ，又叫環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起重 要作用，此外還參與磷脂代謝及維持離 子平衡等生理作用。 （三）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)： 植物激素是植物新稱代謝中產(chǎn)生的天然化 合物，它能以極微小的用量直接影響植物 細(xì)胞的分化、分裂以及發(fā)育，影響植物的 形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、衰老脫落 、休眠、萌發(fā)等生理活動(dòng)。 在植物組織培養(yǎng)中，主要通過(guò)植物激素及 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體的組織、器官的形態(tài) 發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、愈傷 組織的生長(zhǎng)、根芽的分化以及體細(xì)胞胚胎

6、 發(fā)生等。 常用的植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物涉及 五大類植物激素： 1、生長(zhǎng)素類：IAA、IBA、NAA、2 ，4-D 2、細(xì)胞分裂類：6-BA、KT（Kin） 、ZT、2ip 3、赤霉素類：GA3、GA4、GA7 4、脫落酸：ABA 5、乙烯：ETH 1、生長(zhǎng)素類： 主要促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分 裂，誘導(dǎo)形成愈傷組織，促進(jìn)生根 。 常用的有NAA、IAA、IBA、2，4 D等。 2、細(xì)胞分裂素類： 促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，促進(jìn)莖增粗 ，抑制莖伸長(zhǎng)；誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn) 側(cè)芽萌發(fā)；延緩衰老。 常用細(xì)胞分裂素有BA、KIN、ZT、 2ip等。 此外近年來(lái)發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物具有 非常高的細(xì)胞分裂素活性，在多種植

7、 物上應(yīng)用。 如TDZ，CPPU，4PU等。 3、赤霉素類： 主要具有誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng)，對(duì) 根無(wú)效；對(duì)形成層細(xì)胞分化有影響 ，與生長(zhǎng)素協(xié)同作用；可以誘導(dǎo)離 體成花；打破休眠等功能。 常用GA3、GA4等。 4、脫落酸（ABA）： 促進(jìn)休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng) 中較少使用，主要用于調(diào)節(jié)激素平衡 ，促進(jìn)形態(tài)建成。 5、乙烯： 主要促進(jìn)衰老和脫落，高濃度易形 態(tài)變化。 （四）碳源： 碳源主要為細(xì)胞提供合成新化合物的骨架，為 細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持 一定的滲透壓。 常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在2-5，此 外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可 溶性淀粉等也常用于植物組織培

8、養(yǎng)。 糖濃度高低直接影響形態(tài)建成。 （五）瓊脂： 瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物 的作用，不提供營(yíng)養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分 子化合物，僅溶于熱水（90 oC以上），成為凝膠 ，冷卻后（40 oC以下）即凝固為凝膠。 瓊脂的用量通常在410g/L. 瓊脂是組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中主要的成本支出，約占 80。 瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工工 藝有關(guān)外，還受高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間 以及pH影響。 （六）有機(jī)附加物： 1、椰子汁： 用量為100200g/L。 2、香蕉泥： 使用量為150200g/L。 3、蘋果汁、番茄汁等。 （七）其他成分： 1、活性炭： 使用量為0 .2-1%。 2、抗生

9、素： 常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用 量在520mg/L。 3、抑制酚類物質(zhì)形成的物質(zhì)： （1）抗壞血酸： 可以加入培養(yǎng)基或浸泡處理外植體。 （2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）： 加入培養(yǎng)基中。 4、生長(zhǎng)抑制劑： 常用矮壯素、比久（B9）、多效唑（ pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等。 二、培養(yǎng)基的類型： 1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH等。 適用于多數(shù)營(yíng)養(yǎng)需求量較大的植物。 2、中等鹽濃度培養(yǎng)基：Nitsh、Miller等 大量元素濃度約為MS的1/2。 3、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White等。 大量元素濃度約為MS的1/4左右。 適用于木本植物的培養(yǎng)。 表1MS培養(yǎng)基的組成配方 組成

10、成分?jǐn)?shù)量(mg/l)組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l) NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇 100.0 H3BO36.2 煙酸 0.5 MnSO44H2O22.3 鹽酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 鹽酸硫銨等 0.4 CoCl26H2O0.025 表2B5培養(yǎng)基的組成和配方 組成成分 數(shù)量(mg/l） 組成成分 數(shù)量(mg/l) KN

11、O3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5 KI 0.75 肌醇 100 H3BO4 3.0 煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動(dòng)素 0.1 Na2MoO42H2 O 0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨 10 Na2-EDTA37.3 表3 N6培養(yǎng)基的組成和配方 組成成分 數(shù)量(mg/l)組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaC

12、l22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47H2O1.5 三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制： 由于培養(yǎng)基中元素種類多，用量少，因 此每次稱量繁瑣，因此通常將各種營(yíng)養(yǎng)成 分配制成母液保存，配制培養(yǎng)基時(shí)根據(jù)需 要量取用，從而簡(jiǎn)化操作，節(jié)省時(shí)間。 營(yíng)養(yǎng)元素母液根據(jù)其性質(zhì)和反應(yīng)特性 混合。 激素母液 根據(jù)使用濃度配制。 1、器皿和用具的準(zhǔn)備 儀器包括萬(wàn)分

13、之一天平，百分之一天平 ，pH計(jì) 用品包括不同型號(hào)的燒杯（2000ml、 1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、 500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、 2ml、1ml）、試劑瓶若干（1000ml、 250ml）、移液器（1000ul、200ul）滴灌 、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角瓶（ 150ml、100ml、50ml）、培養(yǎng)基分裝器 ，漏斗、稱量紙、標(biāo)簽紙、不同范圍pH 試紙、鉛筆等。 玻璃器皿用前清洗干凈。 2、藥品及蒸餾水準(zhǔn)備： 藥品采用分析純或化學(xué)純?cè)噭?水利用蒸餾水或去離子水。 3、母液配制： （1）配制母液原則： 相同類型的試劑混合； 易形成沉淀的藥品分

14、開； 母液濃度要適宜； 用量要認(rèn)真計(jì)算和核對(duì)； 藥品要準(zhǔn)確稱量。 （2）MS培養(yǎng)基母液的配制： MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配 成四種母液，即大量元素母液（10或 20倍）、微量元素母液（100或1000倍 ）、Fe鹽（100倍）、有機(jī)物（100倍 ）。 配置前先進(jìn)行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配 制體積計(jì)算母液試劑用量，然后稱取 藥品，大量元素可以用百分之一或千 分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機(jī) 物用萬(wàn)分之一天平稱量。 （3）激素母液的配制： 根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜 的母液，用萬(wàn)分之一天平稱取激素， 溶劑溶解后加水定容。 生長(zhǎng)素類、赤霉素類及脫落酸等用 95乙醇溶解；細(xì)胞分裂素類用1N HCl

15、或1N NaOH溶解。 通常激素母液濃度生長(zhǎng)素類為 0.10.5 mg/ml, 細(xì)胞分裂素母液濃度 為0.21.0 mg/ml. 四、培養(yǎng)基的配制： 1、量取母液：營(yíng)養(yǎng)元素和激素。 2、稱量蔗糖、瓊脂，放入600ml左右蒸 餾水的鍋內(nèi)，電爐上加熱，使瓊脂溶化 。 3、加入母液，混合均勻，調(diào)整pH值， 定容。 4、分裝入瓶，每瓶4050ml。 5、封口：用46層稱量紙封口，之后滅 菌備用。 五、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）： 1、加熱： 滅菌前檢查滅菌鍋內(nèi)水量是否充足，然后 將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內(nèi)，蓋好滅菌鍋蓋，關(guān) 閉放氣閥，打開電源，加熱升溫。 2、排氣： 當(dāng)溫度升至0.5kg/cm2時(shí)，打開放

16、氣閥徹 底排出鍋內(nèi)冷空氣。然后關(guān)閉放氣閥，促使 壓力繼續(xù)上升。 3、溫度控制： 當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至1.1kg/cm2（121） 時(shí)，計(jì)時(shí)1520分鐘，計(jì)時(shí)結(jié)束后，關(guān) 閉電源。 4、出鍋： 當(dāng)滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s后，取出培養(yǎng)基， 放置于接種室備用。 第四節(jié) 影響園藝植物組織培養(yǎng)的因素 一、外植體： 1 、植物種類和基因型 植物離體培養(yǎng)基因型的依賴性。 親緣關(guān)系相近的材料，其形態(tài)發(fā)生的條件常類似。 2、材料的生理狀態(tài)與發(fā)育年齡 植株（無(wú)菌苗）的發(fā)育年齡，一般幼態(tài)組織比老態(tài)組織 形態(tài)發(fā)生能力高。 3. 取材部位 同一植物不同器官、組織或細(xì)胞，形態(tài)發(fā)生能力和 方向常不同. eg. 種子、幼胚和下胚軸常較容易形

17、成胚狀體；而莖段、葉片則比較困難。 4. 外植體大小對(duì)器官再生有影響. eg.木薯分生組織 0.2mm,再生植株；0.2mm,愈傷 組織、根 5.取材季節(jié). 多數(shù)植物在生長(zhǎng)旺盛季節(jié)、適宜環(huán)境，容易培養(yǎng)成 功.如，溫室與露地外植體。 二、 培養(yǎng)基 1、營(yíng)養(yǎng)成分 一般認(rèn)為，培養(yǎng)基中的銨態(tài)氮和K+有利于胚狀體形成 ，提高無(wú)機(jī)磷的含量可促進(jìn)器官發(fā)生，不加還原氮有利 于根的形成。 莖尖培養(yǎng)和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要是MS及其修改的培養(yǎng) 和B5培養(yǎng)基。 莖尖培養(yǎng)的起始培養(yǎng)基和芽增殖的培養(yǎng)基往往不同。 碳水化合物種類及濃度對(duì)胚狀體發(fā)育有重要作用。缺糖 或低糖無(wú)法形成胚狀體。 2. 植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 （1）生長(zhǎng)素：生長(zhǎng)素促進(jìn)外植體生長(zhǎng)、生根，并與細(xì)胞分 裂素共同誘導(dǎo)不定芽分化及側(cè)芽萌發(fā)與生長(zhǎng)。 2，4 D誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，引起的細(xì)胞分裂活性促 進(jìn)細(xì)胞極性生長(zhǎng)；但是，抑制體胚貯藏成分的形成，不利 體胚成熟。 （2）細(xì)胞分裂素：細(xì)胞分裂素促進(jìn)芽的分化和形成，抑制 根發(fā)育及衰老。 Eg. 6 BA，噻重氮苯基（TDZ），椰子汁 （3）赤霉素 主要是GA3促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)，打破休眠，對(duì)芽的 誘導(dǎo)和形成有促進(jìn)作用。 三、培養(yǎng)條件 1、光照 光照強(qiáng)度 一般要求1000-5000lx，煙草和可可的