植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

1、v 原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義 1、原生質(zhì)體的特性 （1）去壁的原生質(zhì)體容易實(shí)現(xiàn)外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入和吸收。 （2）原生質(zhì)體具有細(xì)胞全能性。 （3）不同來源的原生質(zhì)體具有彼此融合的能力。 2、原生質(zhì)體培養(yǎng)應(yīng)用 （1）克服植物有性雜交的障礙，擴(kuò)大物種間遺傳物質(zhì)交流的范圍，創(chuàng)造有利變異， 培育新品種。 （2）作為獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，用于體細(xì)胞遺傳、生理、病理等方面的基礎(chǔ)理論研究。 第一節(jié) 原生質(zhì)體的分離與純化 一、原生質(zhì)體的分離 （一）分離原生質(zhì)體的材料來源 （二）分離方法 1機(jī)械分離法 2酶法分離 （三）技術(shù)程序 二、原生質(zhì)體的純化 （一）分離原生質(zhì)體的材料來源 游離原生質(zhì)體時(shí)，植物葉片、花瓣、果實(shí)組織、子葉

2、、下胚軸、幼根、 莖葉、愈傷組織、懸浮細(xì)胞等都可作為材料來源，但常用于分離原生質(zhì)體 的材料為： 1、葉片 葉片來源豐富，供應(yīng)及時(shí)，有明顯的葉綠體存在時(shí)也便于在細(xì)胞融合中識別。 2、試管苗的子葉、胚軸或莖尖等無菌材料 3、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。 （二）分離原生質(zhì)體的方法 1、機(jī)械分離法 2、酶法分離 酶法分離是利用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等酶類 降解細(xì)胞壁成分，獲得原生質(zhì)體的方法。 （1）分離原生質(zhì)體的酶類 （2）酶解分離原生質(zhì)體的方法 （3）酶解分離原生質(zhì)體應(yīng)注意的問題 根據(jù)植物材料種類選擇所用酶的種類、處理濃度、和處理時(shí)間。 酶解分離時(shí)應(yīng)提供適宜的滲透壓保護(hù)，以防原生質(zhì)體破裂。 （1）

3、分離原生質(zhì)體的酶類 酶的類型酶的類型作用作用常用種類常用種類 纖維素酶纖維素酶降解細(xì)胞壁中纖維素成分，降解細(xì)胞壁中纖維素成分， 游離原生質(zhì)體。游離原生質(zhì)體。 Onozuka R-10 半纖維素酶半纖維素酶降解細(xì)胞壁中的半纖維素降解細(xì)胞壁中的半纖維素 成分。成分。 Phozyme HP-150 果膠酶果膠酶降解相鄰細(xì)胞間的果膠質(zhì)，降解相鄰細(xì)胞間的果膠質(zhì)， 使細(xì)胞游離。使細(xì)胞游離。 Macerozyme R-10 （2）酶解分離原生質(zhì)體的方法 兩步分離法 這種分離方法是先用果膠酶離析植物組織，使植物細(xì)胞從組織中分離出來，然后收集細(xì)胞經(jīng)洗滌后用纖維 素酶解離細(xì)胞壁，最后獲得原生質(zhì)體。 一步分離法 即

4、把一定量纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進(jìn)行一次性處理，處理溫度2530，處理的時(shí)間根 據(jù)材料及酶濃度的不同而不同，可為224h。 （三）游離原生質(zhì)體的技術(shù)程序 1、材料準(zhǔn)備：稱重、滅菌與研碎。 2、預(yù)處理：研磨、切割、暗培養(yǎng)等。 3、酶解：加入酶液，保育處理； 4、收集純化：過濾去除組織碎塊；離心純化原生質(zhì)體。 5、活力檢測 6、原生質(zhì)體的培養(yǎng) 原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁細(xì)胞分裂，形成愈傷組織愈傷組織分化成苗 二、原生質(zhì)體的純化 （一）離心沉淀法 (過濾濃縮法） （二）接口法 選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一 種溶液小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)速度離心

5、后即介于兩種溶液之間。 （二）漂浮法 （一）離心沉淀法 1、方法：先將經(jīng)酶處理的原生質(zhì)體懸浮液用400目網(wǎng)篩 過濾，濾液經(jīng)5001 000r/min離心56min后，吸 去上清液，然后用一般洗滌液重新懸浮，離心沉淀，如 此重復(fù)23次。最后再用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集 原生質(zhì)體備用。 2、注意： （1）整個(gè)過程用相同的滲透液，滲透壓以稍高于原生質(zhì) 體內(nèi)滲透壓，細(xì)胞稍微發(fā)生質(zhì)壁分離為好。 （2）常用的原生質(zhì)體清洗介質(zhì)為CPW溶液； （3）這種方法簡便，但不能完全除盡少量脫壁不完全的 細(xì)胞和破碎的原生質(zhì)體。 （二）接口法 1、方法： 先在離心管底加入山梨醇或蔗糖的濃溶液（21%）， 再小心的加入過

6、濾處理的酶-原生質(zhì)體混合液，以合適 的速度離心，原生質(zhì)體將聚集于兩液面之間。小心取出 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入另一離心管，用清洗介質(zhì)清洗、離心，重 復(fù)3次。最后以適當(dāng)?shù)拿芏葢腋∮谝后w培養(yǎng)基中。 2、優(yōu)劣 該法可收集較純的原生質(zhì)體，且原生質(zhì)體破碎較少。 但采用的高滲溶液往往對原生質(zhì)體傷害較大。 用此法的關(guān)鍵是控制好蔗糖或山梨醇的濃度及離心 速度，使原生質(zhì)體漂浮于單一界面，且不影響原生質(zhì)體 的穩(wěn)定性和活力。 第二節(jié) 影響原生質(zhì)體產(chǎn)量 和活力的因素 一、材料來源 （一）植物葉片 （二）培養(yǎng)細(xì)胞 二、預(yù)處理 三、酶處理 四、滲透壓 （一）植物葉片 當(dāng)從植物葉片分離原生質(zhì)體時(shí)，植株的生長環(huán)境、植株年齡等對原生質(zhì)體的

7、分離 和培養(yǎng)影響較大。 、植株年齡 對一年生草本：生長40-60天的幼葉； 對多年生木本：幼齡且充分展開的葉片。 、母株生長環(huán)境 母株生長在低光強(qiáng)（10001x）、短日照、溫度2025、相對濕度6080 的條件下，以及較高的氮肥供應(yīng)。 、采用離體苗葉片 （二）培養(yǎng)細(xì)胞 由培養(yǎng)細(xì)胞分離原生質(zhì)體，其產(chǎn)量取決于培養(yǎng)細(xì)胞的生長速率和生長時(shí)期。 頻繁繼代可促進(jìn)細(xì)胞的旺盛分裂，生長時(shí)期以處于對數(shù)生長早期的細(xì)胞為好。即： 頻繁繼代（每23天繼代1次）的懸浮培養(yǎng)物以及處于對數(shù)生長早期的細(xì)胞是最適 宜的供體材料。 利用培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體往往容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞的分裂和分化。 不同植物適宜于分離原生質(zhì)體

8、的材料 不同科屬的植物其材料特性存在差異，適宜于游離原生 質(zhì)體的供體材料也異。 （1）茄科 一般選擇生長旺盛、生理狀態(tài)一致的剛展開的幼嫩葉片。 （2）十字花科 種子萌發(fā)4-5天的無菌苗的下胚軸為材料，具有原生質(zhì) 體得率高、活力強(qiáng)、再生頻率高等優(yōu)點(diǎn)。 （3）豆科 以未成熟種子的子葉為材料。 （4）禾本科 用幼胚、幼穗、花藥或成熟胚為外植體建立胚性愈傷組 織及其胚性懸浮細(xì)胞系分離原生質(zhì)體。 二、預(yù)處理 1、依據(jù)材料特性進(jìn)行表面滅菌 2、促使酶液滲入組織細(xì)胞內(nèi)的措施 （1）撕去葉片的下表皮，將無表皮的一面向下漂浮在酶溶液中。 （2）將葉、胚軸、嫩莖等切成小塊或薄片，投入到酶溶液中。 （3）真空滲入促

9、使酶液滲透。 （4）酶處理期間進(jìn)行攪拌或振蕩。 三、酶處理 1、原生質(zhì)體分離在很大程度上取決于所用酶的性質(zhì)和濃度 ，因此要做好酶種類、 處理濃度的選擇。 2、酶處理的適宜條件 （1）pH值酶的活性與pH有關(guān)，用于分離原生質(zhì)體的大多數(shù)酶適宜的PH為 4.7-6.0 。 （2）溫度 對用來分離原生質(zhì)體的酶類來說，最適溫度是4050，但分離 原生質(zhì)體時(shí)以2530為宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光強(qiáng)下分離原生質(zhì)體。 1 1、酶種類、處理濃度、處理時(shí)間 （1）對于胚性愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 常用活性較強(qiáng)的酶的組合，如Cellulase RS、 Pectolyase Y-23、Rhozyme HP15

10、0，并且酶處理濃 度應(yīng)高些，用量應(yīng)大些。 （2）對于葉片、子葉、下胚軸等材料 常用Cellulase R-10 、Macerozyme R-10、 Hemicellulase等活性屬一般的酶，酶處理濃度可低些， 用量少一些。 （3）酶解時(shí)間 視材料、酶性質(zhì)、處理濃度而定，30min-24h。一般 不宜超過24小時(shí)，以免游離的原生質(zhì)體解體。 四、滲透壓 離體原生質(zhì)體的一個(gè)基本屬性是它們的滲透破碎性。所以在原生質(zhì)體分離和最初 培養(yǎng)階段，應(yīng)給予滲透壓保護(hù)，以代替細(xì)胞壁對原生質(zhì)體機(jī)械維持的壓力。 （一）滲透壓保護(hù)劑 （二）應(yīng)注意的問題 （一）滲透壓保護(hù)劑 原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)過程中滲透壓的調(diào)節(jié)通常利用糖

11、或糖醇來控制， 常用的滲壓劑有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，其中甘露醇和山梨醇或其組合最常用。葉原生質(zhì)體分離 時(shí)最常用的為甘露醇（濃度為0.230.90M）。 有效的滲透濃度決定于原生質(zhì)體分離期間葉細(xì)胞的滲透壓。內(nèi)源細(xì)胞滲透壓明顯地受環(huán)境條件的影響，并 且能夠用暗處理植株和幼葉組織等措施加以控制。 （二）應(yīng)注意的問題 1、在酶處理液、原生質(zhì)體清洗介質(zhì)及原生質(zhì)體培養(yǎng)基中必須加入合適的滲透壓 保護(hù)劑。 2、原生質(zhì)體在輕微高滲溶液中比在等滲溶液中穩(wěn)定。較高水平的滲透壓雖可阻 止原生質(zhì)體破裂，但影響細(xì)胞的代謝、分裂和生長。 3、在分離原生質(zhì)體時(shí)，可以使用電解質(zhì)滲壓劑，但在原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)一般不用。 4、

12、當(dāng)用非電解質(zhì)為滲壓劑時(shí)，在酶液中加入某些鹽類，如Cacl2、KH2PO4、葡 聚糖硫酸鉀，可以提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性。 第三節(jié) 原生質(zhì)體的培養(yǎng) 一、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素 （一）基本培養(yǎng)基 （二）滲透壓 （三）植物激素 （四）氮源 （五）復(fù)雜有機(jī)物 二、培養(yǎng)方法 三、培養(yǎng)密度 四、培養(yǎng)條件 （一）基本培養(yǎng)基 1、所使用的培養(yǎng)基一般是改良的細(xì)胞培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分多采用B5或 MS培養(yǎng)基的配方。如 KM8P和K8P培養(yǎng)基：以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ) NT培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ) 2、不同植物常采用的培養(yǎng)基 禾本科植物：MS、N6、KM； 十字花科和豆科：B5、KM8P、K8P、KM； 茄科：MS、N

13、T、K3 （二）滲透壓 原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁之前，必須在培養(yǎng)過程中提供適宜的滲透壓保護(hù)。 1、在原生質(zhì)體培養(yǎng)中，一般常用的滲壓劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麥芽糖等。 2、在原生質(zhì)體培養(yǎng)中不宜使用電解質(zhì)滲壓劑。 3、原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁后應(yīng)使培養(yǎng)基的滲透壓逐步降低。 （三）植物激素 1、不同植物原生質(zhì)體培養(yǎng)對激素的種類和濃度的要求存在較大的差異。 2、生長素中常用的是2,4-D、NAA，在細(xì)胞分裂素中最常用的是BAP、KT、2-IP。 3、在不同的生長發(fā)育階段（起始分裂、細(xì)胞團(tuán)形成、愈傷組織形成與器官分化、 胚狀體發(fā)生與成苗），需要不斷對培養(yǎng)基中激素的種類和濃度進(jìn)行適時(shí)調(diào)整。 （1）在原生質(zhì)體

14、培養(yǎng)中，加入2,4-D對于原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁，啟動(dòng)分裂，持續(xù) 分裂直至形成愈傷組織是很有效的，如禾谷類植物。 （2）一般細(xì)胞分裂素和生長素以一定配比結(jié)合使用。 （3）由活躍生長的培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體要求較高的生長素/分裂素配比才能 進(jìn)行分裂； 由高度分化的細(xì)胞如葉肉細(xì)胞得到的原生質(zhì)體，常需要較高的分裂素/生長素配比 才能進(jìn)行脫分化。 （四）氮源 許多研究指出，適當(dāng)濃度的谷氨酰胺對原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂和生長 都有明顯的作用。NH4+濃度太高的培養(yǎng)基不宜用作原生質(zhì)體培養(yǎng)基。銨 對許多植物（如煙草、馬鈴薯）的原生質(zhì)體有毒害作用，抑制原生質(zhì)體的生長。 降低培養(yǎng)基中NH4+濃度對原生質(zhì)體的存

15、活、細(xì)胞再生及持續(xù)分裂都有利。 還有很多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硝酸鹽對原生質(zhì)體可產(chǎn)生毒害作用，因此使用時(shí)應(yīng)特別注意其 用量。 （五）復(fù)雜有機(jī)物 在原生質(zhì)體培養(yǎng)中，常加入一些復(fù)雜有機(jī)物，可以不同程度的提高再生細(xì)胞分裂頻率，促進(jìn)細(xì)胞團(tuán)的形成。 常用的有機(jī)物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。 二、培養(yǎng)方法 原生質(zhì)體培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng)的方法，因?yàn)椋?（一）液體淺層培養(yǎng) （二）平板法培養(yǎng) （三）懸滴法培養(yǎng) （四）固液結(jié)合培養(yǎng)法 原生質(zhì)體培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng) 1、有些物種的原生質(zhì)體不能在固體培養(yǎng)基上分裂。 2、采用液體培養(yǎng)有利于調(diào)整培養(yǎng)基成分。 3、采用液體培養(yǎng)可將經(jīng)過幾天高密度培養(yǎng)之后的

16、細(xì)胞密度降低，也可將感興趣的細(xì)胞分離出來。 （一）液體淺層培養(yǎng) 1、方法 把原生質(zhì)體以一定的密度（約2105個(gè)/mL）懸浮在液體 淺層培養(yǎng)基中（淺層的厚度以1mm為宜），用石蠟?zāi)?封住平皿后，放在適宜條件下培養(yǎng)。 2、優(yōu)劣 優(yōu)點(diǎn)是：操作方便，對原生質(zhì)體的傷害也?。慌囵B(yǎng)基與 空氣接觸面大、通氣好；原生質(zhì)體的代謝物易擴(kuò)散，防 止了有害物質(zhì)積累過多而造成毒害；便于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物或 添加新鮮培養(yǎng)基。 缺點(diǎn)是：原生質(zhì)體分布不均，易造成局部密度過高或原 生質(zhì)體粘聚而影響其再生細(xì)胞的分裂和進(jìn)一步的生長發(fā) 育；難以實(shí)施定點(diǎn)觀察和跟蹤觀察。 （二）平板法培養(yǎng) 1、方法 取適量原生質(zhì)體懸浮液，與熱融并冷卻至45的含瓊

17、脂或 瓊脂糖的培養(yǎng)基等量混合，并迅速輕輕搖動(dòng)，使原生質(zhì)體 均勻分布。待凝固后，將培養(yǎng)容器置于四周墊有保濕材料 的容器內(nèi)。 2、優(yōu)劣 有利于原生質(zhì)體均勻分布； 便于定點(diǎn)觀察，可跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生、 分裂等行為； 也有利于在部分材料污染時(shí)搶救未污染的部分。 （三）懸滴法培養(yǎng) 1、方法 將適宜密度的原生質(zhì)體懸浮液，用滴管或定量加液器， 以50ul/100ul的小滴接種于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其數(shù)量以滴 與滴間不相碰為原則，皿底加入液體以保濕。將皿蓋穩(wěn) 妥地蓋在皿底上，封口培養(yǎng)。 2、優(yōu)劣 優(yōu)點(diǎn)是：所用材料較少，培養(yǎng)液用量也少；有利于通氣 和觀察， 易添加培養(yǎng)基；不易污染等。適合低密度培養(yǎng)。 缺點(diǎn)

18、是：原生質(zhì)體分布不均，易集中于小滴中央；液滴 與空氣接觸面大，培養(yǎng)基成分和物理特性易于變動(dòng)。 （四）固液結(jié)合培養(yǎng)法 1、雙層培養(yǎng)法 在培養(yǎng)皿底先鋪一層固體培養(yǎng)基（含或不含原生質(zhì)體/ 細(xì)胞），再在其上進(jìn)行原生質(zhì)體的液體淺層培養(yǎng)。 2、切塊懸浮培養(yǎng) 先將原生質(zhì)體包埋于固體平板，再將其切成小塊，投入 到大體積的液體培養(yǎng)基中，并放于搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。 3、瓊脂糖珠培養(yǎng)法 即將原生質(zhì)體與瓊脂糖培養(yǎng)基混合后，逐滴滴在培養(yǎng)皿 底面，待其凝固后，再在其周圍加入液體培養(yǎng)基。采用 這種方法可以在液體培養(yǎng)基中加入經(jīng)輻射處理的細(xì)胞。 三、培養(yǎng)密度 1、原生質(zhì)體適宜的培養(yǎng)密度一般為1104-1105個(gè)/ml，但這不利

19、于單細(xì)胞無 性系的篩選。 2、低密度下培養(yǎng)原生質(zhì)體，可通過改良培養(yǎng)基組成和改進(jìn)培養(yǎng)方法入手。 （1）一般培養(yǎng)基成分越復(fù)雜越全面，原生質(zhì)體的培養(yǎng)的植板密度就可以越低。 （2）改進(jìn)培養(yǎng)方法也可有效降低培養(yǎng)密度。如飼喂細(xì)胞層法；不同類型的原生 質(zhì)體混合培養(yǎng)的方法等。 四、培養(yǎng)條件 （一）光照 1、新分離出的原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng)。 2、在原生質(zhì)體對光敏感的情況下，應(yīng)盡量減少觀察的 次數(shù)，凡經(jīng)觀察過的原生質(zhì)體不應(yīng)包括在以后的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果中。 （二）溫度 1、原生質(zhì)體培養(yǎng)一般在25-30 下進(jìn)行。 2、較高的培養(yǎng)溫度往往有利于啟動(dòng)和維持原生質(zhì)體的 分裂。 （三）濕度 在原生質(zhì)體固體培養(yǎng)和小液滴培養(yǎng)

20、中，應(yīng)注意培養(yǎng)濕度 的保持。 第四節(jié) 由原生質(zhì)體再生植株 一、原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁，形成完整細(xì)胞。 二、細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織。 三、由愈傷組織分化形成植株。 一、原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁 原生質(zhì)體在培養(yǎng)中能否再生細(xì)胞壁并進(jìn)行持續(xù)的分裂是關(guān)系到原生質(zhì)體培養(yǎng)成敗 的關(guān)鍵因素。 1、一般，原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁是其進(jìn)行正常分裂的前提。 2、新形成的細(xì)胞壁是由排列松散的微纖絲組成的，由這些微纖絲組成典型的細(xì) 胞壁。 3、細(xì)胞壁的形成既受原生質(zhì)體內(nèi)在因子（如基因型、原生質(zhì)體來源）的控制， 也受培養(yǎng)基組成等外界因素的影響。 二、細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織 原生質(zhì)體再生壁后開始第一次分裂的時(shí)間，隨植物種類、分

21、離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基 和培養(yǎng)條件而異。 并非所有再生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體都能進(jìn)行分裂，一般凡能分裂的原生質(zhì)體，在經(jīng)過第一次分裂并持續(xù)分裂 后，將形成肉眼可見的愈傷組織。 第四節(jié) 體細(xì)胞雜交 一、體細(xì)胞雜交及一般步驟 二、原生質(zhì)體融合的一般過程 三、原生質(zhì)體融合方法 （一）自發(fā)融合 （二）誘發(fā)融合 四、原生質(zhì)體融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué) 五、雜種細(xì)胞選擇 六、雜種植株鑒定 七、細(xì)胞質(zhì)雜種 一、體細(xì)胞雜交及一般步驟 1、體細(xì)胞雜交 指完全不經(jīng)過有性過程，通過體細(xì)胞融合得到雜種細(xì)胞，再對雜種細(xì)胞培養(yǎng)使 其分化形成雜種植株的過程。 2、步驟 原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體融合雜種細(xì)胞選擇雜種細(xì)胞培養(yǎng)雜種植

22、株再生 雜種植株鑒定 二、原生質(zhì)體融合的一般過程 （一）包含了三個(gè)連續(xù)的主要階段： 1、凝聚作用； 2、細(xì)胞質(zhì)橋的出現(xiàn)； 3、細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展和細(xì)胞的融合。 （二）注意 利用不同品系的甜菜葉肉細(xì)胞進(jìn)行電融合 圖中下方的黑帶是電極。 原生質(zhì)體的粘連并不一定必然導(dǎo)致膜的融合。 如伴刀蛋白A或抗體都能促使原生質(zhì)體的凝聚，但之后很少發(fā)生或不發(fā)生原 生質(zhì)體的融合。 植物原生質(zhì)體表面所帶的電荷會(huì)阻止原生質(zhì)體的粘連。 三、原生質(zhì)體融合方法 （一）自發(fā)融合 相鄰的同種原生質(zhì)體借助胞間連絲可發(fā)生融合，形成多核的原生質(zhì)體， 這種不經(jīng)外界因素誘導(dǎo)就發(fā)生的原生質(zhì)體融合稱為自發(fā)融合。 避免這種自發(fā)融合：切斷胞間連絲。 （

23、二）誘發(fā)融合 在外加因素誘導(dǎo)下的原生質(zhì)體融合為誘發(fā)融合 1、化學(xué)融合法 2、電融合法 1、化學(xué)融合法 NaNO3處理：中和質(zhì)膜表面負(fù)電荷，使之緊密結(jié)合；誘導(dǎo)形成異核體的 頻率低，特別時(shí)原生質(zhì)體來自于高度液泡化的葉肉細(xì)胞 時(shí)。 高pH-高濃度Ca2+處理 聚乙二醇（PEG）處理 聚乙二醇：為一種聚合化合物分子量在1500-6000 之間，易溶于水。 誘導(dǎo)特點(diǎn) （1）形成的異核體頻率較高，特別是雙核異核體的比 例較高。 （2）PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合沒有特異性； （3）實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性很高。 （4）PEG對大多數(shù)細(xì)胞類型毒性低，適合于大多數(shù)物 種的原生質(zhì)體融合。 誘導(dǎo)方法 1）收集原生質(zhì)體； 2）將兩種

24、不同來源的原生質(zhì)體以適當(dāng)比例混合（如1： 1），靜置使之沉降，增加觸融機(jī)會(huì)。 3）用28%-58%的PEG溶液處理15-30分鐘，促使原生 質(zhì)體相互粘連； 4）然后用清洗培養(yǎng)基逐步清洗原生質(zhì)體上的PEG，或用 高PH高濃度鈣離子溶液清洗。 注意清洗應(yīng)逐步平緩進(jìn)行，劇烈洗滌會(huì)減少異核體的形成。 5）融合體的培養(yǎng)。 誘導(dǎo)機(jī)制 四、原生質(zhì)體融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué) 間期核融合的結(jié)果并不產(chǎn)生有活力的雜種細(xì)胞，只有有 絲分裂期間的核融合形成的雜種細(xì)胞才能繼續(xù)進(jìn)一步的 發(fā)育。 原生質(zhì)體融合將產(chǎn)生以下雜種細(xì)胞： 1、親合的細(xì)胞雜種： 具有雙親的全套染色體，并能進(jìn)行正常分裂，形成異 源雙倍體。 2、部分親合的細(xì)胞雜種

25、： 一個(gè)親本的染色體組或全部消失，或其染色體只有部 分的保留或重組于另一親本的染色體組。 3、形成非整倍體的混合群體： 如粉藍(lán)煙草（2N=24）和南氏煙草（2N=18）獲得 的體細(xì)胞雜種，其染色體數(shù)處于56-64之間。 4、胞質(zhì)雜種：包含一個(gè)親本的染色體組，但包含雙親的細(xì)胞 質(zhì)。 普通小麥和簇毛麥體細(xì)胞雜交獲得的雜種細(xì)胞染色體 (紅色熒光者為普通小麥染色體，黃色者為簇毛麥染色體) 五、雜種細(xì)胞選擇 選擇的必要性 雜種細(xì)胞選擇方法 1、對于在形態(tài)上易區(qū)分的原生質(zhì)體及雜種細(xì)胞，可在低密度下培養(yǎng)，然后用機(jī)械方法將雜種細(xì)胞分離出來。 2、熒光染料標(biāo)記選擇 3、互補(bǔ)選擇法 利用兩親本原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分

26、、抗代謝物或溫度等的敏感性存在著 的天然的互補(bǔ)性差異，以及隱性突變造成的遺傳互補(bǔ)來篩選雜種細(xì)胞。 互補(bǔ)選擇法 利用不同親本原生質(zhì)體在遺傳上、抗性上和生理上的互補(bǔ)進(jìn)行選擇： 白化（aaBB）+白化（AAbb）綠色（AaBb） 營養(yǎng)缺陷（ aaBB ）+營養(yǎng)缺陷（ AAbb ） 自養(yǎng)（ AaBb ） 抗性（ aaBB ）+抗性（ AAbb ） 雙抗（ AaBb ） 對培養(yǎng)基成分和抗代謝物互補(bǔ) 對光照敏感性互補(bǔ) 葉綠體缺失突變體 光敏突變體 融合，高光強(qiáng) 下培養(yǎng) 只有雜種細(xì)胞形成 綠色的對光不敏感 的細(xì)胞團(tuán) 矮牽牛兩個(gè)種的原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分及 放線菌素D（抗代謝物）的敏感性存在差異 原生質(zhì)體類型原

27、生質(zhì)體類型在在MS培養(yǎng)基上能培養(yǎng)基上能 否形成愈傷組織否形成愈傷組織 對放線菌素對放線菌素D 敏感性敏感性 甲種甲種不能不能不敏感不敏感 乙種乙種能能敏感敏感 雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞能能不敏感不敏感 六、雜種植株鑒定 （一）鑒定的目的 確認(rèn)體細(xì)胞雜種的雜種性；雜種所擁有的的遺傳組成及性狀變異 情況。 （二）鑒定方法 1、形態(tài)鑒定 （1）在種間體細(xì)胞雜種中，雜種表現(xiàn)或多或少居于融合 親本之間，而在屬間的體細(xì)胞雜種中，表現(xiàn)型更多的是 偏向于親本之一。 （2）在鑒定中注意環(huán)境條件及非整倍變異的影響。 2、細(xì)胞學(xué)分析 3、酶譜分析：如同工酶、淀粉酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等 4、DNA內(nèi)切圖譜分析 七、細(xì)胞質(zhì)雜

28、種 細(xì)胞質(zhì)雜種：由兩種來源不同的核外遺傳成分（細(xì)胞器）與一個(gè)特定的核 基因組（雙親之一）結(jié)合形成的細(xì)胞雜種。 （一）細(xì)胞質(zhì)雜種的獲得途徑 1、通過原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)獲得 2、誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝入細(xì)胞器獲得胞質(zhì)雜種 （二）胞質(zhì)雜種的應(yīng)用 在種內(nèi)或種間轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)控制的性狀。如雄性不育。 （三）細(xì)胞質(zhì)雜種的鑒定 1、表型鑒定 2、生化鑒定和核酸（核外）酶切分析 如對1，5二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPcase)亞基多肽圖譜的分析（該 酶小亞基多肽有核DNA編碼，大亞基有葉綠體DNA編碼） 在原生質(zhì)體能夠完全融合情況下，胞質(zhì)雜種可通過以下途 徑產(chǎn)生： （1）一個(gè)正常的原生質(zhì)體與一個(gè)去核的原生質(zhì)體融合

29、； （2）一個(gè)正常的原生質(zhì)體和一個(gè)核失活的原生質(zhì)體融合； （3）在異核體形成之后二個(gè)核中有一個(gè)消失； （4）在較晚的時(shí)期發(fā)生染色體選擇性的消除。 第六節(jié) 原生質(zhì)體的應(yīng)用價(jià)值 一、在植物遺傳改良上的應(yīng)用 1、擴(kuò)大物種間遺傳物質(zhì)交流的范圍，創(chuàng)造新種。 2、轉(zhuǎn)移優(yōu)良性狀，改良現(xiàn)有品種 3、作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體應(yīng)用于基因工程。 4、利用原生質(zhì)體無性系變異選育新種質(zhì)。 二、基礎(chǔ)理論研究上的應(yīng)用 1、在植物生理學(xué)研究中的應(yīng)用：如細(xì)胞壁再生、內(nèi)吞作 用、氣孔生理、離子吸收與運(yùn)輸?shù)龋?2、在基因表達(dá)表達(dá)調(diào)控研究中的應(yīng)用； 3、在植物病毒分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用。 由普通小麥和高冰草經(jīng)體細(xì)胞雜交獲得的第三代植株 第一節(jié) 原生質(zhì)體的分離與純化 一、原生質(zhì)體的分離 （一）分離原生質(zhì)體的材料來源 （二）分離方法 1機(jī)械分離法 2酶法分離 （三）技術(shù)程序 二、原生質(zhì)體的純化 （二）接口法 1、方法： 先在離心管底加入山梨醇或蔗糖的濃溶液（21%）， 再小心的加入過濾處理的酶-原生質(zhì)體混合液，以合適 的速度離心，原生質(zhì)體將聚集于兩液面之間。小心取出 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入另一離心管，用清洗介質(zhì)清洗、離心，重 復(fù)3次。最后以適