2015年上海交通大學(xué)《酶標(biāo)、酶標(biāo)儀、洗板機》生物技術(shù)課ppt課件

1、ELISAELISA、酶標(biāo)儀、洗板機、酶標(biāo)儀、洗板機 趙文娟趙文娟 上海交通大學(xué)藥學(xué)院上海交通大學(xué)藥學(xué)院 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 酶標(biāo)（酶標(biāo)（ELISA） ELISAELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-( Enzyme- Linked ImmunosorbnentLinked Immunosorbnent Assay ) Assay )的簡稱。的簡稱。 以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特 異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié) 合起來的一種敏

2、感性很高的試驗技術(shù)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù) 自上世紀(jì)自上世紀(jì)7070年代初問世以來，發(fā)展十分迅年代初問世以來，發(fā)展十分迅 速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué) 的許多領(lǐng)域。的許多領(lǐng)域。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 1.ELISA的原理的原理 2.ELISA的類型的類型 3.試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結(jié)合物結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備酶底物的準(zhǔn)備 4.對照設(shè)定對照設(shè)定 5.標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存 6.結(jié)果判斷結(jié)果判斷 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 ELIS

3、A ELISA是一種免疫測定（是一種免疫測定（immunoassayimmunoassay，IAIA） ?；A(chǔ)?；A(chǔ): : 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng) 的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本 中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。 1.ELISA的原理的原理 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 ELISA技術(shù)原理技術(shù)原理 1. 1. 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)

4、記。抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 2. 2. 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活 性。性。 3. 3. 酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶 的活性。的活性。 4. 4. 受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加 入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體 上。上。 5. 5. 此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定

5、的比 例。例。 6. 6. 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物， 產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈 色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏 感度（感度（pg-ngpg-ng/ml/ml水平），并且重復(fù)性好。水平），并且重復(fù)性好。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 1.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)抗

6、原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài) 平衡，其反應(yīng)式為：平衡，其反應(yīng)式為： Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表示：表示： K=AgK=AgAbAbAgAbAgAb ,Ag ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有關(guān)。值有關(guān)。高親高親 和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常 適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均解離后的抗原或抗體均 能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。能保持原有的

7、結(jié)構(gòu)和活性。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點 之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 1.1.31.1.3最適比例最適比例 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 1.1.41.1.

8、4敏感性敏感性 化學(xué)比色法的敏感度為化學(xué)比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平 酶反應(yīng)測定法的敏感度約為酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml 免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ngng/ml/ml水平水平 例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達(dá)，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml0.1ng/ml。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 2 2ELISAELISA的類型的類型 ELISAELISA可用于測定

9、抗原，也可用于測定抗體。在這種測定可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定 方法中有三個必要的試劑：方法中有三個必要的試劑： （1 1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）； （2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物結(jié)合物 （conjugateconjugate）； （3 3）酶反應(yīng)的底物。）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法?？稍O(shè)計出各種不同類型的檢測方法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原

10、 此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、 HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可 用于用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結(jié)合物酶結(jié)合物而建立此法。而建立此法。 樣品（抗原）樣品（抗原）酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體 底物底物 酶標(biāo)儀測定酶標(biāo)儀測定OD值值終止終止 液液 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此

11、法中受檢 標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于 間接法。乙肝標(biāo)志物中抗間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAgHBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)的檢測常采用本法。本法關(guān) 鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合 適的標(biāo)記方法。適的標(biāo)記方法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 3. ELISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) ) ELISAELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的中有三個必要的試劑：

12、免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的 底物。底物。 （1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；A （2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； B （3 3）酶的底物；）酶的底物； C （4 4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6 6）洗滌液；）洗滌液； （7 7）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 3.1 ELISA3.1 ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備 A

13、A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或 蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度吸附性能好，空白值低，孔底透明度 高高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。性能相近。 將抗原或抗體固定在過程稱為將抗原或抗體固定在過程稱為包被包被(coating(coating) )。 封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋

14、白質(zhì)溶液再是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再 包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙， 從而排斥從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ; 脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價廉，可以高濃度使用（比較價廉，可以高濃度使用（5%5%）。）。 洗滌液：洗滌液：在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀釋液為含中，常用的稀釋液為含0.05%0.05

15、%吐溫吐溫2020磷磷 酸鹽緩沖液。酸鹽緩沖液。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 3.2 ELISA3.2 ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備 B B 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關(guān)鍵的試劑中關(guān)鍵的試劑 1. 1. 酶的催化活性酶的催化活性 2. 2. 抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3. 3. 含有或少含有游離的抗體（或抗原）含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4. 4. 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本

16、 結(jié)果結(jié)果 酶酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價 格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉 ，有色產(chǎn)物易于測定等。，有色產(chǎn)物易于測定等。 在在ELISAELISA中，中，HRPHRP（辣根過氧化物酶），（辣根過氧化物酶），APAP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧（堿性磷酸酶），葡萄糖氧 化酶，化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。 HRPHRP是一

17、種糖蛋白，含糖量約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%18%，分子量為，分子量為4400044000，是一種復(fù)合酶，由，是一種復(fù)合酶，由 主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時所用制備結(jié)合物時所用純度較高的純度較高的IgGIgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白 的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免 疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在疫

18、活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISAELISA中中 用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度抗原必須是高純度的。的。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 3.3 3.3 試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備 C C 酶的底物酶的底物 DHDH2 2+ H+ H2 2O O2 2 D+ 2H D+ 2H2 2O O DH DH2 2為供氧體，為供氧體， H H2 2O O2 2為受氫體。為受氫體。 DHDH2 2一般為無色化合物，經(jīng)一般為無色化合物，經(jīng) 酶作用后成為有色的產(chǎn)物。酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DHDH2 2如

19、：如：鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTSABTS 。 OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm492nm處有最高吸處有最高吸 收峰，靈敏度高，比色方便，是收峰，靈敏度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)合物最常用的底物。結(jié)合物最常用的底物。 TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只 需與需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止

20、后，TMBTMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可 在比色計中定量，最適吸收波長為在比色計中定量，最適吸收波長為450nm450nm。 ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 E 3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物 HRP HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于對氫受體的專一性很高，僅作用于H H2 2O O2 2、小分醇的過氧、小分醇的過氧 化物和尿素過氧化物化物和尿素過氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備

21、準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 AP AP的底物為磷酸酯酶，一般采用的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯對硝基苯磷酸酯作為作為 底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm405nm波長處有吸收波長處有吸收 峰。用峰。用NaOHNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。APAP也有也有 發(fā)發(fā)熒光底物（磷酸熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮），甲基傘酮），可用于可用于ELISAELISA作熒光作熒光 測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 3.3.2 AP的底物的底物 3.3.3 酶反應(yīng)終止液酶反應(yīng)

22、終止液 常用的常用的HRPHRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比 色液的最終體積而異，在板式色液的最終體積而異，在板式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 3.4 3.4 對照設(shè)定對照設(shè)定 陽性對照品陽性對照品(positive control)(positive control)和陰性對照品和陰性對照品(negative (negative control)control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)

23、果 的對照。的對照。 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含 蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物 質(zhì)的量。質(zhì)的量。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品

24、，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-54-5個個 濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中. . 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢測的陰檢測的陰 性對照品中不可含性對照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 酶標(biāo)基本步驟酶標(biāo)基本步驟 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: : 1. 1. 包被：包被：

25、用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含 量為110gml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過夜。 次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌， 下同)。 2. 2. 加樣：加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中， 置37孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性 對照孔)。 3. 3. 加酶標(biāo)抗體：加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定 后的稀釋度)0.1ml。37孵育0.51小時，洗滌。 4. 4. 加底物液顯色：加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液 0.1ml 37103

26、0分鐘。 5. 5. 終止反應(yīng)：終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 6. 結(jié)果判定：結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi) 顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色 的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELX808酶標(biāo) 儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后 測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 加樣加樣 在在ELISAELISA

27、中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合 物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避板孔的底部，避 免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 基本操作注意事項：基本操作注意事項： 基本操作：基本操作： 加樣；加樣； 溫育；溫育； 洗滌；洗滌； 讀板；讀板； 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 溫育溫育 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)(incubatio

28、n)。 溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）（冰箱溫度） 等。等。3737是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體 結(jié)合的合適溫度。結(jié)合的合適溫度。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 洗滌洗滌 洗滌在洗滌在ELISAELISA過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定 實驗成敗的關(guān)鍵。實驗成敗的關(guān)鍵。 目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié) 合的物質(zhì)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物

29、質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì) 洗滌步驟：洗滌步驟： 1. 1. 吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；吸干孔內(nèi)反應(yīng)液； 2. 2. 將洗滌液注滿板孔；將洗滌液注滿板孔； 3. 3. 放置放置2min2min，略作搖動；，略作搖動； 4. 4. 吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌 的次數(shù)一般為的次數(shù)一般為3 34 4次，有時甚至需洗次，有時甚至需洗5 56 6次。次。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 洗板機洗板機 手工洗滌流速較難控制，步驟繁瑣且耗費時間，目前市手工洗滌流速較難控制，步驟繁瑣且耗費時間

30、，目前市 面上多種洗板機可供選擇，其中以美國寶特的面上多種洗板機可供選擇，其中以美國寶特的BIO-TEK BIO-TEK ELX50 ELX50 洗板機最為突出洗板機最為突出 洗板機優(yōu)勢：洗板機優(yōu)勢： 自動化控制自動化控制 精確度高精確度高 速度快（最快小于速度快（最快小于20S20S每板每板/ /每循環(huán)）每循環(huán)） 細(xì)胞包被層細(xì)胞包被層 ELx50ELx50洗滌洗滌 速度可調(diào)、角度最佳速度可調(diào)、角度最佳 手工洗滌或一般機器洗滌手工洗滌或一般機器洗滌 角度不好，速度太快角度不好，速度太快 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 洗板機使用注意事項 1 1、 有一定地

31、洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效有一定地洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效 果，一般不超過果，一般不超過6 6次。次。 2 2、 注意每孔的加液量：以加滿為宜，但不可溢出，注意每孔的加液量：以加滿為宜，但不可溢出， 一般為每控一般為每控300300微升。微升。 3 3、 建議在洗滌前進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部，建議在洗滌前進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部， 以降低殘留量。因為一般以降低殘留量。因為一般ELISAELISA實驗洗滌結(jié)束后要求實驗洗滌結(jié)束后要求 扣板，但此步驟在扣板，但此步驟在PCR-ELISAPCR-ELISA中易造成污染，故殘留中易造成污染，故殘留 量應(yīng)盡量減少。不能象一般

32、量應(yīng)盡量減少。不能象一般ELISAELISA操作一樣用力扣板。操作一樣用力扣板。 4 4、 建議用戶采用兩點吸液與底部沖洗方式，以得到建議用戶采用兩點吸液與底部沖洗方式，以得到 好的洗滌效果。好的洗滌效果。 5 5、 如果作如果作PCR-ELISAPCR-ELISA液罐應(yīng)加有液罐應(yīng)加有1%1%次氯酸鈉，加入次氯酸鈉，加入 的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。每天使用完畢后應(yīng)用的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。每天使用完畢后應(yīng)用1%1% 次氯酸鈉沖洗管路及清洗頭，然后用雙蒸水沖洗管路。次氯酸鈉沖洗管路及清洗頭，然后用雙蒸水沖洗管路。 6 6、 定期維護、檢修儀器及配件。定期維護、檢修儀器及配件。 原理原理 類型類

33、型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 洗板機的應(yīng)用范圍洗板機的應(yīng)用范圍 所有涉及到所有涉及到9696孔板換液、孵育、洗滌的實驗：孔板換液、孵育、洗滌的實驗： ELISAELISA 熒光熒光ELISAELISA 細(xì)胞洗滌細(xì)胞洗滌 In Cell WesternIn Cell Western 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 顯色顯色 顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。 反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保

34、 持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速 顯色進(jìn)行。顯色進(jìn)行。 比色比色/ /讀板讀板 將將9696孔板正確放入酶標(biāo)比色儀中，以蒸餾水校零點，測讀底物孔（孔板正確放入酶標(biāo)比色儀中，以蒸餾水校零點，測讀底物孔（ 未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo) 本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸 餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度

35、，然后進(jìn)行計算餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算 。 結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplicaloplical density density，OD/OD/吸光度（吸光度（absorbenceabsorbence，A A）表）表 示，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于示，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A A字母的右下字母的右下 角，如角，如OPDOPD的吸收波長為的吸收波長為492nm492nm，表示方法為，表示方法為A492nmA492nm或或OD492nmOD492nm。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)

36、果結(jié)果 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀ELISAELISA光度計。光度計。 美國寶特美國寶特BioTek ELX800 全自動酶標(biāo)儀全自動酶標(biāo)儀 鍵盤格式 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 酶標(biāo)儀的檢測原理酶標(biāo)儀的檢測原理 酶標(biāo)儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸酶標(biāo)儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸 光值。光值。 檢測單位：檢測單位： 光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能 量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量

37、 關(guān)系關(guān)系。 檢測單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的 縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD1og（1trans）， 其中trans為檢測物的透光值。 在特定波長下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長在特定波長下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長 下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就 會造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特在測定檢測物時，我們選擇特 定的波長進(jìn)行檢測，稱為測量波長定的波長進(jìn)行檢測，稱為測量波長。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 酶標(biāo)儀配件酶標(biāo)儀配件 光源：光源： 氙

38、閃燈（波譜寬、低熱輻射、壽命長，但是可見氙閃燈（波譜寬、低熱輻射、壽命長，但是可見 區(qū)能量低）區(qū)能量低） 鹵素?zé)簦ú荒苡糜谧贤鈪^(qū)，可見區(qū)能量強鹵素?zé)簦ú荒苡糜谧贤鈪^(qū)，可見區(qū)能量強） ELx800光源： 鹵鎢燈光源 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 酶標(biāo)儀配件酶標(biāo)儀配件 濾光片和單色器：濾光片和單色器： 濾光片和單色器各有優(yōu)缺點，選擇濾光片還是單色器和具體的實濾光片和單色器各有優(yōu)缺點，選擇濾光片還是單色器和具體的實 驗要求有關(guān)。驗要求有關(guān)。 光吸收光吸收ELISA： 單色器優(yōu)于濾光片，由于鹵素?zé)艄鈴姶?，兩者的靈敏度不相上下，單色器優(yōu)于濾光片，由于鹵素?zé)艄鈴姶螅?/p>

39、兩者的靈敏度不相上下， 單色器更為靈活、方便使用。單色器更為靈活、方便使用。 熒光檢測熒光檢測ELISA 各有優(yōu)缺點，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特各有優(yōu)缺點，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特 異性好、靈敏度高，但靈活性不足。一般異性好、靈敏度高，但靈活性不足。一般ELISA都是使用常用的都是使用常用的 熒光素，對科研工作者來講濾光片較好。熒光素，對科研工作者來講濾光片較好。ELx800 標(biāo)配濾光片 405, 450, 490, 630 nm 連續(xù)波長(采用單色器) 原理原理 類型類型 試劑試劑 準(zhǔn)備準(zhǔn)備 對照對照 標(biāo)本標(biāo)本 結(jié)果結(jié)果 MD MD 公司：公司：業(yè)界老大，產(chǎn)品質(zhì)量過硬，做工精 細(xì)。但對中國支持服務(wù)較差、管理混亂。 BioBioTekTek 公司：公司