第17章液相色譜法

1、1 第十七章 高效液相色譜法 17.1 概述概述 17.2 色譜儀色譜儀 17.3 色譜法色譜法 的分類的分類 17.4 色譜法色譜法 的應(yīng)用的應(yīng)用 2 課程引入：課程引入： 食品中蘇丹紅事件？食品中蘇丹紅事件？ 水果、蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留？水果、蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留？ “三鹿奶粉事件三鹿奶粉事件”中三聚氰胺的分析？中三聚氰胺的分析？ 3 17-1 概述概述 高效液相色譜法的特點(diǎn)：高效液相色譜法的特點(diǎn)： 高壓、高效、高速、高靈敏度。適用于高沸點(diǎn)、高壓、高效、高速、高靈敏度。適用于高沸點(diǎn)、 熱不穩(wěn)定及生化試樣的分析。熱不穩(wěn)定及生化試樣的分析。 4 17-2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 液相

2、色譜儀（液相色譜儀（1 1） 5 液相色譜儀（液相色譜儀（2 2） 6 液相色譜儀（液相色譜儀（3 3） 7 液相色譜儀（液相色譜儀（4 4） 8 一、流程及主要部件一、流程及主要部件 1.1.流程流程 HPLC與與GC的原理相同，只因的原理相同，只因HPLC流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相為液體， Van.Deemter方程中，組分的縱向擴(kuò)散可忽略。方程中，組分的縱向擴(kuò)散可忽略。 9 10 GC和和HPLC在分離上的主要區(qū)別：在分離上的主要區(qū)別： GC：流動(dòng)相為惰性氣體，分離主要取決于：流動(dòng)相為惰性氣體，分離主要取決于 組分分子與固定相間的作用力，主要組分分子與固定相間的作用力，主要 通過改變固定相來改

3、變對組分的選擇通過改變固定相來改變對組分的選擇 性。性。 GLC中，流動(dòng)相對組分作用極弱，一定柱溫中，流動(dòng)相對組分作用極弱，一定柱溫 下，固定液流失主要由高柱溫造成其下，固定液流失主要由高柱溫造成其 自身揮發(fā)，所以，在應(yīng)用中主要采用自身揮發(fā)，所以，在應(yīng)用中主要采用 涂漬的方法制備柱子。涂漬的方法制備柱子。 GSC中，無固定液流失現(xiàn)象。中，無固定液流失現(xiàn)象。 11 HPLC：流動(dòng)相與組分分子間有一定的親和流動(dòng)相與組分分子間有一定的親和 力；分離是由組分、流動(dòng)相和固定力；分離是由組分、流動(dòng)相和固定 相三者相互作用的結(jié)果。流動(dòng)相是相三者相互作用的結(jié)果。流動(dòng)相是 極性不同的有機(jī)溶劑或緩沖水溶極性不同的

4、有機(jī)溶劑或緩沖水溶 液，溶解能力強(qiáng)。在液，溶解能力強(qiáng)。在HPLC中，固中，固 定液分子必須鍵合在填料上，否則，定液分子必須鍵合在填料上，否則， 流失嚴(yán)重。另外，填料的顆粒流失嚴(yán)重。另外，填料的顆粒 直徑一般為直徑一般為35m，柱子制備復(fù)，柱子制備復(fù) 雜。因此，在應(yīng)用中，主要以改變雜。因此，在應(yīng)用中，主要以改變 流動(dòng)相來調(diào)節(jié)分離的選擇性。流動(dòng)相來調(diào)節(jié)分離的選擇性。 12 高效液相色譜儀一般可分為高效液相色譜儀一般可分為4 4個(gè)主要部分：個(gè)主要部分： 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 還配有輔助裝置：還配有輔助裝置： 梯度淋洗梯度淋洗 自動(dòng)進(jìn)樣自動(dòng)進(jìn)樣

5、 數(shù)據(jù)處理等數(shù)據(jù)處理等 13 2.2.主要部件主要部件 (1)(1)高壓輸液泵高壓輸液泵 壓力：壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的為了獲得高柱效而使用粒度很小的 固定相（固定相（10m，常用常用35m），）， 液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生 很高的壓力，因此高壓、高速是高很高的壓力，因此高壓、高速是高 效液相色譜的特點(diǎn)之一。效液相色譜的特點(diǎn)之一。 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可 調(diào)、耐腐蝕等特性。調(diào)、耐腐蝕等特性。 14 高壓輸液泵的種類：高壓輸液泵的種類： 恒壓泵恒壓泵液壓隔膜泵和氣動(dòng)放大泵。液

6、壓隔膜泵和氣動(dòng)放大泵。 恒流泵恒流泵螺旋注射泵和往返柱塞泵。螺旋注射泵和往返柱塞泵。 15 （2 2）梯度淋洗裝置）梯度淋洗裝置 HPLC有等梯度洗脫和梯度洗脫兩種。有等梯度洗脫和梯度洗脫兩種。 前者保持流動(dòng)相組成、配比恒定。前者保持流動(dòng)相組成、配比恒定。 后者采用兩種或多種不同極性的溶劑，在分離過程中后者采用兩種或多種不同極性的溶劑，在分離過程中 按照程序連續(xù)改變流動(dòng)相的濃度配比及極性。按照程序連續(xù)改變流動(dòng)相的濃度配比及極性。 梯度淋洗的作用：梯度淋洗的作用： 提高分離度提高分離度 縮短分析時(shí)間縮短分析時(shí)間 提高分析精度提高分析精度 16 梯度淋洗的方式：梯度淋洗的方式： 內(nèi)梯度內(nèi)梯度高壓梯

7、度裝置（目前廣泛采用）高壓梯度裝置（目前廣泛采用） 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的 溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后 進(jìn)入色譜柱。（進(jìn)入色譜柱。（先加壓后混合先加壓后混合） 17 外梯度外梯度 低壓梯度裝置低壓梯度裝置 通過比例調(diào)節(jié)閥通過比例調(diào)節(jié)閥, ,將兩種或多種不同極性的溶劑按將兩種或多種不同極性的溶劑按 一定的比例混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱一定的比例混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱 中。（中。（先混合后加壓先混合后加壓） HPLC梯度淋洗改變的是流動(dòng)相的配比和極，梯度淋洗改變的是流動(dòng)相的配比和極，

8、 提高分離效果，縮短分離時(shí)間，改善峰形。提高分離效果，縮短分離時(shí)間，改善峰形。 通過改變流動(dòng)相的配比和流速是通過改變流動(dòng)相的配比和流速是HPLC中中 改進(jìn)分離效果重要手段。改進(jìn)分離效果重要手段。 GC 程序升溫，改變的是分析過程中的柱溫。程序升溫，改變的是分析過程中的柱溫。 18 (3)進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置 分為手動(dòng)進(jìn)樣（進(jìn)樣器進(jìn)樣和閥進(jìn)樣）和分為手動(dòng)進(jìn)樣（進(jìn)樣器進(jìn)樣和閥進(jìn)樣）和 自動(dòng)進(jìn)樣（自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣）兩種。自動(dòng)進(jìn)樣（自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣）兩種。 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高 壓的六通閥進(jìn)樣裝置。壓的六通閥進(jìn)樣裝置。 19 (4) (4) 高效分離柱高效分

9、離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減。發(fā)展趨勢是減 小填料粒度和柱徑以提高柱效。小填料粒度和柱徑以提高柱效。 常用：常用： 長度為長度為10 25cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為4 5mm。 20 (5) (5) 高效液相色譜檢測器高效液相色譜檢測器 紫外光度檢測器（紫外光度檢測器（UV） 最常用的檢測器，可用于梯度洗脫。如固定波長最常用的檢測器，可用于梯度洗脫。如固定波長 型的汞燈型的汞燈254nm或或280nm的紫外檢測器、可調(diào)波的紫外檢測器、可調(diào)波 長的氘燈或氫燈長的氘燈或氫燈( (200-400nm) )。不銹鋼池。不銹鋼池10L。

10、 對對UV無吸收的組分不響應(yīng)；對無吸收的組分不響應(yīng)；對UV吸收較大，如苯吸收較大，如苯 不可作流動(dòng)相。不可作流動(dòng)相。 21 光電二極管陣列檢測器（光電二極管陣列檢測器（DAD） 為新型的紫外吸收檢測器。以氘燈為光源，繪制出為新型的紫外吸收檢測器。以氘燈為光源，繪制出 隨時(shí)間變化的光譜吸收曲線（隨時(shí)間變化的光譜吸收曲線（A）計(jì)算機(jī)快速）計(jì)算機(jī)快速 處理，可獲得分離組分的三維彩色譜圖，得到更多處理，可獲得分離組分的三維彩色譜圖，得到更多 信息。信息。 22 23 示差折光率檢測器（示差折光率檢測器（RID）通用型。通用型。 每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)，可連續(xù)檢測參比池每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)，可

11、連續(xù)檢測參比池 和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值，差值與濃和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值，差值與濃 度呈正比。靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度度呈正比。靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度 洗脫。洗脫。 24 熒光檢測器熒光檢測器 （FD） 選擇性檢測器選擇性檢測器 高靈敏度、高選高靈敏度、高選 擇性；擇性； 對多環(huán)芳對多環(huán)芳 烴，維生素?zé)N，維生素B B、黃、黃 曲霉素、卟啉類曲霉素、卟啉類 化合物、農(nóng)藥、化合物、農(nóng)藥、 藥物、氨基酸等藥物、氨基酸等 化合物有響應(yīng)?；衔镉许憫?yīng)。 25 17-3 高效液相色譜法的類型高效液相色譜法的類型 一、影響液相色譜分離的因素一、影響液相色譜分離的因

12、素 高效液相色譜中高效液相色譜中, , 速率方程中的分子速率方程中的分子 擴(kuò)散項(xiàng)擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可以忽略不計(jì)。較小，可以忽略不計(jì)。 H = A + C u Dm10-410-5Dg 26 影響分離的主要因素有流動(dòng)相的流量、影響分離的主要因素有流動(dòng)相的流量、 性質(zhì)和極性。性質(zhì)和極性。 無隨無隨u降低降低H升高的現(xiàn)象升高的現(xiàn)象（B/u） u降低，降低，H降低，但無降低，但無Hmin u升高，升高，H平緩升高。因平緩升高。因Dm10-410-5Dg 27 1.流速流速 流速大于流速大于0.5 cm/s時(shí)時(shí), , Hu曲線是一段斜率不大曲線是一段斜率不大 的直線。的直線。 降低流速，柱效提高不是很大

13、。降低流速，柱效提高不是很大。 但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出 峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。 28 2.固定相及分離柱固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜， 其選用原則與氣相色譜一樣。其選用原則與氣相色譜一樣。 選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效， 但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要 求非常高的工作，一般很少自行制備。求非常高的工作，一般很少自行制

14、備。 選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度。研制高效柱填料選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度。研制高效柱填料 是一活躍領(lǐng)域。是一活躍領(lǐng)域。 29 3.流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性 可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選 擇在液相色譜中顯得特別重要。擇在液相色譜中顯得特別重要。 液相色譜的流動(dòng)相又稱為：液相色譜的流動(dòng)相又稱為： 淋洗液，洗脫劑。淋洗液，洗脫劑。 親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相， 即即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，流動(dòng)相的極性小于固定相的極性， 稱為正相液液色譜法，稱為正相液液色譜法， 極性柱也稱正相柱。極性柱也稱正相柱。 適

15、合極性化合物分離。適合極性化合物分離。 30 若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相 液液色譜，液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。非極性柱也稱為反相柱。 適合非極性化合物分離。適合非極性化合物分離。 4.4.流動(dòng)相組成流動(dòng)相組成 流動(dòng)相按組成不同：分為單組分和多組分。流動(dòng)相按組成不同：分為單組分和多組分。 按極性不同：分為極性、弱極性、非極性。按極性不同：分為極性、弱極性、非極性。 按使用方式不同：按使用方式不同： 分為固定組成淋洗和梯度淋洗。分為固定組成淋洗和梯度淋洗。 31 常用溶劑常用溶劑: : 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙己烷、四氯化碳

16、、甲苯、乙酸乙酯、乙 醇、乙腈、水。醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相 可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇 性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。 32 5.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題 盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期 累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。 避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞 柱子柱子 試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜

17、的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀 并在柱中沉積。并在柱中沉積。 流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢 測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。 33 二、高效液相色譜法的類型二、高效液相色譜法的類型 1.1.吸附色譜（液吸附色譜（液- -固吸附色譜固吸附色譜LSC） 以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁 等。較常使用的是等。較常使用的是5 510m的硅膠吸附劑。流的硅膠吸附劑。流 動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元

18、溶劑。 常用于農(nóng)藥成分分離、植物色素的分離等。常用于農(nóng)藥成分分離、植物色素的分離等。 但不適合強(qiáng)極性離子型樣品或同系物的分離。但不適合強(qiáng)極性離子型樣品或同系物的分離。 34 2.2.分配色譜（液分配色譜（液- -液分配色譜液分配色譜 LLPC） 通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定 相相, ,通過組分在固定液和固定相中的多次分配通過組分在固定液和固定相中的多次分配 平衡進(jìn)行分離。平衡進(jìn)行分離。 分為分為正相色譜和反相色譜正相色譜和反相色譜。 正相色譜：極性固定相、弱極性或非極性流正相色譜：極性固定相、弱極性或非極性流 動(dòng)相動(dòng)相 分離中等極性化合物。分離中等極

19、性化合物。 反相色譜：非極性固定相、以水為底劑加入反相色譜：非極性固定相、以水為底劑加入 少量有機(jī)溶劑的極性流動(dòng)相少量有機(jī)溶劑的極性流動(dòng)相 分離極性小的樣品。分離極性小的樣品。 35 表面多孔型表面多孔型(球形玻珠球形玻珠)： 孔淺、孔層厚度小、出峰孔淺、孔層厚度小、出峰 快、柱效高，快、柱效高， 但允許進(jìn)樣量小。但允許進(jìn)樣量小。 全多孔型全多孔型(硅膠硅膠)：顆粒細(xì)、孔淺、傳質(zhì)顆粒細(xì)、孔淺、傳質(zhì) 快、柱效高，允許進(jìn)樣量大，為前者的快、柱效高，允許進(jìn)樣量大，為前者的5 倍。倍。 3.3.化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜（CBPC ） 用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化

20、學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān) 體表面。體表面。 反相反相CBPC：非極性固定相、極性流動(dòng)相。非極性固定相、極性流動(dòng)相。 如：如：ODS (C18)，甲醇甲醇- -水。水。 正相正相CBPC：極性固定相、非極性或弱極性流動(dòng)相。：極性固定相、非極性或弱極性流動(dòng)相。 如：氨基柱，正己烷。如：氨基柱，正己烷。 36 18烷基鍵合固定相的形成烷基鍵合固定相的形成ODS (C18 ) 37 化學(xué)鍵合固定相類型：化學(xué)鍵合固定相類型： 化學(xué)鍵合固定相是目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固化學(xué)鍵合固定相是目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固 定相。定相。 （1 1）硅氧碳鍵型：）硅氧碳鍵型： SiOC （2 2）硅氧硅碳鍵型：）硅氧硅碳鍵

21、型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐穩(wěn)定，耐水、耐光、耐 有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣。有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣。 （3 3）硅碳鍵型：）硅碳鍵型： SiC （4 4）硅氮鍵型：）硅氮鍵型： SiN 38 4.離子交換色譜（離子交換色譜（IEC） 固定相為離子交換樹脂固定相為離子交換樹脂，流動(dòng)相為無機(jī)酸或無機(jī)流動(dòng)相為無機(jī)酸或無機(jī) 堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換 基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。 39 5.5.凝膠色譜（空間排阻色譜）凝膠色譜（空間排阻色譜）SEC （1）以凝膠為固定相。以凝膠為固定相。 （2）凝膠是一種經(jīng)

22、過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠； 多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。 （3）利用凝膠的孔徑與被分離組分分子間利用凝膠的孔徑與被分離組分分子間 的相對大小關(guān)系進(jìn)行分離、分析，與的相對大小關(guān)系進(jìn)行分離、分析，與 流動(dòng)相性質(zhì)無關(guān)。流動(dòng)相性質(zhì)無關(guān)。 40 （4 4）凝膠具有許多尺寸的孔徑。）凝膠具有許多尺寸的孔徑。 KD=Cs/Cm 當(dāng)當(dāng)KD=1時(shí)，為凝膠的滲透極限；時(shí)，為凝膠的滲透極限； 當(dāng)當(dāng)KD=0時(shí)，為凝膠的排阻極限。時(shí)，為凝膠的排阻極限。 不同尺寸樣品分子的分布系數(shù)不同尺寸