儀器分析實(shí)驗(yàn)

1、儀器分析試驗(yàn)講義（第二版） 授課人：李 蓉 王小剛 西北大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系 2004 年 6 月編制 實(shí)驗(yàn)一 鄰二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解 752 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的構(gòu)造和使用方法。2掌握鄰二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵的方法。（1）吸收曲線的測(cè)繪；（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪；（3）未知樣中鐵含量的測(cè)定；二原理圖 1-1 分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖1- 光源 2- 進(jìn)光狹縫 3 ，6- 反射鏡 4 ，7- 透鏡 5- 棱鏡8- 出光狹縫 9- 比色皿 10- 光電調(diào)節(jié)器 11- 硒光電池 12- 檢流計(jì) 1分光光度法及其測(cè)量的條件 : 分光光度法主要利用的是物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收，按照郎 伯

2、-比爾定律，在一定的線性范圍內(nèi)（即濃度范圍內(nèi)）找出吸光度A與物質(zhì)含量之間的定量關(guān)系。主要受顯色條件和測(cè)量吸光度條件的影響，其中顯色條件主要與顯色劑的用量、介 質(zhì)的酸度、顯色溫度、顯色時(shí)間以及干擾離子的消除等有關(guān)；而測(cè)量吸光度的條件則與入 射波長(zhǎng)入吸光度范圍以及參比溶液等有關(guān)。2 鄰二氮雜菲-亞鐵配合物：在顯色前，首先用鹽酸羥胺把 Fe3+離子還原為Fe2+離子，其反 應(yīng)式如下：在pH=2-9的條件下，F(xiàn)e2+離子與鄰二氮雜菲生成極穩(wěn)定的橘紅色配合物，其反應(yīng)式如下：該配合物的IgK穩(wěn)=21.3，摩爾吸光系數(shù)&10= 1.1 X104。測(cè)定時(shí)，溶液酸度控制在pH=5.0，以避免酸度過(guò)高導(dǎo)致反應(yīng)速度

3、過(guò)慢，酸度過(guò)低 Fe2+ 離子水解，從而影響顯色；此外，若溶液中存在著可與顯色劑生成沉淀（ Bi 3+、Cd2+、Hg2+、 Ag+、Zn2+）或有色配合物（CeT、CiT Ni2+）的離子時(shí)，應(yīng)注意它們的干擾作用。三752 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用1 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，使儀器預(yù)熱 20 分鐘；2按“方式鍵”（ MOD）E 將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式；3按“波長(zhǎng)設(shè)置”鍵（p,o）設(shè)置想要的分析波長(zhǎng)；4. 打開(kāi)樣品室蓋，將盛有參比和被測(cè)溶液（約 2.5 cm ）的比色皿分別插入 比色槽中，蓋上樣品室蓋；5. 將參比溶液推入光路中，按“100%T鍵調(diào)整零ABS6. 將被測(cè)溶液拉入到光路中，此時(shí)顯示器

4、上所顯示的是被測(cè)樣品的吸光度值。四. 試劑10卩g/mL的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液；10%勺鹽酸羥胺溶液；0.1%的鄰二氮雜菲溶液；1 mol/L NaAc 溶液。五. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 吸收曲線的測(cè)繪：準(zhǔn)確移取10卩g/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入10%盃 酸羥胺溶液1 mL，搖勻，稍冷，加入1 mol/L溶液5 mL和0.1%鄰二氮雜菲溶液3 mL，以 蒸餾水稀釋至刻度，在 752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，用比色皿以蒸餾水為參比溶液，用不 同的波長(zhǎng)從570 nm開(kāi)始到430 nm為止，每隔10或20 nm測(cè)定一次吸光度（其中從530-490 nm每隔10 nm測(cè)一次）。然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸

5、光度為縱坐標(biāo)繪制出吸收曲線，從吸收 曲線上確定該測(cè)定的適宜波長(zhǎng)。2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪：取50 mL容量瓶6只，分別移取10卩g/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL于 5只容量瓶中，另一容量瓶中不加鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后各加 1 mL10%鹽 酸羥胺，搖勻，經(jīng) 2 min 后，再各加 5 mL 1 mol/L NaAc 溶液及 3 mL 0.1%鄰二氮雜菲，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計(jì)上，用比色皿在最大吸收波長(zhǎng)(510 nm處，測(cè)定各溶液的吸光度。以鐵含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3未知液中鐵含量的測(cè)定：吸取 5 mL未知液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟均同上

6、，測(cè)定吸光 度。由未知液的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出5 mL未知液中的鐵含量，然后以每毫升未知液中含鐵多少微克表示結(jié)果。六. 記錄及分析結(jié)果比色皿： 光源電壓：(1)吸收曲線的測(cè)繪波長(zhǎng)/ (nm)吸光度A570550 530520510500490470450430(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪與鐵含量的測(cè)定試液編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液的量/mL總鐵含量/卩g吸光度10022.02034.04046.06058.080610.0100未知液七. 課堂提問(wèn)1 鄰二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵的原理、反應(yīng) pH條件、用什麼控制酸度、加 NHOH-HCI的 目的？2為什麼繪制吸收曲線？為什麼在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定？每改變：用參比液進(jìn)

7、行重新調(diào)零？3為什麼繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線？如何繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線？是否每測(cè)一點(diǎn)必須用參比液進(jìn)行調(diào)零？實(shí)驗(yàn)二 醋酸的電位滴定（間接電位法）一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握用酸堿電位滴定法測(cè)定醋酸的原理和方法。2. 學(xué)會(huì)用二階微商法計(jì)算終點(diǎn)體積（V終點(diǎn)）的方法。3. 學(xué)會(huì)用電位滴定法測(cè)定和計(jì)算 HAC電離常數(shù)的原理和方法。二. 原理圖2-1電位滴定儀器裝置1-滴定管2-滴定池3-指使電極4-參比電極 5-攪拌棒6-電磁攪拌器 7-電位計(jì)1. 二階微商法計(jì)算終點(diǎn)體積（V終點(diǎn)）：在酸堿滴定的過(guò)程中，利用酸堿中和反應(yīng)，隨著滴定劑的不斷加入，被測(cè)物與滴定劑發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，溶液的批pH值不斷變化。由加入滴定劑的體積V和測(cè)得的pH

8、值，可繪制：2pH/V-V滴定曲線。根據(jù)等當(dāng)點(diǎn)時(shí)，二階微商值等于 零，計(jì)算出滴定終點(diǎn)時(shí)所消耗的終點(diǎn)體積（V終點(diǎn)）。2. HAC電離常數(shù)的測(cè)定：醋酸在水溶液中的離解如下HAc= HAc其離解常數(shù)Ka =兇AcHAc當(dāng)醋酸被NaOHS定了一半時(shí)，溶液中根據(jù)上式，此時(shí)H =Ka或pH = pKa ；由此可知，醋酸電離常數(shù) Ka的負(fù)對(duì)數(shù)值，就等于NaOHS定一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH值。三. PHS-2型酸度計(jì)的使用1. 在去離子水中過(guò)夜浸泡玻璃電極使電極活化；2. 安裝電極，調(diào)節(jié)零點(diǎn)；3. 用鄰苯二甲酸氫甲標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=4.0）校準(zhǔn)儀器；4. 用蒸餾水洗凈電極；5將玻璃電極和甘汞電極插入到待測(cè)溶液中，

9、測(cè)量溶液的pH值四. 儀器和試劑1. 儀器：PHS-2型酸度計(jì)一臺(tái)；玻璃電極及飽和甘汞電極各一支。2. 試劑：0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mol/L 醋酸，鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液。五. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. HAC電位滴定過(guò)程中溶液pH值的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.1 mol/L HAC溶液20 mL于150 mL燒杯中，用蒸餾水稀釋至約100 mL,加入酚酞2滴，放入電極及鐵芯攪拌棒，開(kāi)動(dòng)電磁攪 拌器，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，測(cè)量并記錄消耗的 NaOH溶液的體積（VNaoH和相對(duì)應(yīng)的溶液pH值。上述滴定實(shí)驗(yàn)做1次2 .計(jì)算滴定終點(diǎn)時(shí)消耗的NaOH溶液的體積數(shù)（V終點(diǎn)

10、）:（內(nèi)插法）V終V宀“彳亠 汽壯叫_會(huì)終點(diǎn)了厶PH ）pH ） IKV ）1 2終點(diǎn)3.計(jì)算HACK準(zhǔn)確濃度（Gac）:其中GaOH為準(zhǔn)確標(biāo)定后的NaOH勺濃度4. 計(jì)算HAC勺pKa值（終點(diǎn)時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值）：PK a = PHV 2 -V 12V終點(diǎn)（內(nèi)插法）六. 記錄及分析結(jié)果VNaOl/mLpHpH/ V2七. 課堂提問(wèn)1二階微商法確定滴定終點(diǎn)的方法原理？2. 為什麼鄰苯二甲酸氫甲溶液也可作為緩沖溶液？ 實(shí)驗(yàn)三 水的pH測(cè)定（直接電位法）一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解電位法測(cè)定水的pH值的原理與方法。2. 學(xué)習(xí)酸度計(jì)的使用方法。.原理圖3-1玻璃電極測(cè)定pH的工作電池示意圖1. 玻璃電極與甘

11、汞電極插入到被測(cè)溶液中組成原電池：在一定條件下，測(cè)得電動(dòng)勢(shì)L）HH（的關(guān)嚟KCl （飽和）Hg2Cl2Hg但因式中K無(wú)法測(cè)得，因此在實(shí)際工作中，用酸度計(jì)測(cè)定溶液的 pH值時(shí)，首先必須用 已知pH值的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液來(lái)校正酸度計(jì)（即“定位”），根據(jù)上式測(cè)得測(cè)定液的相對(duì)pH值。校正時(shí)應(yīng)選用與被測(cè)溶液 pH值相接近的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液， 以減少在測(cè)量過(guò)程中可能由于液接電位、不對(duì)稱電位以及溫度變化等引起的誤差。嚴(yán)格 地講，一支電極應(yīng)用兩種不同pH值的緩沖溶液校正，在用一種 pH值的緩沖溶液定位 后，測(cè)第二種緩沖溶液的pH值時(shí)，誤差應(yīng)在0.05之內(nèi)。校正后的酸度計(jì)可直接用來(lái)測(cè) 量水或其他溶液的pH值。三. 221

12、型玻璃電極的使用1. 在去離子水中過(guò)夜浸泡玻璃電極使其活化；2. 將玻璃電極和甘汞電極插入到標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中溶液中，進(jìn)行pH值的校正；3. 用校正后的酸度計(jì)測(cè)量水溶液的 pH值。四. 儀器和試劑1. 儀器：25型酸度計(jì)或PHS-29A型酸度計(jì)一臺(tái)；221型玻璃電極及222型飽和甘汞電極各一支；100 mL燒杯4只2 試劑：pH=4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（20C）。標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液通常能穩(wěn)定兩個(gè)月，其 pH隨溫 度不同稍有差異。五. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 將電極和燒杯用蒸餾水沖洗干凈，用pH=4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液淌洗電極1-2次，電極用濾紙吸干；2 用pH=4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正酸度計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液用完后，

13、可倒回原試劑瓶，反復(fù)使用。3用水樣將電極淌洗4-5次后，測(cè)量水樣，由儀器刻度表上讀取 pH值，重復(fù) 測(cè)量三次。4. 測(cè)量完畢后，將電極和燒杯沖洗干凈，妥善保管。六. 記錄及分析結(jié)果一量次數(shù)測(cè)量?jī)?nèi)容123pH個(gè)別絕對(duì)偏差相對(duì)平均偏差七. 課堂提問(wèn)1. 電位法測(cè)定水的pH值原理？2. 酸度計(jì)為什麼要用已知pH的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正？3. 玻璃電極在使用前應(yīng)如何處理？為什麼？實(shí)驗(yàn)四水中微量氟的測(cè)定（離子選擇電極法）一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解用F離子選擇電極測(cè)定水中微量氟的原理與方法。2. 了解總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖溶液的意義和作用。3 .掌握標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水中微量 F-離子的方法。二. 原理圖4-1氟離子測(cè)量

14、裝置1. 氟離子電極：氟離子電極（LaF3單晶敏感膜電極，內(nèi)裝0.1 mo/L NaCI-NaF內(nèi)參比溶液 和Ag-AgCI內(nèi)參比電極）是一種電化學(xué)傳感器，它將溶液中F離子的活度轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電 位。當(dāng)氟電極插入溶液時(shí)，其敏感膜對(duì) F-離子產(chǎn)生響應(yīng)，在膜和溶液間產(chǎn)生一定的膜電位：當(dāng)氟電極（指示電極）與飽和甘汞電極（參比電極）插入被測(cè)溶液中組成原電池時(shí)， 電池的電動(dòng)勢(shì)E與F-離子活度的關(guān)系當(dāng)加入TISAB（總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖溶液）時(shí)，由于離子活度系數(shù) 丫為一定值，則電動(dòng) 勢(shì)E則與F離子濃度有如下的關(guān)系：2 標(biāo)準(zhǔn)加入法：當(dāng)試液為離子強(qiáng)度比較大的金屬離子溶液，且溶液中存在絡(luò)合劑，若要測(cè) 定金屬離子的總

15、濃度（包括游離的和絡(luò)合的），則應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。該法是在原待測(cè)試樣（待測(cè)離子總濃度為Cx，體積為V。）中，加入少量體積（Vs約為原試液體積的1/100）高濃 度（Cs約為Cx的100倍）的待測(cè)離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后試樣濃度的增加量c,以及標(biāo)準(zhǔn)溶液加入前后電動(dòng)勢(shì)的差值 AE,推算出待測(cè)金屬離子的總濃度 Cx。該法的優(yōu) 點(diǎn)是僅需一種標(biāo)準(zhǔn)溶液，操作簡(jiǎn)單快速，適用于組成比較復(fù)雜，份數(shù)較少的試樣。三. 7601型氟電極的使用1 在去離子水中過(guò)夜浸泡氟電極使其活化；2. 用去離子水洗到空白電位（匕）為300 mV左右。3. 將氟電極和甘汞電極插入到待測(cè)溶液中，測(cè)量溶液的E值。四. 儀器和試劑1

16、. 儀器：7601型氟電極；232或222型甘汞電極；電磁攪拌器。2. 試劑：0.1000 mo/L氟標(biāo)準(zhǔn)溶液；TISAB （總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖溶液）。五. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水中微量 F離子的濃度：1. 準(zhǔn)確吸取50 mL F離子試液于100 mL容量瓶中，加入10 mL TISAB溶液，用去離子水稀 釋至刻度，搖勻，吸取50 mL于燒杯中，測(cè)定E。2 .在上述試液中準(zhǔn)確加入 0.5 mL（V）濃度約為10-2 mol/L（C s）的氟標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，繼續(xù)測(cè) 定E2。3. 在測(cè)定過(guò)E2的試液中，力卩5 mL TISAB溶液及45 mL去離子水，混勻，測(cè)定巳。4. 計(jì)算水中微量F離子的濃度

17、（Cx）：六. 記錄及分析結(jié)果EoEiEE3CS七. 課堂提問(wèn)1 用氟電極測(cè)定F-離子濃度的原理是什麼？2 . TIASB包含哪些組分？各組分的作用怎樣？3 .標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水中微量 F離子的原理實(shí)驗(yàn)五苯系物的分析（定性與定量）一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握SP-2100型氣相色譜儀的操作和苯系物的分析。2. 掌握用保留值定性的方法。3. 學(xué)習(xí)色譜校正因子的測(cè)定。4. 學(xué)習(xí)面積歸一化法計(jì)算各組分的含量。二. 原理圖5-1氣相色譜分析流程圖1-載氣鋼瓶2-減壓閥3-凈化干燥器 4-針形閥5-流量計(jì)6-壓力表7-進(jìn)樣器、氣化室 8-色譜柱9-檢測(cè)器10-放大器11-記錄儀1 .氣相色譜定性、定量原理（面

18、積歸一化法）：定性原理：利用物質(zhì)在氣固或氣液兩相中的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離的分析方法，稱之 為氣相色譜法；按照同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時(shí)間（tR） 致，進(jìn)行氣相色譜的定性 分析。定量原理：確定各組分百分含量的方法，稱之為氣相色譜的定量。根據(jù)樣品洗脫情況， 通常的定量方法分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和面積歸一化法三種。當(dāng)混合樣中所有組分均被洗脫 時(shí)，可用面積歸一化法計(jì)算各組分的含量，其計(jì)算公式如下所示： 其中fi為相對(duì)校正因子，其值大小等于某物質(zhì)的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子 的比值：2 苯系物：苯系物指苯、甲苯、乙苯等混合物，在本實(shí)驗(yàn)中使用有機(jī)皂土配入適量的鄰苯 二甲酸二壬酯作固定液，氫氣作載

19、氣，在適當(dāng)?shù)纳V條件下（柱溫、進(jìn)樣器溫度、檢測(cè)器溫度、熱絲溫度、橋電流、載氣流速等），能將各組分分開(kāi)，其色譜圖如圖 4-2所示。圖4-2苯系物色譜圖1- 苯；2-甲苯；3-乙苯三. SP-2100型氣相色譜儀的操作1 儀器的操作及參數(shù)的設(shè)定i .通載氣：打開(kāi)H2瓶總閥，輸出壓力調(diào)為0.4 MPa調(diào)節(jié)儀器氣路箱版面的兩路載氣穩(wěn) 壓閥，以獲得TCD僉測(cè)器的流量；ii .通電：打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)；iii .檢查或設(shè)定儀器的工作參數(shù)：A）設(shè)定柱箱溫度、進(jìn)樣器溫度、TCD僉測(cè)器溫度；待儀器顯示“就緒 后，設(shè)定熱絲溫度、放大、極性；B）操作條件參數(shù)TCD檢測(cè)器柱箱溫度60 C進(jìn)樣器溫度90 CTCD檢測(cè)器溫度1

20、10 C熱絲溫度C橋電流130 mA放大10極性正載氣流速Ha：50 mL/min進(jìn)樣量1pLiv .穩(wěn)定儀器：先調(diào)零點(diǎn)平衡粗調(diào)（調(diào)節(jié)氣路板面后方的多圈電位器），將輸出調(diào)在土100 mV以內(nèi)。檢測(cè)器達(dá)到熱平衡后，然后再按面板上的“調(diào)零”按鍵將基線調(diào)零；2. 進(jìn)樣：當(dāng)基線足夠穩(wěn)定時(shí)，即可進(jìn)樣分析；i .用去離子水徹底清洗10丄微量注射器；ii .用幾微升樣品溶劑潤(rùn)洗注射器 2-3次；iii 用注射器從樣品容器中慢慢抽出幾微升樣品，取出注射器，將注射器的推桿仔細(xì) 地推倒1丄刻度處（注意將氣泡排出）；iv.將注射器的針頭全部插入到進(jìn)樣器中，迅速進(jìn)樣并拔出注射器，同時(shí)按下數(shù)據(jù)處 理裝置的“啟動(dòng)”按鈕，

21、開(kāi)始采集并顯示譜圖；3 譜圖的采集及數(shù)據(jù)處理i 譜圖的采集：A“文件”“工作目錄”，在彈出的對(duì)話框中選擇某一文件夾作為程序的工作目錄；B）“文件”“新建”；C）在“譜圖參數(shù)表”的“信號(hào)通道”里選擇譜圖信號(hào)的采集通道；D）選擇“操作”菜單中的“譜圖采集”命令，這時(shí)文檔窗口譜圖區(qū)內(nèi)開(kāi)始有譜圖走動(dòng)；E）當(dāng)所有峰出完后，選擇“操作”菜單中的“手動(dòng)終止”命令；ii 校正歸一法操作步驟：A 檢查“定量組分表”里是否已含有校正因子。若無(wú)，則應(yīng)按計(jì)算校正因子操作步 驟計(jì)算待測(cè)組分的校正因子：a）在譜圖中用鼠標(biāo)指著某一組分對(duì)應(yīng)的峰，按下鼠標(biāo)右鍵在彈出的菜單中選擇“自動(dòng)填寫(xiě)定量組分表中套峰時(shí)間”命令。重復(fù)此步，將

22、標(biāo)樣中全部組分所 對(duì)應(yīng)的峰選進(jìn)“定量組分表”；b）“定量組分表”里填上標(biāo)樣中各組分的質(zhì)量（g）;c）在“定量方法表”中選擇“計(jì)算校正因子”；d）選擇“操作”菜單中“定量計(jì)算”命令，程序隨即將計(jì)算結(jié)果填入“定量結(jié) 果表”中；e）在“定量組分表”中單擊“取校正因子”，將剛剛計(jì)算得到的但尚在“定量 結(jié)果表”中的校正因子取到“定量組分表”中；f）選擇“文件”菜單中的“存為摸板”命令將上述文檔窗口中的幾張表格保存 到當(dāng)前工作目錄下的“默認(rèn)模板.tab ”；B）待測(cè)樣品質(zhì)量百分含量的計(jì)算：a）按譜圖處理操作步驟所述采集并處理待測(cè)樣品的譜圖據(jù);b）在“定量方法表”中選擇“校正歸一”；c）選擇“操作”菜單中“

23、定量計(jì)算”命令，程序隨即將計(jì)算結(jié)果填入“定量結(jié) 果表”中；4. 儀器的關(guān)閉：i 將TCD熱導(dǎo)檢測(cè)器熱絲溫度設(shè)定為關(guān)閉；ii. 關(guān)閉儀器的總電源，并從電源插座上拔下儀器的電源電纜插頭；iii. 關(guān)閉載氣氣瓶總閥；四儀器和試劑1儀器： SP-2100 型氣相色譜儀；微量注射器；氫氣鋼瓶。2試劑： 101 白色擔(dān)體（ 60-80 目）；固定液：有機(jī)皂土 -34 + 鄰苯二甲酸二壬酯。苯、甲 苯、乙苯單樣的標(biāo)準(zhǔn)樣品（分析純）；苯、甲苯、乙苯混合標(biāo)準(zhǔn)樣（分析純）。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 苯系物的定性分析：根據(jù)保留值用苯、甲苯和乙苯的單樣標(biāo)準(zhǔn)液定性混合液中的三組分；2. 苯系物的定量分析：歸一化法計(jì)算各組分的含量

24、1 校正因子的求?。簩⒁阎M分量 （g）的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用“計(jì)算校正因子”法計(jì)算出校正因子；ii 待測(cè)樣品百分含量的計(jì)算（“校正歸一”化法計(jì)算）六記錄及分析結(jié)果打印出實(shí)驗(yàn)結(jié)果：包括保留時(shí)間、組分名稱以及質(zhì)量百分含量等數(shù)據(jù)結(jié)果的色譜圖 譜。七課堂提問(wèn)1保留值定性分析的原理？2 如何用面積歸一化法進(jìn)行定量？實(shí)驗(yàn)六 原子吸收光譜法測(cè)定自來(lái)水中鎂的含量一目的1掌握原子吸收光譜分析法的基本原理； 2了解原子吸收分光光度計(jì)的主要結(jié)構(gòu)，并學(xué)習(xí)其操作和分析方法； 3學(xué)習(xí)選擇操作條件和干擾抑制劑的應(yīng)用； 4了解從回收率來(lái)評(píng)價(jià)分析方案和測(cè)得結(jié)果的方法。二原理圖 6-1 原子吸收分析示意圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定鎂的含量：

25、溶液中的鎂離子在火焰溫度下變成鎂原子蒸汽，光源空心 陰極鎂燈輻射出波長(zhǎng)為 285.2 nm 的鎂特征譜線，被鎂原子蒸汽強(qiáng)烈吸收，其吸收的強(qiáng)度與 鎂原子蒸汽的濃度關(guān)系符合朗伯比爾定律，即鎂原子蒸汽濃度N與溶液中鎂離子濃度c成正比，當(dāng)測(cè)定條件固定時(shí)，利用A與c的關(guān)系，用已知不同濃度的鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)出不同的吸光度，繪制成標(biāo)準(zhǔn) 曲線，根據(jù)測(cè)試液的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出試液中鎂的含量。2干擾抑制劑：自來(lái)水中除鎂離子外還含有其他陰離子和陽(yáng)離子，這些離子鎂的測(cè)定能發(fā) 生干擾，使測(cè)得結(jié)果偏低。加入鍶離子作干擾抑制劑，可以獲得正確的結(jié)果。3回收試驗(yàn)：對(duì)于試樣的組成不完全清楚的或分析反應(yīng)不完全引起的系統(tǒng)誤差，

26、可以采用 回收試驗(yàn)進(jìn)行校正。該法是向試樣中或標(biāo)準(zhǔn)試樣中加入已知含量的被測(cè)組分的純凈物質(zhì)， 然后用同一方法進(jìn)行測(cè)定，由測(cè)得的增加值與加入量之差，估算系統(tǒng)誤差，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行 校正。三. TAS-990型原子吸收儀的操作1開(kāi)機(jī)依次打開(kāi)打印機(jī)，顯示器，計(jì)算機(jī)開(kāi)關(guān)，等計(jì)算機(jī)完全啟動(dòng)后，打開(kāi)原子吸收主機(jī)電 源，打開(kāi)蓋箱。2. 儀器初始化i .雙擊“ AAwin”圖標(biāo)，選擇聯(lián)機(jī)方式，點(diǎn)擊“確定”，初始化 3-5分鐘；ii .選擇元素?zé)艉皖A(yù)熱等（雙擊元素?zé)粑恢?，可更改燈位置上的元素符?hào)）。點(diǎn)擊“下一步”，出現(xiàn)“設(shè)置元素測(cè)量參數(shù)”窗口；iii .設(shè)定光譜帶寬，燃?xì)饬髁浚紵鞲叨鹊葏?shù)（一般工作燈電流，預(yù)熱燈電

27、流，負(fù)高 壓以及燃燒器位置不用更改），點(diǎn)擊“下一步”，出現(xiàn)“設(shè)置波長(zhǎng)窗口”：iv .不要更改默認(rèn)的波長(zhǎng)值，直接點(diǎn)擊“尋峰”，尋峰完畢，出現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸收峰，點(diǎn)擊“關(guān)閉”，點(diǎn)擊“下一步”，點(diǎn)擊“完成”。3. 火焰吸收的光路調(diào)整點(diǎn)擊“儀器”下的“燃燒器參數(shù)”，輸入燃?xì)饬髁亢透叨龋ㄖ苯佑绊懳罩礎(chǔ)的大小），點(diǎn)擊“執(zhí)行”，用白色濾紙觀察光電即燃燒頭是否在光路的正上方，若有偏離，更改相應(yīng)參數(shù)，點(diǎn)擊“執(zhí)行”，可以反復(fù)調(diào)節(jié)，直到燃燒頭和光路平行并位于光路正上方（如 不平行，可通過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)燃燒頭角度來(lái)完成），點(diǎn)擊“確定”。4設(shè)置樣品：點(diǎn)擊“樣品”圖標(biāo)i 選擇校正方法（一般為標(biāo)準(zhǔn)曲線法），曲線方程（一般

28、為一次方程），濃度單位，樣品 名稱和起始編號(hào)，點(diǎn)擊“下一步”；ii 輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和個(gè)數(shù)（可依照提示增加和減少標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)量），點(diǎn)擊“下一 步”；iii 選擇需要或不需要空白校正和靈敏度校正（一般為不要），然后點(diǎn)擊“下一步”；iv 輸入待測(cè)樣品數(shù)量，名稱，起始編號(hào)，以及相應(yīng)的稀釋倍數(shù)等信息，點(diǎn)擊“完成”。 5設(shè)置參數(shù)：點(diǎn)擊“參數(shù)”圖標(biāo)，彈出測(cè)量參數(shù)窗口。i “常規(guī)”：輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品，空白樣品，未知樣品等的測(cè)量次數(shù) （測(cè)幾次計(jì)算出平均值） ， 選擇測(cè)量方式（手動(dòng)或自動(dòng)，一般為自動(dòng)） ，輸入間隔時(shí)間和采樣延時(shí) （一般均為 1 秒）；ii “顯示”：設(shè)置吸光值最小值和最大值 （一般為 0-0.7

29、），刷新時(shí)間 （一般為 300秒）；iii “信號(hào)處理”：設(shè)置計(jì)算方式 （一般火焰吸收為連續(xù)或高峰） ，積分時(shí)間和濾波系數(shù) （積 分為 1，系數(shù)為 0.3 秒）；iv “質(zhì)量控制”：適用于帶自動(dòng)進(jìn)樣的設(shè)備； 點(diǎn)擊“確定”，退出參數(shù)設(shè)置窗口。6測(cè)量i 依次打開(kāi)空氣壓縮機(jī)的風(fēng)機(jī)開(kāi)關(guān)，工作開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)壓力調(diào)節(jié)閥，使空氣壓力為 0.2-0.25 MPa打開(kāi)乙炔鋼瓶主閥，調(diào)節(jié)出口壓力為 0.05-0.06 MPa，檢查水封；點(diǎn)擊“點(diǎn)火”圖 標(biāo)，火焰穩(wěn)定后，首先吸噴純凈水（將塑料管插入到蒸餾水中） 15 min ，防止燃燒頭結(jié) 鹽；ii 點(diǎn)擊“測(cè)量”，吸噴空白液（將塑料管插入到空白液中）校零，即線平直后，吸

30、噴標(biāo)準(zhǔn) 溶液，點(diǎn)擊“開(kāi)始”；每測(cè)一次標(biāo)準(zhǔn)溶液前，均需吸噴空白液校零，最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲 線；按照相同操作方法測(cè)量未知樣；測(cè)量完后，點(diǎn)擊“終止”，退出測(cè)量窗口，關(guān)閉乙 炔鋼瓶主閥，點(diǎn)擊“確定”，退出“熄火提示窗口”吸噴純水 1分鐘；iii 點(diǎn)擊“視圖”下的“校正曲線”，查看曲線的相關(guān)系數(shù)，決定測(cè)量數(shù)據(jù)的可靠性，點(diǎn) 擊“保存”或“打印”處理；7關(guān)機(jī)依次關(guān)閉AAwin軟件，原子吸收主機(jī)電源。乙炔鋼瓶主閥，空壓機(jī)工作開(kāi)關(guān)，按放水 閥，排空氣壓縮機(jī)中的冷凝水，關(guān)閉風(fēng)機(jī)開(kāi)關(guān)，退出計(jì)算機(jī)win dows操作程序，關(guān)閉打印機(jī)，顯示器和計(jì)算機(jī)電源。蓋上儀器罩，檢查乙炔是否已經(jīng)關(guān)閉，清理實(shí)驗(yàn)室。四、儀器和試劑1、儀器

31、：TAS-990型原子吸收分光光度計(jì)，鎂元素空心陰極燈，乙炔，空氣供氣設(shè)備；容量瓶（50 mL 17 支， 100 mL 1 支）；吸量管（ 1 mL 1 支， 5 mL 3支）。2、試劑： 10.00 ug/mL 鎂的標(biāo)準(zhǔn)溶液； 10.00 mg/mL 鍶溶液；二級(jí)純鹽酸，硝酸，去離子水，自來(lái)水樣。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容調(diào)整波長(zhǎng)到285.2 nm ,燈電流3 mA;1、燃?xì)夂椭細(xì)獗壤倪x擇：調(diào)整空氣壓力為 0.2 MPa和流量，使霧化器處于最佳霧化狀 態(tài)。再用去離子水調(diào)A=0,然后固定乙炔壓力為0.05 MPa，改變乙炔流量，測(cè)量50 mL 0.4 ug/mL鎂標(biāo)準(zhǔn)液（含2.0 mL鍶溶液）的A值。記

32、錄各種壓力、流量下的 A值（注意： 每改變乙炔流量，都要用去離子水調(diào)節(jié) A至零。），經(jīng)若干次測(cè)試后，從記錄結(jié)果選擇 出穩(wěn)定性好且A值又較大時(shí)的乙炔-空氣的壓力和流量。2、 燃燒器高度的選擇：改變?nèi)細(xì)飧叨龋瑴y(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)鎂溶液的A值，選擇出穩(wěn)定性好且 A 值又較大的燃燒器高度。3、干擾抑制劑鍶溶液加入量的選擇：移取自來(lái)水樣 5 mL，分別放入6只50 mL容量瓶中， 分別加入2 mL 1:1 HCI ;六瓶中分別加入0、1、2、3、4、5 mL鍶溶液，用水稀釋至 刻度，搖勻。每次用去離子水調(diào) A為零，依次測(cè)定各瓶試樣的吸光度，由測(cè)得的穩(wěn)定性 好且A值較大的結(jié)果，選擇出抑制干擾最佳的鍶溶液加入量。4

33、、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：于6只50 mL容量瓶中，分別加入0、10、20、30、40、50 ug鎂的標(biāo) 準(zhǔn)溶液，每瓶中加入選得的最佳量鍶溶液，每次用去離子水調(diào)零，依次測(cè)得各瓶溶液的 A值，以此數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、自來(lái)水樣的測(cè)定：準(zhǔn)確移取 5 mL自來(lái)水樣兩份，分別置于50 mL容量瓶中加入最佳量的鍶溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；用去離子水調(diào)零，測(cè)出其A值，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出水樣中鎂的含量 m。&回收率的測(cè)定：準(zhǔn)確移取 5 mL自來(lái)水樣兩份，分別置于50 mL容量瓶中，加入已知量的 鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加最佳量的鍶溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；用去離子水調(diào)零， 測(cè)出其A值，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出鎂的含量

34、，根據(jù)回收率公式計(jì)算出樣品的回收率。六.記錄及分析結(jié)果波長(zhǎng):燈電流:乙炔-空氣壓力:乙炔-空氣流量:助燃器高度：(1) 鍶溶液加入量的選擇試液編號(hào)鍶溶液的量/mL吸光度1021.032.043.054.065.0(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪與鎂含量的測(cè)定試液編號(hào)鎂含量/卩g吸光度10210320430540650未知液根據(jù)下式計(jì)算出鎂的濃度:(3) 回收率的測(cè)定試液編號(hào)加入的鎂量/卩g吸光度總的鎂含量/卩g12根據(jù)下式計(jì)算出鎂的回收率:七.課堂提問(wèn)1 原子吸收光譜分析法的原理？2 連續(xù)測(cè)定幾個(gè)試樣為什麼每次都要用去離子水調(diào)零?3、是否可用回收率來(lái)校正測(cè)量結(jié)果？如何校正？實(shí)驗(yàn)七 離子交換液相色譜法分離

35、標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握 AKTA Purifier-900 型液相色譜儀的操作。 2掌握離子交換色譜分離蛋白的原理。3掌握液相色譜定性分析方法。 4掌握液相色譜定量分析方法。 二原理圖 7-1 高效液相色譜示意圖 1液相色譜定性、定量原理(面積歸一化法)：定性原理：利用物質(zhì)在液固兩相中的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離的分析方法，稱之為液相 色譜法；按照同一蛋白在相同色譜條件下保留時(shí)間(tR) 致，進(jìn)行液相色譜的定性分析。定量原理：確定各組分百分含量的方法，稱之為液相色譜的定量。根據(jù)樣品洗脫情 況，通常的定量方法分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和面積歸一化法三種。當(dāng)混合蛋白樣中所有組分 均被洗脫時(shí)，可用面積歸一

36、化法計(jì)算各組分的含量，其計(jì)算公式如下所示： 其中 fi 為相對(duì)校正因子，其值大小等于某物質(zhì)的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子 的比值： 2離子交換色譜分離蛋白的原理：利用各蛋白質(zhì)與固定相間的靜電作用大小的差異性，在 適當(dāng)?shù)纳V條件下 (色譜柱、流動(dòng)相、洗脫方式等) ，能將各蛋白組分分開(kāi)，其色譜圖如圖 6-2 所示。圖 7-2 IDA- 裸柱分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物色譜圖1. BSA 2. RNase 3. Cyt-C 中雜蛋白 4. Cyt-C 5. Lys色譜條件：色譜柱：IDA-柱(100X4.6 mm I.D.); 流動(dòng)相：A: 0.02 mol/L KH 2PQ (pH 6.0);B:

37、0.02 mol/L KH 2PO4 (pH 6.0) + 0.5 mol/L NaCl；梯度洗脫 : 20 min B 從0到100%；流速：1 mL/min ; 檢測(cè)器：UV ( X = 280 nm);進(jìn)樣量：15 卩L;各蛋白濃度：2.0 mg/mL.三 AKTA Purifier-900 型生物色譜儀的操作1開(kāi)機(jī)：依次打開(kāi)計(jì)算機(jī)、生物色譜儀主機(jī)，待色譜儀初始化完畢后，點(diǎn)擊“Unicorn ”圖標(biāo)，輸入用戶名和密碼 (均為“ default ”)，則 UNICORNMessager、Method Editor 、 System Control 、 Evaluation 四個(gè)窗口同時(shí)出現(xiàn)

38、。2樣品測(cè)試操作i 手動(dòng)式操作：A. 色譜柱的平衡：點(diǎn)擊“ System Control ”窗口下“ Manual”菜單，選擇“ Alarm & Mon”窗口，設(shè)定色譜柱最大限壓和操作波長(zhǎng)，點(diǎn)擊“insert ”；選擇“ Pump窗口，設(shè)定操作流速，點(diǎn)擊“ insert ”，再點(diǎn)擊“ Execute ”，讓色譜柱在上述條件下平衡；待基線 平直后，在“ Alarm & Mon ”窗口中點(diǎn)擊“ Autozero UV ”，進(jìn)行自動(dòng)校零，再在此條件 下讓柱子平衡幾個(gè)柱體積。B. 樣品測(cè)試：選擇“ Flowpath ”窗口，選擇“ inject ”，點(diǎn)擊“ insert ”，選擇“ Pump 窗口，設(shè)

39、定洗脫方式和洗脫時(shí)間，點(diǎn)擊“ insert ”；回到“ Flowpath ”窗口，將樣品注 入樣品環(huán)，選擇“inject ”，點(diǎn)擊“ Execute ”，開(kāi)始進(jìn)行樣品的測(cè)試；當(dāng)圖譜中紅線 出現(xiàn)時(shí)（表明樣品已進(jìn)入系統(tǒng)），將選擇“ Flowpath ”窗口中的“ load ”，讓樣品環(huán)復(fù) 位。C系統(tǒng)清洗：選擇“ Pump窗口，設(shè)定清洗流速，依次將泵頭放入水、10%勺乙醇中清洗。ii .自動(dòng)操作：A. 方法編輯：在“ Method Editor ”中選擇“新建”圖標(biāo)，選中“ Method Editor ”，點(diǎn)擊“OK，進(jìn)入梯度編寫(xiě)程序，按照梯度要求編寫(xiě)成序。編寫(xiě)好后，在“File ”中選擇“save

40、 as ”，將編輯好的方法保存到設(shè)定的文件夾下（一般為C：.defaultMethod）。B. 方法運(yùn)行：在“ System Co ntrol ”中選擇“ Run”，然后從編輯的方法文件中選擇出自 己的方法文件，點(diǎn)擊“ OK，在“ Result name ”對(duì)話框中，點(diǎn)擊“ Browse”，選中保 存實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的文件夾，給出文件名；將待測(cè)樣品注入樣品環(huán)，點(diǎn)擊“ Start ”，開(kāi) 始進(jìn)行樣品的測(cè)試。C系統(tǒng)清洗：選擇“ Pump窗口，設(shè)定清洗流速，依次將泵頭放入水、10%勺乙醇中清洗。3. 數(shù)據(jù)處理：在“ Evaluation ”窗口中打開(kāi)保存的數(shù)據(jù)文件，手動(dòng)操作的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)在“C： .def

41、ault中的 Manual Runs（System 1）”中按時(shí)間順序查找；自動(dòng)操作的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)在“ C: .default中自己設(shè)定的文件中查找。選擇“ File ”里“ Open toCompare中的“ Curves”進(jìn)行圖譜的對(duì)比。4. 數(shù)據(jù)輸出：在“ Evaluation ”窗口中打開(kāi)保存的數(shù)據(jù)文件，得到色譜圖，選擇“ File ” 里“ Export ”中的“ Curves”，選中圖譜的波長(zhǎng)，點(diǎn)擊“ Select ”確認(rèn)后，點(diǎn)擊Export ”；選擇圖譜輸出路徑以及文件名，點(diǎn)擊“ OK，從“ Excel”中打開(kāi)該文 件，即可將色譜圖由ACSII碼轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可用“ Exc

42、el”或“ Origin ”作 圖軟件，做出對(duì)應(yīng)的色譜圖。5. 關(guān)機(jī)：點(diǎn)擊“ System Control ” 中的“ End鍵，關(guān)閉“ UNICORN Messager，點(diǎn)擊“System Control ，選中“ Unlock”，點(diǎn)擊“ OK，生物色譜儀主機(jī)系統(tǒng)退出（計(jì)算 機(jī)與主機(jī)脫機(jī)），依次關(guān)閉生物色譜儀和計(jì)算機(jī)。四. 儀器和試劑1. 儀器：AKTA Purifier-900 型液相色譜儀；IDA-硅膠柱；微量注射器。2 .試劑：BSA RNase Cyt-C、Lys標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL），以及標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液；其它試劑均為分析純；水為二次蒸餾水。五. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白的定性分析：根

43、據(jù)保留值用蛋白單樣標(biāo)準(zhǔn)液定性混合液中的四組分;C=1 mg/mL，進(jìn)樣量10此標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物BSACyt-CRNaseLyst R2. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的定量分析：歸一化法計(jì)算各扥白組分的含量i .校正因子的求?。簩⒁阎M分量 （g）的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用“計(jì)算校正因子”法計(jì)算出校正因子;C=1 mg/mL，進(jìn)樣量10此標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物BSACyt-CRNaseLysm (g)ii .待測(cè)樣品百分含量的計(jì)算（“校正歸一”化法計(jì)算）：六. 記錄及分析結(jié)果打印出實(shí)驗(yàn)結(jié)果：包括保留時(shí)間、組分名稱以及質(zhì)量百分含量等數(shù)據(jù)結(jié)果的色譜圖七. 課堂提問(wèn)1. 離子交換色譜分離蛋白的機(jī)理?2. 保留值定性分析的原理？3. 如何用

44、面積歸一化法進(jìn)行定量?實(shí)驗(yàn)八 小鼠腎臟組織蛋白的雙向電泳分離一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握2-DE電泳儀（PROTEAIEF Cell等點(diǎn)聚焦儀，PROTEAn Xi垂直電泳槽）的操作。2掌握2-DE分離蛋白質(zhì)組的原理。3. 掌握2-DE定性分析方法。4. 掌握2-DE定量分析方法。二. 原理圖 8-1 2-DE 電泳儀1. 2-DE分離原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第 二向SDS-PAG是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離。這樣就 從兩方面對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，最終得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。如圖 8-2所示：圖 8-2 被動(dòng)式再水合低分子區(qū)小鼠

45、腎臟組織蛋白的 2-D 圖譜17cm pH 3-10 IPG 膠條，200 X 200X 1.0mm SDS均一膠（12% , 120ug 上樣量，銀染2. 2-DE定性原理：通過(guò)蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的對(duì)比，根據(jù)同一蛋白點(diǎn)在凝膠上所處的位置相 同進(jìn)行定性。3. 2-DE定量原理：通過(guò)蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的對(duì)比，根據(jù)蛋白點(diǎn)顏色的深淺、以及蛋白點(diǎn)的 大小進(jìn)行初步定量。三、2-DE操作步驟（一）第一向等電聚焦1. 水化液的制備：i從冰箱中取-20 C冷凍保存的水化上樣緩沖液（I ）（不含DTT不含Bio-Lyte ） 小管 （ 1ml/ 管），置室溫溶解。ii 在小管中加入 0.01g DTT 溴酚蘭，3.

46、5ul （0.5%v/v ） IPG buffer （pH 3-10）振蕩混勻， 13200rpm離心15mi n除雜質(zhì)，取上清。iii從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，振蕩器上振蕩混合,13200rpm 離心 15min 除雜質(zhì)，取上清。2. 點(diǎn)樣、上樣i從冰箱中取-20 C冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 3-10），室溫中放置10分鐘。ii沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分 布。iii 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子

47、輕輕的去除預(yù)制IPG 膠條上的保護(hù)層。iv將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐 膜上。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地 提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。v 在每根膠條上覆蓋 2-3ml 礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物 油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。3. IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為 20C）i 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子，設(shè)置等電聚焦程序：S1 、S2 、S3 、

48、 S4 、S5 ；其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦ii 聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡、第二向 SDS-PAG電泳，否則將膠條置于樣品水化盤 中，-20 C冰箱保存。（二）平衡1. 配制膠條平衡緩沖液 I 。在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚 濾紙上。將另一份厚濾紙用 MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕 輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃 15分 鐘。2. 配制膠條平衡緩沖液 II 。第一次平衡結(jié)束后，徹底

49、倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平 衡緩沖液 I 。并濾紙吸取多余的平衡液 （將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠 表面）。再加入膠條平衡緩沖液 II ，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15分鐘。（三）第二向SDS-PAG電泳1. 配膠、灌膠i配制10%勺丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃 板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平 整，聚合 30分鐘。ii 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的 MilliQ 水、乙醇或水飽和正丁醇，用 MilliQ 水沖洗2. 轉(zhuǎn)移i從-20 C冰箱中取出的膠條，先于室溫放置 10分鐘，使其

50、溶解。用濾紙吸去 SDS-PAG聚 丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板 在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。ii將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。11.將10倍電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，制成1倍電 泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。iii第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II o并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。將 IPG膠條從 樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1倍電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。將放有膠條的SDS-PAGE凝

51、膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠 液。iv用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完 全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)， 要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。在低熔點(diǎn)瓊脂糖圭寸膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。3 跑膠i在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到

52、底部邊緣時(shí)即可停止電泳。ii電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠 面）。（四）銀染固定一敏化一洗滌一銀染一洗滌心?顯影?終止?fàn)? 洗滌？ 注：整個(gè)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。四. 儀器和試劑1. 儀器：PROTEAN IEF Cell等點(diǎn)聚焦儀，PROTEAn Xi垂直電泳槽（Bio-Rad公司）； 玻璃勻漿器（陜西化玻器械有限公司）；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；ULTFreezer（美國(guó) Thermo Forma公司）。2試劑：三羥甲基氨基甲烷（ Tris ）

53、，兩性離子表面活性劑（ CHAP）S ，苯甲基磺酰氟（PMSF）,二硫蘇糖（DTT ,丙烯酰胺（Acrylamide ） , N,N -甲叉雙丙烯酰胺（N,N -Methylene bisacrylamide ），過(guò)硫酸銨（APS，十二烷基磺酸鈉（SDS，四 甲基乙二胺（TEMED，溴酚藍(lán)（Bromophenol Bule），2-巰基乙醇（2-ME，低 分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)均購(gòu)自華美生物工程公司；載體兩性電解質(zhì)（ CA，pH=3.5-9.5 ），購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；礦物油（ Silicon Oil ）， IPG 干膠條均購(gòu)自 Bio-Rad 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1

54、. 樣品的溶解 預(yù)冷生理鹽水沖洗鼠腎臟組織 3 次，迅速將清洗的組織分割成適宜的小塊，濾紙吸取多余的液體，稱量50mg濕組織，放入玻璃組織勻漿器中加 1mL裂解液（裂解液I : 9.5 mol/L Urea+ 40mmol/L Tris+ 4%w/v CHAPS ;裂解液n： 9.8 mol/L Urea+ 40mmol/L Tris+4%w/v CHAPS+1mmol/L PMSF+1mmol/L EDTA+65mmol/L DTT+ 0.5%v/v IPG buffer）， 冰浴中勻漿，冰上靜置 10-15min，17C下，15000rpm離心10min；取上清，用LOWOF法定 量5，蛋

55、白濃度約為20 mg/mL，分裝于小離心管中，-78 C下凍存?zhèn)溆?；取一定量上述樣?液，加再水合液（8mol/L Urea+2%w/v CHAPS +微量溴芬蘭）稀釋至終體積 300卩L,混勻 后室溫下靜置1hr，離心后即為含樣品的再水合液。2. 凝膠電泳移取含有適量蛋白濃度的泡脹液 300uL，采用被動(dòng)式和主動(dòng)式（加50V低壓）的膠內(nèi)樣品再水合法泡脹17cm的IPG膠條16 hr。按照IEF程序20C下恒溫等電聚焦：0150V 40min （線性）；150500V 40min （線性）；5001000V1hr （線性）；5001000V1hr （線性）；10002000V 1hr （線性）；20003000V 1hr （線性）；30004000V 1hr （線性）；4000 6000V 1hr （線性）；60008000V 1hr （線性）8000V 4hr （快速）。聚焦后 IPG 膠條在 6mL 平衡緩沖液中（1.5 mol/