核酸探針標(biāo)記

1、 核酸分子探針是指用放射性核素或其他標(biāo)記 物標(biāo)記的、能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互 作用的DNA或RNA片段。 1 基因組DNA探針：病毒DNA等 2 cDNA探針；最常用 3 寡核苷酸探針：10-50bp，測序、點(diǎn)突變 4 RNA探針：穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)，但 RNA極易降解，不宜操作。 理想的標(biāo)記物：敏感度高；特異性強(qiáng)；不影響 探針分子的主要理化特性；標(biāo)記、檢測方法簡 單、探針保存時(shí)間長；對環(huán)境無污染、對人體 無損害；價(jià)格低廉。 一）放射性標(biāo)記物 二）非放射性標(biāo)記物 利用放射性核素能產(chǎn)生射線的特性將核素標(biāo)記 在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通過一 定方法摻入到DNA 或RNA 中去制成

2、探針，與 待測的核酸雜交后，核素產(chǎn)生的或射線可使 底片感光的特性，通過放射自顯影的方法進(jìn)行 檢測。 產(chǎn)生射線的核素：32P、3H、35S 產(chǎn)生射線的核素：125I 1）32P：產(chǎn)生 射線，靈敏度高，分辨率強(qiáng)，是最 常用的放射性標(biāo)記物，但半衰期短（14。3天）： 位和 位標(biāo)記。 2）35S：分辨率高、半衰期長（87。1天）。敏感 度底 O(S) O(S) O(S) O H - P - O - P - O - P - O - C H 2 O 鹼基 O O O H H(OH) 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高：0。01pg 特異性強(qiáng) 缺點(diǎn)：放射性污染 成本高、半衰期短，不能長期保存 1、優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染 成

3、本低、操作簡單 缺點(diǎn)：敏感性、特異性均低于放射性核 素 1）生物素：1-2pg 生物素化核苷酸：bio-16-dUTP bio-11-dUTP 生物素化核苷酸-通過酶觸反應(yīng)摻入到DNA 中去制成探針-雜交-抗生物素蛋白-生物 素-酶的復(fù)合物加底物顯色 光敏生物素：生物素與光敏基團(tuán)結(jié)合-光敏 生物素-光敏生物素與核酸探針混合-在 強(qiáng)光的作用下-光敏基團(tuán)與核酸共價(jià)結(jié)合- 生物素標(biāo)記的 探針 生物素 光敏基團(tuán) Dig-dUTP-通過酶觸反應(yīng)摻入到DNA中去 制成探針-雜交-加抗地高辛-酶的復(fù)合 物加底物顯色 靈敏度較高：0.1pg 特異性較生物素高 是較理想的非放射性標(biāo)記物 （一）缺口翻譯法或切口平

4、移法 （二）隨機(jī)引物法 (三）末端標(biāo)記法 （四）cDNA探針的標(biāo)記 （五）RNA探針的標(biāo)記 限量DNA酶I DNA聚合酶I+ 32P-dNTP 變性 32P部分標(biāo)記的 單連DNA片段 53 35 5-3外切酶和 5-3 內(nèi)切酶 5 3 5 3 5 限量DNase I在待標(biāo)記的雙連DNA的每一條連 上產(chǎn)生若干個(gè)單連缺口 利用E.coli DNA多聚酶I的5-3外切酶的活性 和5-3多聚酶的活性，在缺口處5末端每切除 一個(gè)核苷酸，則在3末端添加一個(gè)核苷酸，以 修補(bǔ)缺口。 隨著缺口在5末端的移動修飾的核苷酸就摻入 到新合成的DNA連中 1）快速、簡便、標(biāo)記的探針均一、特異性高 2）僅適用于較長的雙連

5、DNA 3）DNA多聚酶必須是E。Coli DNA多聚酶的 全酶 4）DNA酶I的濃度一定要適宜 隨機(jī)寡核苷酸引物（random primer)：含有各 種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，可 以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引 物的作用 E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（僅具 有5-3多聚酶的活性，而無外切酶的活性） 變性后的探針DNA或RNA與隨機(jī)引物混合 隨機(jī)引物按堿基互補(bǔ)的原則與模板DNA 的相 應(yīng)區(qū)域結(jié)合 DNA多聚酶I的Klenow大片段即從引物3-OH 端開始合成互補(bǔ)DNA連 反應(yīng)中若加入修飾的dNTP即可獲得標(biāo)記的 DNA探針 5 3 3 雙連 DNA

6、變性 隨機(jī)引物 Klenow大片段 32P-dNTP 3 5 變性 隨機(jī)引物標(biāo)記法 1）不但可用于雙連DNA的標(biāo)記，而且 可用于單連DNA和RNA的標(biāo)記 2）操作簡單 3）標(biāo)記率高 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶法（terminal deoxynucleotide transferase) 5DNA3OH+-32 p-dNTP 5_DNA_3(pdN)n +nPPi (焦磷酸） T4多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase) 末端轉(zhuǎn)移酶 T多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase) 35OH +32P-P-PA(AT

7、P） 532P+PPA T4多核苷酸激酶 （一）缺口翻譯法或切口平移（nick translation） （二）隨機(jī)引物法（randompriming ) (三）末端標(biāo)記法 （四）cDNA探針的標(biāo)記（反轉(zhuǎn)錄制備單 連cDNA探針） （五）RNA探針的標(biāo)記（體外轉(zhuǎn)錄的方法） 基本原理：具有一定同原性的兩條核酸單連在一 定條件下（適當(dāng)?shù)臏囟?、離子強(qiáng)度等），按鹼 基互補(bǔ)的原則，重新形成雙連DNA的過程。 雜交的類型： 液相雜交：核酸電鏡 固相雜交：膜固相印記雜交、組織細(xì)胞原 位雜交、菌落原位雜交 （一）固相支持物的選擇 、硝酸纖維素膜： 在高離子強(qiáng)度下，具有較強(qiáng)的吸附單連 DNA和RNA的能力：80

8、-100ug/cm2 、尼龍膜：在低離子強(qiáng)度下，很強(qiáng)的吸附 單連、雙連的DNA或RNA；350-500ug/cm2 變性 雜交 洗膜 雜交信號的檢測 熱變性：95-100C , 5-10分鐘 堿變性：0.5Mol/L NaOH ,30分鐘 變性的單連DNA按堿基配對的原則，在適當(dāng) 的條件下重新締合形成雙連的過程。 ）離子強(qiáng)度：x SSC ）雜交溫度：雜交反應(yīng)在低于Tm值15- 25 溫度下進(jìn)行 一般，探針長500bp，G+C含量為， 離子強(qiáng)度為x SSC；雜交液中不含甲酰胺， Tm 值為93。4 ，雜交溫度68 ，含甲酰 胺，Tm值為68。4 ，雜交溫度42。4 ）減少非特異性雜交反應(yīng)：預(yù)雜交

9、 離子強(qiáng)度：0.1x SCC 洗膜溫度：低于 Tm值 5-12 C 。 探針長500bp， G+C含量 42%,離子強(qiáng)度 0.1xSSC, 不含甲跣胺， Tm值為67 ，則洗 膜溫度為55-62 . ）放射性核素探針的檢測：放射自顯影 ）非放射性核素探針的檢測 地高辛標(biāo)記探針的檢測 生物素標(biāo)記探針的檢測 抗地高辛抗體堿性磷酸酶復(fù)合物 底物（BCIP+NBT) 紫色的不 溶性化合 物 過氧化物酶 底物 （ ） 抗生物素蛋白 生物素 棕褐色不溶 性的化合物 、斑點(diǎn)及夾縫印跡雜交（dot blot and slot blot)：檢測DNA或RNA（定性或半定量） 檢測DNA大小、存在狀態(tài) DNA電泳

10、 變性 轉(zhuǎn)膜 雜交 吸水紙 玻璃板 重物 濾紙 凝膠 鹽橋 Southern轉(zhuǎn)印 檢測RNA的大小和狀態(tài) RNA電泳 轉(zhuǎn)印 雜交 洗膜 顯色 用標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞涂片中的 核酸進(jìn)行雜交并對其進(jìn)行檢測和定位的方法 平皿 膜雜交 培養(yǎng) PCR：Polymerase chain reaction Mullis: 1983發(fā)明， 1993獲諾貝爾獎 Sarki:1985將PCR用于鐮刀紅細(xì)胞貧血 的診斷。 Erlich: 分離純化了適用于PCR的Tag酶 （一）原理： PCR是體外酶促合成特異片段的方法。 由高溫變性、低溫退火及適當(dāng)溫度延伸等幾步 反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的 得以迅

11、速擴(kuò)增。 變性-退火-延伸-延伸 30-35循環(huán) 94 c 55 c 72c 5 3 5 3 變性 退火 延伸 第二循環(huán) 。操作簡單 。省時(shí)：1-2 hr 。靈敏度高：pg 。特異性強(qiáng) 。對原始材料質(zhì)量要求低 。有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入 、模板：ng量的克隆DNA或g的染色 體DNA 、引物：特異性應(yīng)強(qiáng) 、Mg2+濃度: 1.5-2 mmol/L量 、dNTP 的濃 度: 單核苷酸濃度 200umol/L 5、 Taq DNA聚合酶的用量:100l 反應(yīng)液 中加入2。5U的酶 、循環(huán)參數(shù)：；25-35 、上游引物與目的DNA端序列完全相同； 下游引物與目的DNA端序列互補(bǔ) 、引物長度以15

12、-30個(gè)堿基為益； G+C含量為45-55 、避免引物內(nèi)形成二級結(jié)構(gòu) 、兩引物間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在端， 避免形成引物二聚體 、合成的引物應(yīng)進(jìn)行純化 、引物的濃度不要太高: 0.1-0.5 mol/L 目的：ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC- -CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3 上游序列： ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC G+C=11/21=52% 下游序列：CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3 G+C=10/21=48% 反轉(zhuǎn)錄PCR： mRNA-cDNA-PCR

13、抽提RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA PCR 擴(kuò)增 AAAAAAA-3 AAAAAAA-3 TTTTTTT-5 mRNA cDNA TTTTTTT-5 PCR RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄酶+dNTP cDNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國 Applied Biosystems公司推出，由于該 技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛 躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異 性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動 化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。 下面就其定量原理、方法作一介紹。 所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是 指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)， 利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)

14、準(zhǔn)曲線對未知模 板進(jìn)行定量分析的方法。 C代表Cycle（循環(huán)數(shù)） t代表threshold（熒光域值） CT值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的 熒光信號到 達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)用 的循環(huán)數(shù) 橫坐標(biāo)：PCR循環(huán)數(shù) 縱坐標(biāo)：熒光信號強(qiáng)度 黑線：熒光域值 紅線：無模板 -域值下一 直線 綠線 ：樣品 CT值=17 （第17個(gè)循環(huán)時(shí)， 熒光信號強(qiáng)度達(dá)到域值） PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作 為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置 是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差的10 倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模 板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān) 系，起始

15、拷貝數(shù)越多，Ct值越小。 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作 出標(biāo)準(zhǔn)曲線（如下圖所示） 橫坐標(biāo)代表起始拷貝 數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代 Ct值. 獲得未知樣品的Ct 值-標(biāo)準(zhǔn)曲線-該 樣品的起始拷貝數(shù)。 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué) 可分為兩種： 熒光探針 熒光染料 用熒光基團(tuán)標(biāo)記PCR特異性熒光探針。 探 針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。 探針完整時(shí)報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收- -檢測不到熒光信號； PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的53外切酶活性將探針 酶切降解，報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離 熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號 每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了 熒光信號的

16、累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料； SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射 熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā) 射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 內(nèi)參照法；競爭法 ； 原理：同一PCR管（熒光標(biāo)記引物、待檢模 板、已定量內(nèi)標(biāo)）-該P(yáng)CR管（擴(kuò)增的模板、擴(kuò) 增的內(nèi)標(biāo)）-電泳或高效液相分離-分別檢測 熒光強(qiáng)度-以內(nèi)標(biāo)為參照，定量檢測模板 傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測（PCR到達(dá)平臺 期后進(jìn)行檢測），而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá) 平臺期時(shí)，檢測重現(xiàn)性極差。 同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 所

17、得結(jié)果有很大差異（見圖4），因此無法直 接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。 加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的 不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都 只能算作半定量、粗略定量的方法。 圖4. 相同模板在同一臺 PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增 的擴(kuò)增曲線圖 終點(diǎn)處檢測產(chǎn)物量不恒 定；Ct值則極具重現(xiàn)性 利用梯度PCR儀對解鏈、退火及延伸 設(shè)置溫度梯度，適用于摸索試驗(yàn)條件 時(shí)，多次試驗(yàn)可在一臺儀器上完成， 既節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，提高效率，又節(jié)省 試驗(yàn)成本。 巢式PCR（nested PCR）是一種PCR改良模式，它使 用巢式PCR引物來增強(qiáng)反應(yīng)的敏感性和特異性，巢式 PCR方法由兩輪PCR擴(kuò)增和利用兩套引物對所組成， 在第一輪擴(kuò)增中，使用一對外引物產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，然 后用一對內(nèi)引物對第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。 以上方法適用于多種DNA及RNA病毒的檢測，如 HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA、CMV DNA 、 HTLV DNA、 HGV RNA