微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程來源ACCC

1、國家自然科技資源平臺微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程（試行）自然科技資源收集、整理、保存技術(shù)規(guī)程研究與制定項目組二四年十二月十日14目 次前 言2引 言31范圍42定義43基本原則54方法5附錄A 定期移植保藏法6附錄B 液體石蠟保藏法9附錄C 沙土管保藏法11參考文獻13前 言本規(guī)范由國家自然科技資源平臺建設(shè)項目提出。本規(guī)范起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所、中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國科學院微生物研究所、中國林業(yè)科學研究院森林保護研究所、中國藥品生物制品檢定所、中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。本規(guī)范主要起草人：程池、李金霞、胡海蓉、姜瑞波、顧金剛、周宇光、樸春根、葉強、

2、張月琴、陳敏等。引 言微生物菌種常規(guī)保藏是一類重要的基本操作技術(shù)，廣泛應(yīng)用于科學研究、教學及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，是保護微生物菌種資源的重要手段，是科研教學及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)正常運轉(zhuǎn)的重要保障。本規(guī)程包括定期移植保藏法、液體石蠟保藏法和沙土管保藏法三種常用微生物菌種保藏方法。制定本規(guī)程是為了規(guī)范微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)操作，加強管理，以達到保護微生物菌種資源，利用微生物菌種資源及實現(xiàn)資源共享的目的。微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程1范圍本規(guī)程規(guī)定了微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)的基本原則和方法。本規(guī)程適用于微生物菌種的常規(guī)保藏工作。2定義本規(guī)程采用下列定義。2.1微生物菌種資源 microorganism resourc

3、es指可培養(yǎng)的有一定科學意義、具有實際或潛在實用價值的古菌、細菌、真菌、病毒、細胞株等及其相關(guān)信息數(shù)據(jù)。2.2菌種保藏 culture preservation 是指將微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定。2.3定期移植保藏法 subculturing 亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于46進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。2.4液體石蠟保藏法 preservation under liquid paraffin亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。

4、是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于415進行保存的一種菌種保藏方法。2.5沙土管保藏法 sand preservation亦稱載體保藏法。是指將培養(yǎng)好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于415進行保存的一種菌種保藏方法。3基本原則3.1 應(yīng)針對菌種特性選擇適宜方法進行保藏。3.3 應(yīng)保證菌種保藏的安全性，不能對周圍環(huán)境造成污染和危害。4方法4.1 定期移植保藏法 見附錄

5、A。4.2 液體石蠟保藏法見附錄B。4.3 沙土管保藏法 見附錄C。定期移植保藏法A.1 適用范圍本方法適用于大多數(shù)細菌和真菌。A.2 原理低溫條件下保藏可減緩微生物菌種的代謝活動，抑制其繁殖速度，達到減少菌株突變，延長菌種保藏時間的目的。保藏培養(yǎng)基一般含較多有機氮，糖分總量不超過2%，既能滿足菌種培養(yǎng)時生長繁殖的需要，又可防止因產(chǎn)酸過多而影響菌株的保藏。A.3 技術(shù)要求A.3.1 不同菌種應(yīng)根據(jù)要求選擇合適的培養(yǎng)基。A.3.2 接種時要求無菌操作，避免染菌。A.3.3 保藏期間要定期檢查菌種存放的房間、冷庫、冰箱等的溫度、濕度，各試管的棉塞有無污染現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)取出該管，重新移植培養(yǎng)后補

6、上空缺。A.3.4 大量菌種同時移植時，各菌株的菌號、所用培養(yǎng)基要進行核對，避免發(fā)生錯誤。A.3.5 每次移植培養(yǎng)后，應(yīng)與原保藏菌株和菌株的登記卡片逐個對照，檢查無誤后再存放。A.3.6 斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染造成損失。A.4 方法與步驟A.4.1 培養(yǎng)基制備A.4.1.1 器皿準備培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，根據(jù)不同情況洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。A.4.1.2 溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。A.4.1.3

7、 調(diào)pH值配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸或稀堿調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養(yǎng)成分被破壞。A.4.1.4 加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發(fā)水分。A.4.1.5 過濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝，斜面培養(yǎng)基不宜超過試管高度的四分之一。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。A.4.1.6 包扎標記將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。A.4.1.7 滅菌根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌。滅菌后

8、擺放斜面時，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。A.4.1.8 無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗。A.4.2 接種A.4.2.1 斜面接種A.4.2.1.1 點接把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。A.4.2.1.2 中央劃線從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。A.4.2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。A.4.2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。A.4.2.1.5 挖塊

9、接種法挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。A.4.2.2 穿刺接種用直接種針從原菌種斜面上挑取少量菌苔，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。A.4.2.3 液體接種挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。A.4.3 培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。A.4.4 保藏A.4.4.1 保藏溫度和時間培養(yǎng)好的菌種于46保存，根據(jù)要求每36個月移植一次。對于某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須13個月移植

10、一次。A.4.4.2 保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%70%。測量儀表采用毛發(fā)濕度計或干濕球濕度計。A.4.5 移植培養(yǎng)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到另一新鮮培養(yǎng)基中，再在適宜條件下培養(yǎng)。A.4.6 菌種復壯菌種如有退化，應(yīng)將退化的菌種引入原來的生活環(huán)境中令其生長繁殖，通過純種分離，在宿主體內(nèi)生長等方法進行復壯。附錄B 液體石蠟保藏法B.1 適用范圍本方法適用于不能分解液體石蠟的酵母菌、某些細菌(如芽孢桿菌屬，醋酸桿菌屬等)和某些絲狀真菌(如青霉屬，曲霉屬等)。B.2 原理液體石蠟保藏法可作為定期移植保藏法的輔助方法。在液體石蠟覆蓋下，菌種的生物代謝受到抑制，細胞老化被推遲。此方法可阻止氧氣進入，使好氣菌

11、不能繼續(xù)生長，也可防止因培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)而引起的菌體死亡，達到延長菌種保藏時間的目的。B.3 技術(shù)要求B.3.1 菌種培養(yǎng)參照附錄A。B.3.2 應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟。B.3.3 液體石蠟易燃，在對液體石蠟保藏菌種進行操作時注意防止火災(zāi)。B.3.4 保藏場所應(yīng)保持干燥，防止棉塞污染。B.3.5 保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時補充滅菌的液體石蠟。B.4 方法與步驟B.4.1 液體石蠟將液體石蠟分裝加棉塞，用牛皮紙包好，0.1MPa滅菌30分鐘取出，置40恒溫箱蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。B.4.2 斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A，斜面宜短，不超過試管三分之一為宜。B.4.3 灌注石

12、蠟 無菌條件下將滅菌的液體石蠟注入剛培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1厘米左右，使菌體與空氣隔絕。B.4.4 保藏將注入石蠟油的菌種斜面直立存放于低溫(4-15)干燥處，保藏時間為2-10年不等。B.4.5 恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。附錄C 沙土管保藏法C.1 適用范圍本方法適用于產(chǎn)孢類放線菌、芽孢桿菌、曲霉屬、青霉屬以及少數(shù)酵母如隱球酵母和紅酵母等。不適用于病原性真菌的保藏，特別是不適于以菌絲發(fā)育為主的真菌的保藏。C.2 原理干燥條件下微生物菌種代謝活動減緩，繁殖速度受到抑制。此方法可減少菌株突變，延長存活時間。C.3 方法與

13、步驟C.3.1 沙土管制備 將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。另取瘦紅土100目過篩,水洗至中性，烘干，按沙土= 21混合。把混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1厘米左右。塞好棉塞，0.1MPa滅菌30分鐘，或常壓間歇滅菌3次，每天每次1小時。滅菌后在不同部位抽出若干管，分別加營養(yǎng)肉汁、麥芽汁、豆芽汁等培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)檢查后無微生物生長方可使用。C.3.2 斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A。C.3.3 制備菌懸液向培養(yǎng)好的斜面

14、培養(yǎng)物中注入3mL-5mL無菌水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2mL -0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。C.3.4 干燥用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器內(nèi)。C.3.5 純培養(yǎng)檢查從做好的沙土管中，按101比例抽查。無菌條件下用接種環(huán)取出少量沙土粒，接種于適宜的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察其生長情況和有無雜菌生長。如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少，或根本不長，則須進一步抽樣檢查。C.3.6 保藏將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低溫(4-15)干燥處，半年檢查一次活力及雜菌情況。也可將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置干燥器內(nèi)保存。用此方法保藏時間為2-10年不等。C.3.7 復活復活時在無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后