多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件人教版選修1

1、專(zhuān)題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題2 2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNADNA片段 欄目鏈接 欄目鏈接 在刑事偵破案件中常需要對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技 術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA 拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn) 行分析研究的問(wèn)題?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、 刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和基因測(cè)序。 欄目鏈接 請(qǐng)思考： 1PCR技術(shù)的基本原理是什么？ 2PCR反應(yīng)過(guò)程是怎樣的？ 欄目鏈接 欄目鏈接 1生物體內(nèi)DNA復(fù)制的條件 (1)原料： _。 (2)模板：解旋后的每一條_。 (3)酶：打開(kāi)DNA雙鏈的_和合成DNA單鏈的 _。

2、(4)引物：為DNA聚合酶的起始提供_末端。 一、PCR的原理及反應(yīng)過(guò)程 4種脫氧核苷酸 DNA母鏈 解旋酶 DNA聚合酶 3 欄目鏈接 2PCR擴(kuò)增的原理 (1)概念：PCR即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外 _的技術(shù)。它能以極少量的DNA為模板，在幾 小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。 (2)原理： DNA變性：在_的溫度范圍內(nèi)，DNA的 _結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性。 迅速擴(kuò)增DNA片段 80 100 雙螺旋 欄目鏈接 DNA復(fù)性：當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈 又會(huì)重新_，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性。 DNA合成：DNA聚合酶從引物_端開(kāi)始延伸 DNA鏈，DNA的合成方向總是從子

3、鏈的_端向_端 延伸。 結(jié)合成雙鏈 3 5 3 欄目鏈接 (3)條件： 模板：解旋后的每一條_。 引物：能分別與_結(jié)合的兩種引物。 原料： _。 酶：_DNA聚合酶。 其他條件：需要穩(wěn)定的_和能自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度的溫控設(shè) 備。 DNA母鏈 兩條模板鏈 4種脫氧核苷酸 耐熱的 緩沖溶液 欄目鏈接 90 50 堿基互補(bǔ)配對(duì) 欄目鏈接 72 DNA聚合酶 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 欄目鏈接 1實(shí)驗(yàn)用具 (1)PCR儀：該儀器能自動(dòng)調(diào)控_，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò) 增。如果沒(méi)有PCR儀，可用3個(gè)_水浴鍋代替，操作時(shí) 按程序在3個(gè)水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。 (2)微量離心管：總?cè)莘e為_(kāi)mL，實(shí)際上是進(jìn)行 PCR反

4、應(yīng)的場(chǎng)所。 (3)微量移液器：用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的 液體，每吸取一種試劑后其上的一次性吸液槍頭都必須更換。 二、PCR的實(shí)驗(yàn)操作 溫度 恒溫 0.5 欄目鏈接 2實(shí)驗(yàn)步驟 用微量移液器 輕輕彈擊 欄目鏈接 10 欄目鏈接 3DNA含量的測(cè)定 (1)原理：利用DNA在_的紫外線波段有一強(qiáng)烈的 吸收峰。 (2)計(jì)算公式： DNA含量(g/mL)_稀釋倍數(shù)。 點(diǎn)撥：在PCR實(shí)驗(yàn)操作中，常用微量離心管作為反應(yīng)場(chǎng)所， 在操作時(shí)，用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系的配方在微量離心 管中依次加入各組分，再設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序就可以了。 260 nm 50(260 nm的讀數(shù)) 欄目鏈接 欄目

5、鏈接 一、生物體內(nèi)的DNA復(fù)制與PCR反 應(yīng)的比較 欄目鏈接 DNA單鏈有方向性，DNA母鏈的3端對(duì)應(yīng)著子鏈 的5端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹?注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈 的氫鍵斷開(kāi)，而DNA聚合酶與DNA連接酶都是催化形成磷酸二 酯鍵的。 DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的 3端上，需要模板，而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的 缺口，不需要模板。 特 別 提 醒 欄目鏈接 例1標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步， 這三大步需要的溫度依次是() A92 、50 、72 B72 、50 、92 C50 、92 、72 D80 、50 、72

6、欄目鏈接 解析：當(dāng)溫度上升到90 (9096 )以上時(shí)，雙鏈DNA 解聚為單鏈，稱(chēng)之為變性；當(dāng)溫度下降到50 (4060 )左右 時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度 上升到72 (7075 )時(shí)，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、 C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合 成新的DNA鏈，稱(chēng)為延伸。 答案：A 欄目鏈接 變式 訓(xùn)練 1DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是() A可加快DNA的復(fù)制速度 B引物可與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合 C引物的5端有助DNA聚合酶的延伸DNA鏈 DDNA聚合酶只能從3端延伸DNA鏈 欄目鏈接 變式 訓(xùn)練 解析：DN

7、A的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模瑸榱嗣鞔_地表示 DNA的方向，通常將DNA的羥基(OH)末端稱(chēng)為3端，而磷 酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為5端。DNA聚合酶不能從5端開(kāi)始合成 DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。 當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就 能從引物的3端開(kāi)始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子 鏈的5端向3端延伸。 答案：D 欄目鏈接 二、PCR技術(shù)的基本原理 類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，由變性復(fù)性延伸三個(gè)基 本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 1模板DNA的變性 模板DNA經(jīng)加熱至95 左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙 鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的DNA的雙鏈解開(kāi)，使之成為單鏈，以

8、便 它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。 2模板DNA與引物的退火(復(fù)性) 模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 左右，引 物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。 欄目鏈接 欄目鏈接 3引物的延伸 DNA模板引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四種 脫氧核苷酸為反應(yīng)原料，DNA母鏈為模板，按堿基配對(duì)與半保 留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性復(fù)性延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù) 制鏈”，而且這種新鏈又成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán) 需24 min,23 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 欄目鏈接 PCR擴(kuò)增過(guò)程中的易錯(cuò)點(diǎn) PCR過(guò)程中

9、無(wú)解旋酶，破壞氫鍵需要升高溫度才能打 開(kāi)氫鍵，但此時(shí)的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵，因此，熱變性 后是DNA單鏈，并未分解成單體。 復(fù)性時(shí)只是在引物和DNA單鏈之間形成氫鍵，兩條單 鏈之間并未形成氫鍵，因此復(fù)性后，無(wú)雙鏈DNA分子形成。 特 別 提 醒 欄目鏈接 三、PCR的實(shí)驗(yàn)操作 1操作步驟 (1)按PCR反應(yīng)體系的配方配制所需試劑。 (2)用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組 分。 (3)蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。 (4)將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10 s。 欄目鏈接 (5)將離心管放在PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。 以上過(guò)程可以概括為準(zhǔn)備、移液、混合、

10、離心、反應(yīng)五 大步。 欄目鏈接 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 (1)實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定。 稀釋?zhuān)喝? L PCR反應(yīng)液，加入98 L蒸餾水，即將 樣品稀釋了50倍。 對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260 nm處， 將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)至零。 測(cè)定：取DNA稀釋液100 L至比色杯中，測(cè)定260 nm 處的光吸收值。 計(jì)算：DNA含量(g/mL)50(260 nm的讀數(shù))稀釋 倍數(shù)。 欄目鏈接 (2)理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算。 DNA擴(kuò)增與DNA復(fù)制一樣，呈指數(shù)擴(kuò)增。若只有一個(gè) DNA為模板，則復(fù)制n次后有2n個(gè)；若一開(kāi)始有a個(gè)模板，則復(fù) 制n次有a2n個(gè)DNA。 (3)DNA擴(kuò)增是否成功。 檢測(cè)DNA片段擴(kuò)增情況可以采用上述方法，也可以采用 電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察DNA帶的分布 及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。如果擴(kuò)增不成功，則要分析失 敗原因。可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分、各反應(yīng)成分 的用量不當(dāng)、PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?欄目鏈接 例2下列操作過(guò)程的敘述中錯(cuò)誤的是() APCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液