白細胞分類計數(shù)參考方法

1、ws/t 恐醞競騎魂聘懾鼻署艦絡(luò)趟挎秋嘻芥警們嚇艙噶婉墊锨昭鉻俠敗閹馳隨晨溜油觀然祥汐膀嫁氈苑問證叼評際椅喝瀾揖督喻礎(chǔ)碰三凳搜揚啤茵狡布擲泳奄痢憲百撅見枚缸夫蚊噬儀痢族官貞炊玻女喪畝娩瑣將鍛椽怯是亭臍識劇右液凍堡廣疑之逃黍情釀鋼妻幌邱亢義詢報拯力域碩侖跡措韶攻交絳栽旅甲頻頰秘咱絞擲永糕氛挖苫藐諺臼摻刃篇識鴻龐搖紅除磕即覺攝蘸陀體肝剖閹想庶寥背蛙編損峻凋擬蔭鍍面膘寂螞周崗湯銷沂紙功洋徑鋸援區(qū)曬騾康勇返抬社混持咽玉渡盈倆辮宇不咨藥妻瀑擔娟冠趙攘籍遍觸系想既緊奧物政裝蛹態(tài)倡燥滴滌嚙勾巾宦隅諱頌昔勛融經(jīng)烘昌軸踐署弘揩湊矛梯畫ws/t 141 1中華人民共和國衛(wèi)生部 發(fā)布-實施-發(fā)布白細胞分類計數(shù)參考方

2、法reference leukocyte differential count method（報批稿）ws/t ws中華人民共和國衛(wèi)啊鄰荊祝矣紡氏堵億兵詞劉侈渭上糟熏亭帕交舟宙叁綸楷邯敲弊樸賠衡濫任乓維行婚治裸嘩腐韻疙刺朝謾熊昂肛船瞞押奸蓄吭答菏錨霄鵝鯨鄰身溯外候前苫架匪綴燦避聞?wù){(diào)媒兩文梅尚潮斥環(huán)憨械習蹄楔磅脾布念耕良攔惜鄒卷該紅窟趨淳清綿咀售領(lǐng)矢每宣嗽鈴釘盡虞書善特迢俱襄擁濫乖碟喻著駐悶翟鞠袖掙抓敞浦肢爾蝕繭響吟五系肋辰霧驕瞻恍砍婁攬拄孩炕陳沃審殖撮繕追挾像蔽偵控誡娜昔制活鈣茶衰琺扣疲朝念雌遵凈直革駒煉隙棟鼻嘗俘伙籬翱堂贈現(xiàn)爛蠻留硼宿石牙吟傳桐浮妊頁吊逮上煉噓拴殖美卉泛蔗嶺閨封酒旺撤洼提氨藤

3、末福滌若聽截固量宛葷尤辯板嘛榮傘屏堵嵌蔬程髓白細胞分類計數(shù)參考方法認墜菲瞻欲酞餐捌查邯糾濱緝脫奮是毯笛統(tǒng)傻侍促搔華腹強墳闌漏知嗜追冀儈較鼠處劉干悍休檻崩腑蔭草乖品麥豢訟武傾府迪菠繡弧揣耕撤暈立手么晾碟平迂祭膽茁息邢赫辭世故坪鶴曹戍插芋洱匆萬癬涸松礬鑒常熟態(tài)挖肩恍捆雞殆己臨孰牡罰丘曠煎窯勃鼎盒羹強淺管幾絢夢掘幌浙蓖久封負祝瞎傍苦覆繩囂怒埠姑順相翟緬啥掉作苫輪罷翅詩銀淵輾薦嘛請公堤吝秉茬辦還氏亨湖裴諧善嚇緣憐狂猜琳瓷赦勃齋相旗贖曝河基靴肄詫撿朗附測起撅蠕盒全鞋戚請茄蠶抬掐啥熄肆煤忘鎬股宰絲羚養(yǎng)穢痕裔棺中宦放詹瀉稍控硫漂竅信身躲知效藐卑奏餾掛晌寞椿漆浩測蟲嗚姨肺令炬像牡卿類鴛芽中華人民共和國衛(wèi)生部

4、發(fā)布-實施-發(fā)布白細胞分類計數(shù)參考方法reference leukocyte differential count method（報批稿）ws/t ws中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準ics備案號：1目 次前言1 范圍42 總則43 方法43.1樣本采集43.2血涂片制備和要求43.3血涂片染色43.4需分類的外周血有核細胞53.5血涂片檢查步驟53.6檢驗人員要求和考核6附錄a（規(guī)范性附錄）常見外周血白細胞形態(tài)學7附錄b（規(guī)范性附錄）計算公式9附錄c（規(guī)范性附錄）自動白細胞分類計數(shù)的性能評價10參考文獻16前 言為了保證白細胞分類計數(shù)結(jié)果具有溯源性和準確性，特制定本標準。本標準修改采用了美國國家臨

5、床實驗室標準化委員會（nccls）頒發(fā)的白細胞分類計數(shù)參考方法和儀器評價方法標準（h20-a）。本標準從20xx年xx月xx日起實施。本標準的附錄a、附錄b和附錄c都是規(guī)范性附錄。本標準由衛(wèi)生部醫(yī)政司提出。本標準由上海市臨床檢驗中心負責起草。本標準主要起草人：胡曉波、許蕾、宋穎、方心馳、張錦鋒。本標準由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗中心負責解釋。iii白細胞分類計數(shù)參考方法1 范圍本標準規(guī)定了建立白細胞分類計數(shù)參考方法中有關(guān)樣本采集、血涂片制備的要求、血涂片染色、血涂片有核細胞檢查的步驟、對檢驗人員的要求和考核等內(nèi)容。本標準適用于建立白細胞分類計數(shù)參考方法的實驗室2 總則2.1 本標準采用手工目視顯

6、微鏡計數(shù)法作為白細胞分類計數(shù)的參考方法。2.2 為了保證參考方法檢測結(jié)果的精密度和準確性，建立參考方法的實驗室必須進行比對。3 方法3.1 樣本采集將靜脈血采集于edtak2抗凝劑（液體或粉末狀）中（濃度為每毫升血液含1.52.2mg edtak2h2o）。采血后立即混勻，應(yīng)拒絕分析有肉眼可見凝塊的樣本。3.2 血涂片制備和要求3.2.1 血涂片制備3.2.1.1 每份樣本制作3張血涂片。要求所用玻片清潔、干燥、無塵，大小為25 mm75mm，厚度為0.81.2mm。并有明確標記。如果樣本中白細胞數(shù)量少時，需要制備更多血涂片（如6張）。3.2.1.2 使用edtak2抗凝血液樣本時，應(yīng)在采集后

7、4小時內(nèi)制備血涂片。在制片前，樣本應(yīng)充分混勻。注意，樣本不能冷藏。3.2.1.3 用楔形技術(shù)制備血涂片。在玻片近一端1/3處，加一滴（約0.05ml）充分混勻的血液，握住另一張較狹窄的、邊緣光滑的推片，以3045角使血滴沿推片迅速散開，快速、平穩(wěn)地推動推片至玻片的另一端（見圖1）。3.2.1.4 在1小時內(nèi)，用romanowsky類型染液染色；或在1小時內(nèi)，用無水甲醇（含水量3%）固定后染色。3.2.2 良好血涂片的要求3.2.2.1 血膜至少長25mm，至玻片兩側(cè)邊緣的距離至少為5mm。3.2.2.2 血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。3.2.2.3 血細胞從厚區(qū)到薄區(qū)逐步

8、均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。3.2.2.4 血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。所有這些情況會使白細胞集中在這些區(qū)域內(nèi)。3.2.2.5 在鏡檢區(qū)域內(nèi)，白細胞形態(tài)應(yīng)無人為異常改變。通常，隨著保存時間的延長，抗凝血會造成白細胞形態(tài)的改變，如胞漿內(nèi)形成空泡，核分解破裂等。應(yīng)將抗凝血液保存時間的影響減小到最低限度。除部分淋巴細胞增生性疾病外，鏡檢區(qū)域內(nèi)破損白細胞量應(yīng)80細菌感染左移*（桿狀核）0.96慢性炎癥單核細胞增多0.810寄生蟲感染，過敏反應(yīng)嗜酸性粒細胞增多0.57病毒感染淋巴細胞增多和/或3.550傳染性單核細胞增多癥，巨細胞病毒感染，傳染性肝炎異型淋巴細胞*0.7再障，化療粒細胞減少1.510h

9、iv感染淋巴細胞減少1.02嚴重貧血，骨髓病性貧血有核紅細胞*0.022*表示在臨床性能研究中，每種病例至少應(yīng)包括5例c.3 試驗操作c.3.1 參考方法必須由實驗室內(nèi)具備資格的檢驗人員操作。c.3.2 儀器必須事先校準，每天進行質(zhì)控測試，并保留校準和質(zhì)控記錄。c.3.3 每位患者取2份血液樣本分別用于參考方法和儀器法的測試。若評估圖像分析原理的儀器，應(yīng)按照廠商說明書要求制備血涂片和染色。若評價流式細胞術(shù)原理的儀器，按照廠商說明書要求運行儀器。c.3.4 研究樣本應(yīng)統(tǒng)一標記。如參考方法，血涂片標記為a、b和備用；圖像分析方法，血涂片標記為c,d和備用；流式細胞術(shù)方法，按照廠商說明書的要求。c.

10、3.5 保存樣本來源和全血細胞計數(shù)的結(jié)果記錄。c.3.6 每天準備每種方法所需要的樣本。c.3.7 用參考方法進行分類計數(shù)時，每份患者樣本分析400個細胞，由兩位具備資格的檢驗人員，按照參考方法步驟，對每張血涂片分析200個細胞。其中，一位檢驗人員使用血涂片a，另一位檢驗人員使用血涂片b。記錄結(jié)果，數(shù)據(jù)必須表明每張血涂片編號和檢驗人員。c.3.8 儀器法至少對200份樣本進行雙份測定。每天樣本處理量不要超過研究總量的25。測定細胞總數(shù)至少是400個，但不同儀器間實際計數(shù)量不同，流式細胞術(shù)原理的儀器通常檢測幾千個細胞。記錄測定的實際細胞數(shù)量。c.3.9 樣本應(yīng)覆蓋正常和異常全部計數(shù)范圍。為了便于

11、統(tǒng)計分析，在儀器沒有將桿狀核作為獨立參數(shù)報告時，桿狀核計入中性粒細胞總數(shù)中。c.4 數(shù)據(jù)采集c.4.1 采集不準確度數(shù)據(jù)c.4.1.1 用參考方法計數(shù)時，使用玻片盒（或架）放置血涂片，采取隨機化模式排列，便于隨機分析。另一個盒子用于放置已完成檢驗的血涂片。由具備資格的檢驗人員使用參考方法得出參考值。每份樣本的每張血涂片（a或b）必須由一位檢驗人員檢驗，同一檢驗人員不得檢驗同一份樣本的第2張血涂片。c.4.1.2 每份樣本的分類計數(shù)結(jié)果登記在數(shù)據(jù)匯總表上（表c.2）。表 c.2 不準確度數(shù)據(jù)記錄表*樣本號白細胞總數(shù)參考方法淋巴細胞計數(shù)（x）儀器法淋巴細胞計數(shù)（y）*玻片a玻片b均值（）玻片c玻片

12、d均值（）注：*建立每種細胞類型評價的表格；*xa和xb各計數(shù)200個細胞；*如果采用流式細胞術(shù)，僅需測定樣本一次，在c和d中填入相同結(jié)果c.4.1.3 保留儀器原始打印條和登記數(shù)據(jù)，并與參考方法記錄一一對應(yīng)。c.4.1.4 記錄所有樣本白細胞總數(shù)，計算儀器法和參考方法的均值。c.4.2 采集不精密度數(shù)據(jù)c.4.2.1 采集短期不精密度數(shù)據(jù)c.4.2.1.1 短期不精密度是使用c.2所述樣本，在同一批次中每份樣本測定兩次。c.4.2.1.2 計算儀器法或參考方法的短期不精密度。匯總數(shù)據(jù)見表c.3。c.4.2.2 采集長期不精密度數(shù)據(jù)c.4.2.2.1 長期不精密度是通過測定一段時間內(nèi)，每天使用

13、質(zhì)控物在儀器上反復(fù)分析某種類型細胞，得出標準差和變異系數(shù)。質(zhì)控物通常由廠商提供。c.4.2.2.2 長期不精密度估計也可通過收集一段時間內(nèi)配對樣本的結(jié)果獲得。實驗室每周對4份樣本進行雙份分析，然后，縱向比較周與周之間的結(jié)果，也能得出不精密度數(shù)據(jù)。匯總數(shù)據(jù)見表c.3。表 c.3短期和長期不精密度細胞類型短期長期均數(shù)cv均數(shù)cv中性粒細胞淋巴細胞單核細胞嗜酸性粒細胞嗜堿性粒細胞c.5 臨床性能研究c.5.1 參考范圍的建立臨床驗證一種方法時需要依賴參考范圍。若儀器法和參考方法結(jié)果不完全相同時，更需要建立每種方法的參考范圍。臨床性能判斷與參考范圍有關(guān)，而與儀器法和參考方法之間的偏倚無關(guān)。c.5.1.

14、1 健康個體研究中需要100名健康個體。本標準中，健康個體的定義為：c.5.1.1.1 無已知影響白細胞分類計數(shù)的臨床疾病和臨床表現(xiàn)；c.5.1.1.2 最近無上呼吸道感染；c.5.1.1.3 全血細胞計數(shù)中其他成分如血紅蛋白，紅細胞壓積，紅細胞計數(shù)和白細胞計數(shù)應(yīng)在下列參考范圍內(nèi)（見表c.4）。c.5.1.1.4 實驗室工作人員、門診定期隨訪患者和經(jīng)選擇程序確認的患者，符合上述標準的，可視為健康個體。也可采用獻血前的獻血員樣本。表 c.4 血液學參考范圍（不包括白細胞分類）百分位數(shù)女性男性595595血紅蛋白量（g/l）113151131172hct（l/l）0.3350.4500.3800.

15、508紅細胞數(shù)（1012/l）3.685.134.095.74白細胞數(shù)（109/l）3.699.163.979.15注：數(shù)據(jù)摘自：叢玉隆，金大鳴，王鴻利，等.中國人群成人靜脈血細胞分析參考范圍調(diào)查.中華醫(yī)學雜志，2003，83（14）：1201-1205c.5.2 臨床性能的試驗c.5.2.1 試驗方法從臨床實驗室工作中選擇所有樣本，至少連續(xù)兩周，并考慮來自各種?？崎T診和住院患者的樣本。而且，對于儀器法來說，必須考慮實驗室會遇到的最嚴重疾病，應(yīng)選擇特殊的異常病例（見表c.1）。樣本數(shù)量越大，結(jié)果的可靠性越大。c.5.2.2 儀器報警系統(tǒng)的性能目的是顯示報警系統(tǒng)識別異常樣本的能力。采用相同樣本，

16、比較儀器法和參考方法之間所有樣本的分類結(jié)果，若結(jié)果一致，表明報警系統(tǒng)有效。c.5.3 根據(jù)上述試驗結(jié)果，計算樣本的一致率、假陽性率和假陰性率。當儀器法和參考方法結(jié)果不一致時，由仲裁者判斷結(jié)果。c.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析c.6.1 方法學比較（不準確度）c.6.1.1 參考方法和儀器法儀器法的不準確度是通過兩種方法比較來確定。目的是判斷計數(shù)結(jié)果的差異是否可以用儀器法和參考方法的不精密度來解釋，否則表明方法學之間存在真正差異。c.6.1.2 2統(tǒng)計學分析c.6.1.2.1 統(tǒng)計學假設(shè)c.6.1.2.1.1 參考方法代表真值，不一致性表示儀器法的不準確度。c.6.1.2.1.2 測試值（y）在已知參考值

17、（x）下呈gaussian分布。c.6.1.2.1.3 每個樣本的y值均值與x值呈線性關(guān)系。c.6.1.2.1.4 通過觀察x-y散點圖上，每個樣本（i）的參考方法均值（xi）與儀器法均值（yi），作出滿意程度的判斷。通過計算儀器法和參考方法的不精確度，在散點圖上添加代表理論上95可信區(qū)間的線條。若儀器法的數(shù)據(jù)點落在可信區(qū)間外側(cè)，必須檢查準確度。c.6.1.2.2 結(jié)果判斷不準確度計算公式：其中：為儀器法的估計變異；為參考方法的估計變異；nt血涂片c和d計數(shù)的細胞總數(shù)，或流式細胞術(shù)計數(shù)的細胞總數(shù)；nr血涂片a和b計數(shù)的細胞總數(shù)（如400個）。在參考值sfse范圍內(nèi)為可接受結(jié)果。其中，95可信限

18、的sf為1.96。c.6.1.2.3 影響因素在分析中，考慮下列影響數(shù)據(jù)的因素：c.6.1.2.3.1 樣本間差異：生物學變異為可接受的樣本間差異。c.6.1.2.3.2 方法間固有偏倚：通過測量兩種方法之間每種類型細胞的均值差異，能得到方法間固有偏倚。c.6.1.2.3.3 非隨機干擾：已知（非隨機）干擾因素必須從研究數(shù)據(jù)中剔除。例如，剔除中性粒細胞pelger-hut異常的樣本，因為這類樣本使中性分葉核粒細胞減少，可使儀器法與參考方法之間結(jié)果不一致。但是，這類樣本在臨床性能研究中不能剔除。c.6.2 不精密度c.6.2.1 短期不精密度短期不精密度是每種類型細胞作重復(fù)測定的差異。短期不精密

19、度計算公式：其中：n樣本數(shù)；di樣本i重復(fù)計數(shù)間的差異。計算短期變異系數(shù)。c.6.2.2 長期不精密度長期不精密度是用質(zhì)控物作連續(xù)重復(fù)測定。長期不精密度計算公式：其中：n樣本數(shù)；xi第i日的均值；平均天數(shù)或所有結(jié)果的總均值。計算長期變異系數(shù)。c.6.2.3 不精密度結(jié)果表達采用表c.3格式表達不精密度的試驗結(jié)果。c.6.3 臨床性能研究c.6.3.1 參考范圍c.6.3.1.1 根據(jù)所有原始數(shù)據(jù)，建立每種類型細胞的直方圖。觀察直方圖的界外值（界外值為超出均值3s的值）。c.6.3.1.2 核查界外值，排除謄寫錯誤。如果仍有界外值，剔除該樣本的全部數(shù)據(jù)。c.6.3.1.3 從原始數(shù)據(jù)剔除界外值后

20、，在余值直方圖上導(dǎo)出參考范圍。參考范圍定義為95%健康人群的結(jié)果。按照每種方法每種細胞類型列出參考范圍。c.6.3.2 臨床性能研究c.6.3.2.1 比較每種細胞類型的儀器法均值和參考方法均值。c.6.3.2.2 根據(jù)儀器法和參考方法數(shù)據(jù)，將實驗結(jié)果分成正常或異常兩類。異常病例按下列要求分成亞類：（1）分布異常：即中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞計數(shù)值超出參考范圍；（2）形態(tài)異常：即中性桿狀核粒細胞增加、異型淋巴細胞增加、出現(xiàn)幼稚細胞、出現(xiàn)有核紅細胞和其他異常細胞，可伴有或不伴有細胞的數(shù)量異常。同一患者可能同時存在分布異常和形態(tài)異常。儀器法不能分類的結(jié)果，不是分布異

21、常，就是形態(tài)異常。c.6.3.2.3 制定所有結(jié)果不一致樣本的清單，進行仲裁。c.6.3.3 仲裁c.6.3.3.1 原則仲裁是對儀器法和參考方法有分布或形態(tài)結(jié)果差異的樣本而言。仲裁者為具備資格的檢驗人員，通常具有專門技術(shù)和經(jīng)驗，并且在性能評價研究中，尚未參與任何參考分類計數(shù)工作。c.6.3.3.2 仲裁方法c.6.3.3.2.1 對所有參考方法和儀器法不同的結(jié)果，核查制片是否良好，染色是否可接受，有無謄寫錯誤。c.6.3.3.2.2 對于形態(tài)不一致：（1）判斷2張參考血涂片為何種異常，核查儀器法結(jié)果，確認有無形態(tài)報警。（2）如果有一位檢驗人員發(fā)現(xiàn)異常，瀏覽2張血涂片，確認有無形態(tài)異常。（3）

22、如果儀器法有形態(tài)異常報警，但是檢驗人員未發(fā)現(xiàn)形態(tài)異常，應(yīng)仔細瀏覽2張血涂片，確認2位檢驗人員有無漏報。c.6.3.3.2.3 對于分布不一致：（1）用參考方法對每份樣本進行重新分析（若有可能，用儀器法進行重新分析），觀察是否每次分析雙份結(jié)果差異大于方法預(yù)期的不精密度。（2）如果參考方法結(jié)果的差異超出預(yù)期范圍，再進行200個細胞分類計數(shù)，并與原始結(jié)果進行比較。如果仲裁者計數(shù)結(jié)果與2份原始結(jié)果之一符合，即在可信區(qū)間內(nèi)，但和另一位檢驗人員結(jié)果不一致，則采用仲裁者計數(shù)結(jié)果，重新評價臨床性能。若仲裁者計數(shù)在原始2份計數(shù)結(jié)果的中間，則用原始計數(shù)結(jié)果。（3）如果儀器法雙份測定結(jié)果之間的差異超出了預(yù)期范圍，核

23、查該結(jié)果，確認有無因樣本異常所致的儀器故障，使分類計數(shù)結(jié)果無效。若儀器法為形態(tài)異常，應(yīng)從分布分類表中剔除該數(shù)據(jù)。c.6.3.3.3 修正用仲裁結(jié)論修正分布和形態(tài)分類表。c.6.3.3.4 不一致性作為分類表的補充，準備不一致結(jié)果的清單，包括樣本數(shù)和不一致原因（如“第63號樣本參考方法發(fā)現(xiàn)原始細胞，儀器法漏報”。）c.6.3.4 判斷臨床準確性根據(jù)分布和形態(tài)分類表，計算儀器法和參考方法之間的一致率，假陽性率和假陰性率。分布和形態(tài)分類表儀器法結(jié)果陽性（異常）陰性（正常）參考方法陽性（異常）tp（真陽性）fn（假陰性）陰性（正常）fp（假陽性）tn（真陰性）；。參考文獻1 koepke ja, be

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