經(jīng)典液相色譜法平面色譜研究

1、平面色譜法 18.4.1 平面色譜法的 分類 v定義和分類 平面色譜法(plane chromatography)是在平 面上進(jìn)行分離的一種色譜方法，主要包括 薄層色譜法、紙色譜法和薄層電泳法。 薄層色譜法： 將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上， 形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法。 按分離原理又可分為： 吸附薄層色譜法 分配薄層色譜法 分子排阻色譜法 紙色譜法： 將固定相放在紙上，以紙做載體進(jìn)行點(diǎn)樣、 展開、定性、和定量的液-液分配色譜法。 20世紀(jì)40年代 產(chǎn)生 應(yīng)用于生化醫(yī)藥學(xué)方面的微量分析。 20世紀(jì)60年代后， 應(yīng)用減少。 薄層電泳法 帶電荷的被分離物在紙、醋酸纖維素、 瓊脂糖凝膠及

2、聚丙稀酰胺凝膠等惰性介質(zhì) 上，向與其相反的電極方向，以不同的速 度遷移而實(shí)現(xiàn)分離。 v薄層色譜法的特點(diǎn)： 分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中。 靈敏度高，幾微克，甚至幾十納克的物 質(zhì)也能檢出。 展開時(shí)間短，一般只需十至幾十分鐘。 一次可以同時(shí)展開多個(gè)試樣 試樣預(yù)處理簡單，對被分離物質(zhì)性質(zhì)沒 有限制。 點(diǎn)樣量較大，可點(diǎn)成點(diǎn)或條狀。 所用儀器簡單，操作方便。 v定性參數(shù) 比移值 0 f l l R 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 心的距離原點(diǎn)到組分斑點(diǎn)質(zhì)量中 18.4.2 平面色譜 法參數(shù) 0 2 f 0 1 f l l RB l l RA 物質(zhì)的 物質(zhì)的如圖： 。圍 ，最佳范常用范圍 ，值的范圍為 5 . 03 . 0

3、 8 . 02 . 0 1R0 R ff 相對比移值Rr 參 被測 （參） （被測） 中心的距離原點(diǎn)到參考物斑點(diǎn)質(zhì)量 心的距離原點(diǎn)到組分斑點(diǎn)質(zhì)量中 l l R R R f f r 討論討論 可消除系統(tǒng)誤差，提高重現(xiàn)性和可 靠性； 相對比移值范圍可以大于或小于1 。 v相平衡參數(shù) 推導(dǎo)比移值與分配系數(shù)的關(guān)系 ，溶質(zhì)流出的時(shí)間為流出的時(shí)間為 的色譜柱，溶劑，則對于一根長度為度為 ，溶質(zhì)流動的速假設(shè)溶劑流動的速度為 u/Lu/L Lu u 0 0 已知色譜過程方程： 1 0 ) V V K(tt m s R ) u u tu ut l l R 000 f （定時(shí)展開在薄層色譜中 k1 1 V V K

4、1 1 R m s f 可知 m s0 00 R V V K1 u u u/L u/L t t （等距展開） f RkK或 k1 1 V V K1 1 R m s f K趨近0，Rf 趨近1，組 分不被固定相保留。 K趨近，Rf趨近0，組分 停留在原點(diǎn)，完全被固定相保留。 討論 Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度） 以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)。 色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)， 是薄層色譜基本定性參數(shù)，說明組分的色 譜保留行為。 v分離參數(shù) 分離度 點(diǎn)的寬度。 為斑、，為兩斑點(diǎn)中心間的距離 心的距離，分別為原點(diǎn)至兩斑點(diǎn)中、 21 12 WWd ll 212112 WW/d2WW/ll2R

5、 分離數(shù) 色譜斑點(diǎn)數(shù)。 納的兩種組分斑點(diǎn)之間能容和 時(shí)，在為定義在相鄰斑點(diǎn)分離度 1R0R 1.177 ff 二者由外推法獲得。 時(shí)組分的半峰寬，和為、其中，10Rbb 1bb/lSN f10 100 SN越大，說明板的容量越大。 18.5 薄層色譜法 v主要類型 吸附薄層色譜法 分配薄層色譜法 分子排阻色譜法 正相色譜法 反相色譜法 18.5.1 吸附薄層色譜的吸附 劑和展開劑 v吸附劑 最常用的是硅膠、氧化鋁、聚酰胺、纖維素、 葡聚糖、磷酸鈣、磷酸鎂、硅酸鈣鎂等。 硅膠： SiO2H2O 結(jié)構(gòu)： 內(nèi)部硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)多孔結(jié)構(gòu) 表面有硅醇基吸附活性中心 氫鍵作用 表：硅膠的活度與含水量 硅膠含水

6、量活性級別氧化鋁含水量 00 53 156 2510 3815 適用范圍： 硅膠表面的pH約為5，適合分析酸性或 中性物質(zhì)。 硅膠的類型： 硅膠H： 不含黏合劑，鋪成硬板需另加粘合劑。 硅膠G： 是硅膠和鍛石膏混合而成。 硅膠GF254：含鍛石膏和無機(jī)熒光劑，即 錳激活的硅酸鋅(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫 外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光背景。 購買時(shí)注意： 規(guī)格（主要是種類、活度級別和粒度） 常規(guī)：1040m 高效：5m或10m 氧化鋁 堿性氧化鋁、 中性氧化鋁、酸性氧化鋁 使用時(shí)可不加黏合劑，也可加煅石膏或 CMC等黏合劑； 通常使用活性級別級。 v展開劑 常見溶劑的極性由強(qiáng)到弱的順序：

7、 水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮 乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯 三氯乙烷四氯化碳環(huán)己烷石油醚 如何選擇吸附劑和展開劑？ 用“競爭吸附”解 釋 被分離物質(zhì) 的極性 吸附劑 的活度 展開劑極性 大小大 小大小 防止吸附太牢，Rf太小 防止Rf太大 開展實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以選用單一溶劑展開，再 根據(jù)Rf的大小，進(jìn)一步調(diào)整展開劑的種類或 選用二元、三元展開劑。 分離酸性物質(zhì)，可在展開劑中加入少量酸 性溶劑，如甲酸、乙酸等 分離堿性物質(zhì)，可在展開劑中加入少量堿 性溶劑，如氨水、乙二胺等。 例如：用氯仿展開時(shí)，如果Rf值太小，則 可加入極性_的展開劑，如_。如 果Rf值太大，可加入極性_的展開劑， 如_。環(huán)己烷、石

8、油醚 小 乙醇大 18.5.2 薄層色譜操作 方法 可分制板、點(diǎn)樣、展開和顯色四個(gè)步驟。 v薄層板的制備 軟板的制備 硬板的制備 硬板加了粘合劑，常用的粘合劑有羧甲基 纖維素鈉(CMC-Na)和鍛石膏(CaSO41/2H2O) 兩種。 硅膠-CMC板制備 取羧甲基纖維素鈉57g,加1000ml水， 加熱使溶解，放置澄清，取上清液100ml,分 次加入硅膠約33g,調(diào)成糊狀。去除氣泡后， 將糊狀的吸附劑倒在清潔的玻璃板上，使均 勻涂布于整塊玻璃板上，平放自然晾干， 105活化1h，置干燥器中保存?zhèn)溆谩?點(diǎn)樣 a.樣品溶液的制備 一般選用易揮發(fā)，與展開劑極性相似的 有機(jī)溶劑，如甲醇、丙酮、乙醇等。

9、配制樣 品液濃度為0.01% 0.1%。 目的：使點(diǎn)樣后溶劑能迅速揮發(fā)，減少色 斑的擴(kuò)散。 b.點(diǎn)樣量和點(diǎn)樣工具 點(diǎn)樣毛細(xì)管，微量注射器 點(diǎn)樣量一般以幾微升為宜，毛細(xì)管大約 1cm左右。點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑以24mm為宜。 c.點(diǎn)樣方法 吸取一定量的樣液，輕輕接觸于薄層的 點(diǎn)樣線上，點(diǎn)樣線一般距薄層底邊 1.52cm， 點(diǎn)間距約0.81.5cm(新藥典規(guī)定為1.52.0 cm)。點(diǎn)樣后形成的原點(diǎn)面積越小越好，一 般原點(diǎn)直徑不超過24mm為宜。 展開和展開劑的流速 展開 先預(yù)飽和。展開前，將薄層板置于盛有展 開劑的色譜缸內(nèi)飽和1530min,此時(shí)薄板不與 展開劑直接接觸，當(dāng)色譜缸內(nèi)展開劑蒸汽、薄 層與缸

10、內(nèi)大氣達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)，即飽和時(shí)，再 將薄層板浸入展開劑中，稱預(yù)飽和。 邊緣效應(yīng)： 指點(diǎn)在薄層板上的同一物質(zhì)，薄板邊緣的 Rf值高于中部的Rf值的現(xiàn)象。 展開劑的流速Uf ktL ktL tL 2 00 0 或據(jù)測有： ，所用時(shí)間為離為設(shè)展開劑前沿移動的距 0 2/12/1 0 f 0 L2 k tk 2 1 dt dL U L 求導(dǎo)：對 觸角。劑與固定相兩相間的接 為展開為展開劑粘度，展開劑表面張力， 為為平均顆粒直徑，為滲透常數(shù)， 有關(guān)。變長而變慢，并與隨可見， p0 p0 0f dk cosdk2k kLU 實(shí)際情況比上面分析的要復(fù)雜的多?？傊?薄層色譜過程中展開劑的流速是空間、時(shí) 間的

11、復(fù)雜函數(shù)。 顯色 顯色方法： a.在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn) 位置。 b.在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點(diǎn)， 并記 錄顏色、位置、強(qiáng)弱。能發(fā)熒光的物質(zhì) 或少數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)可用此法檢出。 c.熒光薄層板檢測。 d.顯色劑顯色。適用于無色，又無紫外吸 收的物質(zhì)。薄層色譜常用的通用型顯色劑 有碘、硫酸溶液、熒光黃溶液等。 18.5.3 定性和定量 分析 v定性分析 依據(jù)：Rf值。 用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作對照，在多種展開系 統(tǒng)中比較Rf值的大小。 或與其它分析方法聯(lián)用。 v定量分析 洗脫法 用溶劑將斑點(diǎn)中的組分洗脫下來，再用 適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定量測定。 斑點(diǎn)需預(yù)先定位。 直接定量法： 目視比較法：

12、將一系列已知濃度的對照品與試樣溶液 點(diǎn)在同一薄層板上，展開并顯色后， 薄層掃描法： 用一定波長、一定強(qiáng)度的光束照射薄層 上的斑點(diǎn)，用儀器測量照射前后光束強(qiáng)度 的變化，從而求得物質(zhì)含量的方法。精密 度為5%。 雙波長型薄層掃描儀 測定方法：透射法和反射法。 掃描方法：線形掃描和曲折形掃描 12 CH L P PM PM 雙波長薄層掃描光學(xué)線路示意圖 18.5.4 高效薄層色 譜法 (high performance thin layer chromatography；HPTLC) 高效薄層色譜的分離效率比經(jīng)典薄 層色譜提高三倍，每分鐘可分離5個(gè)以 上組分，最多可分離40種組分。檢出靈 敏度提高，

13、分析時(shí)間縮短。 高效薄層色譜法與經(jīng)典薄層色譜法 在吸附劑粒度等方面不同。 表：TLC與HPTLC的比較 參數(shù)TLCHPTLC 板尺寸(cm)20201010 顆粒直徑(m)10 405,10 顆粒分布寬窄 點(diǎn)樣量(l)1 50.10.2 有效塔板數(shù)6005000 展開距離(cm)10 153 6 展開時(shí)間(min)30 2003 20 最小檢測量：吸收(ng)1 50.1 0.5 熒光(pg)50 1005 10 18.6 紙色譜法 18.6.1 紙色譜法的分 離原理 是以紙為載體的色譜法，分離原理 屬于分配色譜的范疇。 固定相：紙纖維上吸附的水分。(或甲酰胺、 緩沖液等濾紙可以吸留的物質(zhì)。)

14、 流動相：不與水相混溶的有機(jī)溶劑。或可與 水混溶的溶劑。 paper chromatography 分離原理： 紙色譜法可以看成是溶質(zhì)在固定相和流 動相之間連續(xù)萃取的過程。依據(jù)溶質(zhì)在兩相 間分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的目的。常用 比移值Rf來表示各組分在色譜中的位置。 Rf值與化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系 值小（水為固定相） 分配系數(shù)大強(qiáng)化合物極性大或親水性 f R 值大（水為固定相） 分配系數(shù)小強(qiáng)化合物極性小或親水脂 f R 化合物的極性應(yīng)根據(jù)整個(gè)分子及組成分子 的各個(gè)基團(tuán)來考慮。 CHO HC OH HO CH HC OH HC OH CH2OH CHO HO CH HO CH HC OH HC OH C

15、H3 CHO CH2 HC OH HC OH HC OH CH3 葡萄 糖 鼠李糖 洋地黃毒 糖 表： 三種六碳糖的Rf值 糖 溶劑系統(tǒng) 123 葡萄糖0.030.170.10 鼠李糖0.270.420.44 洋地黃毒糖0.580.660.88 溶劑系統(tǒng) 1.正丁醇水 2.正丁醇乙酸 水（4：1：5） 3.乙酸乙酯吡 啶水（25：10： 35） 18.6.2 紙色譜法的實(shí) 驗(yàn)條件 色譜紙的選擇 a.要求濾紙質(zhì)地均勻，應(yīng)有一定的機(jī)械強(qiáng)度。 b.紙纖維的松緊適宜。 c.紙質(zhì)應(yīng)純，雜質(zhì)量要小，無明顯的熒光斑點(diǎn)。 薄紙定性，厚紙制備或定量。 Rf值相差小 慢速濾紙 大 快速濾紙 固定相： 紙纖維吸附的

16、水 濾紙纖維有較強(qiáng)的吸濕性，通常含 20%25%的水。其中有6%7%的水是以氫鍵 締合的形式與纖維素上的羥基結(jié)合在一起。 一般條件下較難脫去。所以為固定相。紙纖 維是一個(gè)惰性載體。 在分離一些極性較小的物質(zhì)，為了增加 其在固定相中的溶解度，常用甲酰胺或二 甲基甲酰胺、丙二醇等作為固定相。分離 酸、堿性物質(zhì)，常將紙條浸過緩沖溶液。 展開劑的選擇 選擇依據(jù)：根據(jù)被分離物質(zhì)在兩相中的 溶解度和展開劑的極性來考慮。 在流動相中的溶解度較大的物質(zhì)將會移 動得快，具有較大的比移值；對極性物質(zhì)， 增加展開劑中極性溶劑的比例，可以增大比 移值，增加非極性溶劑的比例，可以減少比 移值。 常用展開劑：水飽和的正丁

17、醇、正戊醇、 酚等，即含水的有機(jī)溶劑。 為了防止弱酸、弱堿的離解，加入少量 的酸或堿。如甲酸、醋酸、吡啶等。 紙色譜的操作步驟有點(diǎn)樣、展開、顯色、 定性定量分析幾個(gè)步驟。 復(fù)習(xí)題 1、在硅膠薄層板A上，以苯甲苯（1:3）為 展開劑，某物質(zhì)的Rf值為0.50，在硅膠板B 上，用相同的展開劑，此物質(zhì)的Rf值為0.40， 問哪塊板的活度大？ 2、用薄層色譜法分離某樣品，先用氯仿展開， 各組分的Rf太大，可在氯仿中加入一定比例 的（ c ），以使Rf值在合適的范圍。 A. 甲醇 B.丙酮 C.環(huán)己烷 D. 氨水 3、在薄層色譜中，以硅膠為固定相，有機(jī)溶 劑為流動相，遷移速度快的組分是（ b ） v極性大的組分 B.極性小的組分 A.C. 揮發(fā)性大的組分 D. 揮發(fā)性小的組 分 4、一個(gè)化合物當(dāng)用丙酮為流動相時(shí)， Rf太大， 如用氯仿為流動相時(shí)，此化合物的Rf會改