補(bǔ)腎活血化瘀方上調(diào)雄激素致不孕大鼠脂肪組織中胰島素受體底物1及其酪氨酸磷?；?20210306005147)

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減補(bǔ)腎活血化瘀方上調(diào)雄激素致不孕大鼠脂肪組織中胰島素受體底物1及其酪氨!1!酸磷酰化U!1!(作者：?jiǎn)挝唬亨]編：)作者：李喜蓮，王針織，俞超芹【摘要】研究雄激素致不孕大鼠(androgen sterilized rat, ASR )胰 島素受體底物1的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度，探討胰島素抵抗(i nsulin resista nee, IR )的分子機(jī)制和補(bǔ)腎活血化瘀方的作用機(jī)制。 方法：ASR大鼠隨機(jī)分為模型組、溶媒組(注射中性茶油)和補(bǔ)腎活血 化瘀方組，各組均為15只大鼠。觀察大鼠體質(zhì)量和胰島素曲線下面積， 并檢測(cè)大鼠脂肪組織中胰島素受體底物1 (in s

2、ulin receptorsubstrate1, IRS1 )的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度。結(jié)果：模型組大 鼠體質(zhì)量和胰島素曲線下面積高于溶媒組和補(bǔ)腎活血化瘀方組(P0.05)。模型組脂肪組織中IRSH及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒 組(P0.05),補(bǔ)腎活血化瘀方組IRS1的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度上 升，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05 ) o結(jié)論：補(bǔ)腎活血化瘀方能促進(jìn)IR大鼠脂肪組織IRS 1蛋白的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化水平，這可 能是其提高組織對(duì)胰島素敏感性從而改善IR的機(jī)制之一。【關(guān)鍵詞】多囊卵巢綜合征；胰島素抵抗；胰島素受體底物1;酪 氨酸；磷酰化；大鼠Objective: To i

3、nvestigate the expression of insulin receptor substrate 1 (IRS1) and phosphorylation of tyrosine in androgen sterilized rats (ASRs) and the effects of Bushen Huoxue Huayu Recipe (BHHR), a compo und Chin ese herbal medici ne for tonifying kidney and activating blood, on the ASRs, and to analyze the p

4、ossible mechanism.Methods: ASR models were established by means of testoster one injected subcuta neously at the age of 9 days. The model rats were randomly divided into BHHR group (n=15) and untreated group (n=15); the rats in normal group (n=15) were injected with oil. The rats in the BHHR group w

5、ere treated with BHHR for 30 days, and the rats in model group and no rmal group were treated with distilled water for 30 days.Body weight and area under the curve (AUC) of insulin were measured after treatment. Expression of IRS1 and phosphorylation of tyrosine in adipose tissue in ASRs were an aly

6、sed by immuno histochemical method.Results: The body weight and insulin AUC in the untreated group were in creased and more tha n those in the BHHR group and the normal control group (P0.05). Expression of IRS 1 and phosphorylation of tyrosine in normal group were significantly higher than those in

7、the untreated group (P0.05), and those in BHHR group were improved and sig ni fica ntly differe nt from those in the un treated group (P0.05).C on clusi on: BHHR can in crease the expression of IRS 1 and phosphorylation of tyrosine in adipose tissue in IR rats, which may be one of its mechanisms in

8、improving insulin sensitivity of the target tissues.Keywords: polycystic ovary syn drome; in suli n resista nee;insulin receptor substrate I; tyrosine; phosphorylation; rats多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS )是生育年 齡婦女 常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一，臨床上主要表現(xiàn)為閉經(jīng) 月經(jīng)稀發(fā) 不孕、多 囊卵巢 高雄激素血癥和持續(xù)不排卵，其發(fā)病機(jī)制不明。近 來(lái)研究發(fā) 現(xiàn)，胰島素抵抗(in su

9、lin resista nee, IR )在PCOS的發(fā)病中起重要作用 1 o 胰島素受體底物 1 (insulin receptor substrate I, IRSjl)作為胰島 素受體后信號(hào)重要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，在PCOS合并IR患者發(fā)病中起關(guān)鍵作用。因PCOS發(fā)病原因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣化，目 前尚無(wú)治療該綜合征的特效藥。中藥補(bǔ)腎活血化瘀方(BushenHuoxue Huayu Recipe, BHHR )為臨床經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)PCOS有良好的 療效2 o王莉等3觀察到雄激素致不孕大鼠(androgen sterilized rat, ASR)成年后具有高雄激素、高胰島素、低促性腺激素、無(wú)排 卵和

10、多囊卵 巢等表現(xiàn)，與PCOS有許多共同點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立ASR大鼠模型，檢 測(cè)大鼠脂肪組織中IRS I的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化的程 度，分析BHHR 對(duì)ASR大鼠IRS”蛋白表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度的影響，以期闡明其治 療PCOS的可能分子生物學(xué)作用機(jī)制。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只3月齡雌性成年SD大鼠和8只3月齡雄性成年SD大鼠由上 海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK （滬）2003_0003,由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)。合籠飼養(yǎng)4 分娩8 d后選出雌性幼鼠105只用于實(shí)驗(yàn)。1.2藥品和試劑丙酸睪酮注射液 中性茶油（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)050503 ） ;

11、 BHHR （當(dāng)歸15 g、赤芍10 g、白芍10 g、桑植20g、枸杞子20 g、瓦楞子15 g、制首烏18 g、麥冬12 g等）由第二軍醫(yī) 大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中藥房提供，自制成濃度相當(dāng)于含生藥2.56 g/ml的水溶 液，制備方法見(jiàn)前期報(bào)道4；大鼠胰島素試劑盒（美國(guó)LINCO Research ）;兔抗鼠IRS1單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；兔 抗鼠磷酸酪氨酸多克隆抗體（美國(guó)Thermo公司）；EnVision試劑盒（美國(guó)DaKo公司）；顯色劑二氨基聯(lián)苯胺（北京中山生物技術(shù)公司）。1.3 ASR動(dòng)物模型制備及分組模型建立方法同前期報(bào)道4,并予中性茶油注射作為溶媒對(duì)照組。模型組中制模

12、成功的30只大鼠進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剔除60只仍有性周期的大鼠。將成模的30只ASR隨機(jī)分為BHHR組和模 型 組，每組15只。溶媒對(duì)照組大鼠15只，70日齡后連續(xù)陰道脫落細(xì)胞涂 片呈現(xiàn)動(dòng)情周期。各組大鼠在接受處理前體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.4給藥方式及劑量各組大鼠斷奶后均喂以顆粒飼料，80日齡起，按動(dòng)物與人體表 比 換算法換算相應(yīng)劑量，BHHR組灌服BHHR10ml/(kg d)；模型組 及溶媒 對(duì)照組每天灌服同容積蒸f留水。每天早、晚各1次，連續(xù)30 do1.5 ASR大鼠胰島素曲線下面積測(cè)定用藥結(jié)束后參考大鼠性周期取材：有規(guī)律性周期的大鼠于110日齡后第一個(gè)動(dòng)情前期取材；無(wú)規(guī)律性周期的大鼠于

13、 113 H齡取材。 將大鼠稱取體質(zhì)量，當(dāng)晚8點(diǎn)禁食，次日上午8點(diǎn)予50%葡萄糖溶液3 g/kg灌胃，在灌胃后0、0.5、1和2 h分別取眶靜脈血，利用放 射免疫 法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平。藥盒質(zhì)量控制指標(biāo)均符合要求，靈敏度0.1 ng/ml,批內(nèi)和批間變異系數(shù)5.5%。測(cè)定步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，計(jì)算 大鼠血胰島素曲線下面積(area under the curve, AUC )。大鼠血胰島素 AUC = 1/4 X 空腹值+3/4 00 min 值 + 1/2 X120 min 值。16各組大鼠IRS1及其酪氨酸磷酸化程度測(cè)定處死各組大鼠后，取腹膜下脂肪組織，4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片

14、，將標(biāo)本置于58 C恒溫干燥箱中烘烤24 h后，分別用兔抗鼠IRS 1單克隆抗體、兔抗鼠磷酸酪氨酸多克隆抗體按EnVision法進(jìn)行免疫組化染色。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，細(xì)胞質(zhì)或（和）細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒反應(yīng)者為陽(yáng)性，無(wú)棕黃色顆粒反應(yīng)者為 陰性。采用上海求為生物科技有限公司MIQAS醫(yī)學(xué)圖像定量分析系 統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像定量分析軟件進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果分析，計(jì)算陽(yáng)性區(qū) 域面積陽(yáng)性比率和光密度值。IRSI表達(dá)及其酪氨酸磷酸化均以免疫組 化陽(yáng)性指數(shù)表示。免疫組化陽(yáng)性指數(shù)邙日性面積X光密度值/總面積。每 張切片分析3個(gè)視野，每組數(shù)據(jù)至少18個(gè)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

15、計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x士s表示， 采用單因素方差分析（q檢驗(yàn)），各組之間方差齊者用最小顯著差異t檢 驗(yàn)。相關(guān)數(shù)據(jù)分別采用非參數(shù)符號(hào)等級(jí)檢驗(yàn)（Wilcoxon檢驗(yàn)）及非參數(shù) 兩樣本等級(jí)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料進(jìn)行X2檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1各組大鼠體質(zhì)量情況模型組大鼠體質(zhì)量高于溶媒對(duì)照組（P0.05 ） ; BHHR組大鼠體質(zhì) 量與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05） o見(jiàn)表1。表1 3組大鼠 體質(zhì)量和血胰島素曲線下面積（略）2.2各組大鼠胰島素曲線下面積模型組大鼠血胰島素曲線下面積大于溶媒對(duì)照組（P0.05 ）;BHHR組血胰島素曲線下面積與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05 ) o 見(jiàn)表 1023

16、各組大鼠IRS1的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度模型組IRSh表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒對(duì)照組(P0.05), BHHR組IRS 1表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度上升，與模 型 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05 ) o見(jiàn)表2和圖1、20表2各組 大鼠 IRS 1及其酪氨酸磷酸化情況(略)3討論3.1 IR 與 PCOS多年來(lái)下丘腦垂體一卵巢生殖功能異常一直被認(rèn)為是PCOS主要的病理基礎(chǔ)。自1980年Burghen等5首次提出IR參與PCOS的 發(fā)病后，對(duì)PCOS的本質(zhì)及其發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，越來(lái)越多的學(xué)者 認(rèn)為，IR及高胰島素血癥(hyperinsulinism, HI)不僅是PCOS的另一重要

17、 生化特征，而且可能是PCOS發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)6。IR是亞細(xì) 胞 細(xì)胞、組織或機(jī)體的一種病理生理狀態(tài)，即外周組織器官對(duì)胰島素 的敏感性降低、受損或喪失而產(chǎn)生的一系列生理變化和臨床表現(xiàn)。機(jī)體 為維持正常的血糖，代償性增加胰島素的分泌，導(dǎo)致HloHI朿嗷卵巢和 腎上腺的細(xì)胞色素p450 17 a酶mRNA的表達(dá)而使 雄激素合成增多， p450 17 a酶具有17輕化酶和17、20裂解酶的雙 重活性，使卵巢分泌 的睪酮增多和腎上腺分泌的硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate, DHEA s)增多7。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)多的雄激素可使動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞死亡，并可引起人黃

18、體細(xì)胞缺陷,同時(shí)保留了卵巢對(duì)黃體生成素(lutei nizi ng hormo ne, LH )的高反 應(yīng)性8;而高黃體生成素(HLH)又可促進(jìn)卵巢產(chǎn)生過(guò)多雄激素并在外 周組織經(jīng)芳香化酶的作用，轉(zhuǎn)化為雌酮，持續(xù)作用于下丘腦和垂體，對(duì) LH分泌呈正反饋而對(duì)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH )分 泌呈負(fù)反饋，加強(qiáng)并維持HLH作用，導(dǎo)致PCOS持續(xù)性無(wú)排卵和高雄激 素(hypera ndroge nism, HA)血癥。本研究 結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清雄激 素 各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平、胰島素曲線下面積均明顯高于溶媒對(duì)照組， 提示PCOS發(fā)生IR時(shí)，機(jī)體為維持正

19、常的血糖水平，代償性分泌較多 胰島素而出現(xiàn)IR,最終導(dǎo)致HA,而HA又可加重IR,兩者形成惡性循 環(huán)。3.2 IRS1 與 IR目前IR的確切機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為其主要原因是胰島素受體 后信號(hào)傳導(dǎo)障礙90 IRS1有胰島素細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的“船塢”蛋白之 稱，在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用10胰島素與其受體a亞 基結(jié)合后，在使B亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化的同時(shí)，使IRS”的多個(gè) 酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy linositol 3 kinase, PI3 _K),活化后的 PI3 K 促進(jìn)細(xì)胞 內(nèi) 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體囊泡易位至細(xì)胞膜上，從而促發(fā)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)

20、蛋白4表達(dá)增 多，組織對(duì)葡萄糖的攝取增加。PCOS患者脂肪組織中IRSJ1及其酪氨酸 磷酸化明顯減低，而這種信號(hào)分子的改變，使PI3K的活化受阻，使生 物學(xué)效應(yīng)發(fā)生改變，導(dǎo)致IR的形成11本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè) ASR大鼠脂肪組織中IRS1的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度，發(fā)現(xiàn)兩者均 明顯下降，與溶媒對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，IRS”結(jié)構(gòu)或功能異 ?？赡苁窃斐梢葝u素作用的外周靶組織，特別是肝臟、脂肪及骨骼肌發(fā) 生IR的重要原因，這可能是PCOS IR的發(fā)生機(jī)制之一。3.3 BHHR對(duì)ASR IR的作用由于目前PCOS發(fā)病的確切機(jī)制尚不清楚，患者大多依靠藥物 對(duì) 癥治療，所以臨床取材非常困難，為

21、此尋找一種理想的病理研究模型開(kāi) 展其病因的基礎(chǔ)研究以便指導(dǎo)臨床診斷和治療顯得非常重要。本實(shí)驗(yàn)采用注射丙酸睪丸酮方法建立不孕大鼠模型，觀察BHHR對(duì)大鼠體質(zhì)量和胰島素曲線下面積的影響，從IR大鼠脂肪組織中IRS1的蛋 白表達(dá)及酪氨酸磷酸化水平的角度來(lái)探討其作用機(jī)制。結(jié)果表明，與溶 媒組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量和胰島素曲線下面積及各時(shí)間點(diǎn)胰島素 水平明顯升高，提示本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物模型符合IR的特征和基本要求，是理想的IR動(dòng)物模型。應(yīng)用中藥BHHR干預(yù)后，絕大 部分 大鼠恢復(fù)性周期，且體質(zhì)量、胰島素曲線下面積下降，提示BHHR能有 效改善IR大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，提高胰島素的敏感性。免疫組化結(jié)果 提示

22、，模型組IRS1表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒組(P0.05) , BHHR組IRS1表達(dá)及其酪氨酸磷酸化程度上升，與模型 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05 ) o BHHR能改善脂肪組織中胰島素受體 后信號(hào)傳導(dǎo)異常，其主要作用位點(diǎn)可能在IRS1的蛋白表達(dá)及其酪氨酸磷酸化環(huán)節(jié)。ASR大鼠脂肪組織中IRS1的表達(dá)及其酪氨酸磷酸化減低，可能是 其IR的病理機(jī)制之一。利用BHHR不僅可使ASR大鼠體質(zhì)量減輕，恢復(fù) 性周期，降低血清雄激素和胰島素水平，從而改善IR,而且可以使大鼠 脂肪組織中IRSJ1的表達(dá)量明顯上升，IRS1酪氨酸磷酸化增強(qiáng)，從而提高組織對(duì)胰島素的敏感性，這可能是其改善IR的作用機(jī)制

23、之一O【參考文獻(xiàn)】1 Du naif A, Wu X, Lee A, et al. Defects in in sulin receptor sig nali ng in vivo in the polycystic ovary syn drome (PCOS).Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001; 281 (2): E392E399.2 Wu JH, Yu CQ, Zhou QL, et al. Clinical study on effectof Bushen Huayu Qutan Recipe in treating polycystic ovari

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