茶多酚對木瓜蛋白酶的絡(luò)合作用及特性的影響

1、茶多酚對木瓜蛋白酶的絡(luò)合作用及特性的影響第lo期(總第79期)2006年lo月農(nóng)產(chǎn)品加工?學(xué)刊academicperiodicaloffarmproductsprocessing?77?no.1o0ct.文章編號:16719646(2006)10007704茶多酚對木瓜蛋白酶的絡(luò)合作用及特性的影響陳曉燕,姜紹通,蔡靜(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,合肥230009)摘要:茶多酚對木瓜蛋白酶具有絡(luò)合作用.以茶多酚為原料,采用boxbehnken設(shè)計法,優(yōu)選出茶多酚與木瓜蛋白酶絡(luò)合的最佳條件,并在此基礎(chǔ)上研究了木瓜蛋白酶在絡(luò)合前后性質(zhì)的變化,包括酶的熱穩(wěn)定性和抗氧化性.結(jié)果表明,茶多酚對木瓜蛋白

2、酶的活力回收率高達(dá)99.01%;木瓜蛋白酶在絡(luò)合后熱穩(wěn)定性有所增強,熱失活速率由1.025min降低至1.010min;絡(luò)合后的酶對鄰苯三酚自氧化過程的抑制率由10.1%增加至16.4%,其抗氧化性明顯增強.經(jīng)hplc分析發(fā)現(xiàn),茶多酚中有3種單體與木瓜蛋白酶發(fā)生絡(luò)合作用,其中以egcg含量最高.關(guān)鍵詞:木瓜蛋白酶;茶多酚;絡(luò)合;熱穩(wěn)定性;抗氧化性中圖分類號:33272.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼:atheeffectoftea-polyphenoloncomplexionandpropertiesofpapainchenxiaoyan,jiangshaotong,caijing(schoolofbiotec

3、hnologyandfoodengineering,hefeiuniversityoftechnology,hefei230009,china)abstract:tea-polyphenolwasusedtocomplexpapain.takingtea-polyphenolasmaterial,thebestconditionofthecomplex-ionforteapolyphenolandthepapainwaschoseinthewayofboxbehnkenforthisstudy.andonthefoundation,thevarietyofpapainspropertywass

4、tudied,forexamplethethermalstabilityandantioxidantactivity.theresultsshowedthattherecov-eryrateoftheactivitywasupto99.01%;thethermalstabilityofpapainwasimprovedaftercomplexionwithteapolyphenol,theactivitylosingrateconstantwasloweredfrom1.025minto1.010min;andwiththecomplexing,theinhibitionrateincatec

5、holsoxidizeprocesswasincreasedby10.1%to16-4%.theantioxidantactivitywasstrengthenedobviously.byhplcanalysis,therewerethreekindsofmonomersinthetea-polyphenolwithtpcpapain,theegcgcontentwasthehighest.keywords;papain;teapolyphenol;complex;thermalstability;antioxidantactivity0引言茶多酚具有抗氧化,清除體內(nèi)超氧陰離子自由基,抗癌,防

6、癌和降血脂等優(yōu)異功能,以及純天然,高效能,無毒副作用等顯著特點.我國衛(wèi)生部已批準(zhǔn)了茶葉天然抗氧化劑為我國的食品添加劑之一,并已應(yīng)用到油脂和肉類等食品加工上【1.木瓜蛋白酶在食品及其他工業(yè)具有廣泛應(yīng)用,但其熱穩(wěn)定性差使其應(yīng)用受到較多限制,因此現(xiàn)階段木瓜蛋白酶的應(yīng)用關(guān)鍵在于木瓜蛋白酶的穩(wěn)定化.茶多酚表現(xiàn)出很強的抗氧化活性,它與蛋白質(zhì)的絡(luò)合特性將有助于改善木瓜蛋白酶等含巰基的蛋白酶在室溫下被氧化而失去活性的性質(zhì)21.本文主要研究的是茶多酚與木瓜蛋白酶的絡(luò)合作用,并對絡(luò)合前和絡(luò)合后的木瓜蛋白酶性質(zhì)進(jìn)行研究,從而為進(jìn)一步研究茶多酚與木瓜蛋白酶的絡(luò)合物在實際生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù).1材料與方法1.1木瓜蛋白

7、酶和茶多酚的絡(luò)合作用將木瓜蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司產(chǎn)品)分別用ph值為6.0,7.0和8.0的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液配制成2mg/ml的溶液,然后將茶多酚(無錫綠寶生物制品有限公司產(chǎn)品)按與木瓜蛋白酶的不同質(zhì)量比添加到50ml酶液中,茶多酚與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為2:1,3:1和4:1.混合完全后,在特定溫度下,放置特定長的反應(yīng)時間,觀察其絡(luò)合物的混合現(xiàn)象.混濁物用離心機在7500r/min速度下離心10min將其分離,沉淀物用相應(yīng)的磷酸緩沖液溶解,測定沉淀物的蛋白質(zhì)含量和酶活,以確定絡(luò)合反應(yīng)酶活性回收最高的絡(luò)合條件.1.2蛋白質(zhì)含量的測定采用bradford法測定溶液中蛋白質(zhì)的濃

8、度31,以木瓜蛋白酶作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用721型分光光度計在595nm波長條件下測定吸光度的變化,以蛋白質(zhì)的濃度對吸光度作圖,得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.收稿日期:20060821基金項目:科技部星火計劃項目(2003ea710034).作者簡介:陳曉燕(1979-),女,浙江人,助理工程師,在讀碩士,研究方向:食品生物化工.e-mail:swspcxy.農(nóng)產(chǎn)品加工?學(xué)刊2006年第lo期1.3木瓜蛋白酶活性的測定從經(jīng)濟和簡便的角度考慮,用紫外光譜法測定木瓜蛋白酶的酶活,該法采用磷酸氫二鈉一檸檬酸溶液作為緩沖溶液,使繁瑣的操作步驟大為簡化,便捷,且試劑易得,該法也廣泛適用于其他蛋白酶的活力測定.木瓜蛋白酶

9、在一定的溫度與ph值條件下,水解酪蛋白(sigma公司產(chǎn)品),水浴60cc滅酶,然后加入三氯乙酸使未水解的酪蛋白沉淀除去,用uv210i型紫外分光光度計在275nm條件下測定吸光度.根據(jù)吸光度計算木瓜蛋白酶活力.木瓜蛋白酶活力單位的定義為:在一定溫度和ph值條件下,1min水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸為1個酶活力單位,以u/g(u,ml)表示51.酶活力計算公式:酶活力(u/g)=a?k?v?凡/(t?m).式中:a樣品的吸光度值;k_吸光常數(shù);反應(yīng)試劑的總體積;,廣一酶液的稀釋倍數(shù),n=l;卜一反應(yīng)時間,t取10min;m酶質(zhì)量,g.2結(jié)果與討論2.1蛋白含量曲線的繪制用bradford法測定5

10、支試管中的木瓜蛋白酶的吸光度值,并以木瓜蛋白酶濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線,可溶性蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.0246蛋白酶濃度mg/ml圖1可溶性蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線由所測數(shù)據(jù)得可溶性蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.2129x+0.0123,r=0.9996,則測得各酶液的a后可由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得酶液中木瓜蛋白酶的蛋白含量,從而代人公式算得各個酶活.2.2茶多酚與木瓜蛋白酶絡(luò)合反應(yīng)最佳條件的選擇本研究采用的boxbehnken設(shè)計法是國際上較為常用的一種響應(yīng)曲面法(responsesulfaeemethodology,rsm)61.在實驗中分別從4因素(溫度,ph值,反應(yīng)時間,茶多酚與木瓜蛋白

11、酶質(zhì)量比)3水平中優(yōu)選出茶多酚與木瓜蛋白酶絡(luò)合反應(yīng)的最佳條件.以酶活回收率為目標(biāo),通過測定反應(yīng)后木瓜蛋白酶液的吸光度值,計算各酶液的酶活和蛋白含量,從而計算出茶多酚對木瓜蛋白酶的回收率.經(jīng)過響應(yīng)面模型的建立,顯著性檢驗,優(yōu)化和驗證,最終選擇溫度最佳值為4cc,ph值最佳條件為6.0.隨著溫度升高和ph值的增大,酶活回收率明顯下降.保溫時間對酶活回收率的影響不是極其顯著,茶多酚與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比在2:1時,考察指標(biāo)的實測值較高,在模型檢驗中其平方項表現(xiàn)為顯著.絡(luò)合的最佳反應(yīng)時間是3.5h.2.3游離木瓜蛋白酶與rip一木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性比較在較高溫度下,測定游離木瓜蛋白酶與rip絡(luò)合后的木瓜

12、蛋白酶活性隨時間變化的情況.實驗條件為60cc,每隔30min測定一次酶活力,用紫外光譜法在275nm下測酶液的吸光度a值.實驗以6occ條件下加熱時間為橫坐標(biāo),以游離木瓜蛋白酶和tp一木瓜蛋白酶殘留的相對活力為縱坐標(biāo)作圖,60下兩種酶的熱失活曲線見圖2.實驗發(fā)現(xiàn),隨著受熱時間的增加,木瓜蛋白酶的活性明顯降低,從總的曲線趨勢來看,tp絡(luò)合后的木瓜蛋白酶活性降低的速率較游離木瓜蛋白酶變慢.又以加熱時間為橫坐標(biāo),酶的相對活力的對數(shù)值為縱坐標(biāo)作熱失活動力學(xué)曲線,60cc下兩種酶的熱失活動力學(xué)曲線見圖3.妲莨鼬謠加熱時間t/min一一游離木瓜蛋白酶;_1.r_一rp一木瓜蛋白酶圖26o下兩種酶的熱失活

13、曲線茶多酚對木瓜蛋白酶的熱失活具有一定的抑制作用,經(jīng)過絡(luò)合反應(yīng)木瓜蛋白酶的熱失活速率有明顯的降低,即變性速率減小,半衰期增長.而60下兩種酶的熱失活動力學(xué)曲線表示兩種酶隨加熱時間殘留的相對酶活呈線性降低的趨勢,游離木瓜蛋白酶的熱失活曲線為y一0.0243x+4.772,tp一木瓜蛋白酶的熱失活曲線為,一0.0097x+4.558.計算得酶的熱失活速率常數(shù)游離木瓜蛋白酶為1.025min,tp一木瓜蛋白酶為1.010min.其原因可以用茶多酚的抗氧化性質(zhì)來解釋:茶多酚的高效抗氧化性作用于木瓜蛋白2006年第lo期陳曉燕,等:茶多酚對木瓜蛋白酶的絡(luò)合作用及特性的影響酶;木瓜蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)中具有潘

14、i生的是一個游離的巰基和兩個二硫鍵,兩者任意一個被破壞都會引起酶活力的喪失.而巰基很容易被氧化從而導(dǎo)致木瓜蛋白酶在室溫或更高的溫度下易變性失活,絡(luò)合反應(yīng)后酶的抗氧化性增強將使酶穩(wěn)定性得到改善.7娌謐葉:蠱圈謐0501013150加熱時間tlmin一一游離木瓜蛋白酶;-.r_一tp一木瓜蛋白酶圖360下兩種酶的熱失活動力學(xué)曲線2.4熱處理對木瓜蛋白酶巰基含量的影響巰基的摩爾濃度co=a.一141503(稀釋倍數(shù)).用dtnb法每隔30rain測定酶活,計算公式處理原始數(shù)據(jù)(吸光度值),得到巰基含量.實驗結(jié)果表明,通過60熱處理,隨著熱處理時間的增加,木瓜蛋白酶的活性及巰基含量逐步減少.熱處理對p

15、apain巰基含量的影響曲線見圖4,熱處理對papain活性的影響曲線見圖5,由圖4和圖5比較得到酶熱失活與巰基含量的變化具有相同的趨勢,此結(jié)果證明了木瓜蛋白酶活性部位即為其殘留巰基.穹2i咖加=回1o2o4j0608o100l2ol4o加熱時間t/rain圖4熱處理對papain巰基含量的影響曲線2.5茶多酚,11p一木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶抗氧化性比較采用鄰苯三酚/d1tr終止法81測得茶多酚,tp一木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶對鄰苯三酚的自氧化均有抑制作用,每隔0.5min讀一次a值,連續(xù)記錄3min,做線性分析得到鄰苯三酚的自氧化率a.,as口,a和a距,再計算樣品對鄰苯三酚的抑制率,鄰苯三酚

16、自氧化速率測定見表1.抑制率=0一as)/a0100%.掣擺雜譬圈謐002040608o100120140加熱時間t/min圖5熱處理對papain活性的影響曲線表1鄰苯三酚自氧化速率測定游離蛋白酶抗氧化性較弱,在常溫或某些物理化學(xué)條件下就容易被氧化而變性.而絡(luò)合后的酶抗氧化性有明顯的提高.這與本文2-3提到的木瓜蛋白酶穩(wěn)定性提高原因相吻合.其原因可能是茶多酚與酶絡(luò)合后,酶活性中心的巰基部分受到茶多酚的抗氧化性保護(hù),即使在高溫環(huán)境下酶的氧化過程也有被延緩的現(xiàn)象,所以其穩(wěn)定性也得到提高.2.6茶多酚和11p一木瓜蛋白酶中兒茶素單體的hplc定性分析實驗用waters高效液相色譜儀分析茶多酚及tp

17、一木瓜蛋白酶樣品,色譜分離條件為:色譜分析柱:symmetryc18(5um15em);2996型二極管陣列檢測器;檢測波長=280nm;流動相為重蒸水/乙睛/乙酸乙酯=86/12/2(體積比);流速為1.0ml/min;auf=3.091.經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),茶多酚中主要的4種兒茶素單體,分別為表兒茶素(順式)ec,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(順式)egcg,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(反式)gcg,表兒茶素沒食子酸酯(順式)ecg,茶多酚的hplc分析圖見圖6.經(jīng)檢測并與茶多酚的分析圖比較發(fā)現(xiàn),tp一木瓜蛋白酶中含有3種兒茶素單體,但是各個組分的含量已經(jīng)大大減少,其中以egcg含量最高,tp一木瓜蛋白

18、酶的hplc分析圖見圖7.因為egcg是酯型兒茶加舳加65432lom%2222222lllll?8o?農(nóng)產(chǎn)品加工?學(xué)刊2006年第lo期素,其分子中有2個能與酶蛋白絡(luò)合作用的活性基團(tuán):一個是醅?；?另一個是羥苯基.由于這些活性基團(tuán),使兒茶素能以氫鍵的形式與酶蛋白絡(luò)合,從而形成渾濁和沉淀ll01.3種單體的抗氧化性能力,以強至弱順序為egcg>ecg>ec,因此作為抗氧化性最強的兒茶素單體,egcg與木瓜蛋白酶的結(jié)合最多,使酶抗氧化性大大增強,這與其熱穩(wěn)定性提高也相吻合.2.502.001.501.0o0.50o.0o0.030o.o2oo.oloo.0()oegcg一4.820g

19、cg一5.930egc一11.339ec一3.5o0_lll上j上j2.0o4.0o6.0o8.0olo.0ol2.0o圖6茶多酚的hplc分析圖ij.,2.004.006.008.0010.0ol2.0ol4.0o圖7tp一木瓜蛋白酶的hplc分析圖3前景展望(1)隨著木瓜蛋白酶制品應(yīng)用范圍的不斷擴大,其穩(wěn)定性也需要大大提高,在此方面,茶多酚的添加使之成為絡(luò)合物,能提高該酶的熱穩(wěn)定陛.首先,茶請讀者作者為本刊薦言農(nóng)產(chǎn)品加工?學(xué)刊創(chuàng)辦1年多來,在廣大讀者和作者的關(guān)懷與支持下,執(zhí)為廣大讀者作者服務(wù)之誠,行創(chuàng)辦精品科技期刊之本,越來越受到行業(yè)的關(guān)注,讀者群越來越廣,期刊的發(fā)展正在步/x,if_軌.

20、為了進(jìn)一步提高刊物質(zhì)量和擴大社會影響,懇請您百忙之中抽暇為本刊工作提出寶貴意見.1.本刊欄目設(shè)置是否合理,有哪些欄目不妥,您建議增加什么欄目.2.編輯,排版,校對有哪些問題,請列出您發(fā)現(xiàn)的差錯.3.能否及時收到刊物,對本刊的各項服務(wù)工作有什么意見.4.您有意為本刊投稿嗎?近期有什么撰稿計劃.5與本刊有哪些合作意向,對本刊工作有哪些要求和建議.農(nóng)產(chǎn)品jjnt?學(xué)刊編輯部多酚因其具有較強的抗氧化性,可以針對該酶在室溫甚至高溫下易被氧化這一缺點,增強其抗氧化性,延緩木瓜蛋白酶活性中心的氧化過程.(2)茶多酚是從茶葉中提取的天然產(chǎn)物,使回收后的木瓜蛋白酶能保持其天然的特性,應(yīng)用范圍得到擴展.今后可以在本實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入的應(yīng)用研究,對回收后的酶加以實際應(yīng)用,如做成嫩肉粉】,能增加肉質(zhì)的嫩度,并能起到肉制品的保鮮作用.參考文獻(xiàn):黃圣基,萬青.茶多酚的制備及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用【j1.食品研究與開發(fā),1996,17(1):2528.周春暉.豆類抗酶因子鈍化及木瓜蛋白酶的tp絡(luò)合穩(wěn)定化研究【d】.廣州:華南理工大學(xué),2002.李娟,張耀庭,等.應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量【j1.中國生物制品學(xué)雜志,2000,13(2):118120.張寒俊,劉大川,楊國燕.紫外光譜法定量測定不同種蛋白酶活力的研究