病毒的鑒定方法 科三第二組

1、病毒的鑒定方法病毒的鑒定方法 生物科學三班第二組 組員：何高潔紫 梁雅婷 曾文娟 李迪 劉錦昌 病毒的鑒定病毒的鑒定 鑒定依據(jù) 病毒分類 鑒定方法 病毒鑒定依據(jù) 隨著現(xiàn)代病毒學近半個世紀的發(fā)展歷程，病毒的檢 測手段和方法也在不斷發(fā)展和改進，但無論是什么樣的 方法，都是根據(jù)病毒所共有的兩個特性而發(fā)展起來的。 一是病毒的侵染性； 二是病毒作為核蛋白的特性，也就是病毒理化性質。 病毒鑒定分類病毒鑒定分類 動物病毒 植物病毒 噬菌體病毒 其他鑒定方法 Part1 植物病毒植物病毒 枯斑和指示植物檢測法 血清學檢測法 酶標免疫吸附法(ELISA) 電鏡負染檢測法 電鏡超薄切片法 基因檢測技術 免疫電鏡檢

2、測法 1.枯斑和指示植物檢測法 植物病毒最方便的測定法是利用受病毒侵染能產生枯斑的寄主植物 進行檢測病毒，此法是美國病毒學家霍姆斯(Hohnes)在1929年發(fā)現(xiàn)的， 用感病的植物葉片與少許金剛砂相混，研磨成粗汁液，然后在指示植物 的葉片上蘸取汁液，磨擦供試植物的葉片，經清水清洗后，置于室溫條 件下的溫室內待測，2-3d后葉片上會出現(xiàn)局部壞死灶，即圓形的枯斑， 在一定的范圍內，枯斑數(shù)與侵染性病毒的濃度成正比?？莅叻m不能測 出病毒總的核蛋白濃度，但能測出病毒的相對侵染力，對于病毒的定性 有著重要的意義。諾貝爾獎獲得者美國科學家斯坦利(Stanley)第一次 提純出TMV(煙草花葉病毒)時就是使

3、用此法來檢測病毒的。時至今日， 很多試驗室和生產檢測單位仍然利用此方法檢測病毒?？莅叻ㄔ谔峒円?個未知病毒時，它還可起到追蹤病毒蹤跡的作用，一旦有了病毒的純品， 利用病毒的稀釋曲線，可以換算出病毒的實際濃度。 2.血清學檢測法 基本原理是動物受其致病細菌、病毒侵染后，動物體內血液中的球 蛋白發(fā)生變化而產生抗體，引起動物產生抗體的物質簡稱為抗血清。血 清中的抗體能與同系的抗原在體外特異的結合，這一特性就是血清學測 定病毒的基本原理。這種方法已經廣泛應用于植物病毒的定性定量分析 和醫(yī)學臨床診斷上，其方法的種類也很多，這里僅對一些重要的方法做 扼要的介紹： (2)沉淀法。相對來說沉淀法即非常簡便，在

4、植物病毒學中應 用的極為廣泛，其原理是在電解質存在時，抗體與同源抗原相互結 合形成沉淀，不同病毒類型所形成的沉淀也不同。如桿狀、線狀病 毒形成絮狀沉淀，球形病毒多形成顆粒狀沉淀，通過稀釋終點法， 就是利用抗原稀釋終點對于每種病毒來說是比較穩(wěn)定的這一特點， 來測試病毒的濃度。 (1)補體結合測定法。血清中有一種對熱不穩(wěn)定的成分，它能 在抗體存在的條件下，溶解紅血球或破壞革蘭氏陰性菌，這種成分 就稱之為補體。補體是一種很復雜具有酶活性的蛋白質，在560(； 下加熱，30min后補體則失活，它的一個重要特性是一旦抗體與抗 原結合，則補體也與之結合，通過補體的酶作用可以溶解紅細胞。 3.酶標免疫吸附法

5、(ELISA) Elisa方法是Enzyme-Linked immunosorbentassay的縮寫，最早用 于動物病毒的檢測，近二三十年才應用于植物病毒的檢測，并作為病毒 的定量方法廣泛應用于病理、免疫學的研究和生產實踐中，對病毒進行 快速檢測。此法的最大優(yōu)點是靈敏度高，能與放射免疫技術媲美。有很 多的病毒因其濃度太低或某種抑制劑的干擾，常規(guī)血清學方法檢測不出 時，此法就顯示出獨特的優(yōu)越性。該方法首先將同源特異抗體吸附在反 應器皿底部，加入欲測試的含病毒的樣品，病毒與抗體結合，病毒顆粒 被固定，再加入酶標記的特異抗體和酶的底物，酶與底物反應后會出現(xiàn) 有顏色的溶液其強度與病毒濃度成正比，用此

6、方法可測定出病毒的濃度。 4.電鏡負染檢測法 第一臺電子顯微鏡的誕生打開了人類認識微觀世界的大門，電鏡技 術在近70年發(fā)展歷程中，為生物學、細胞學、病毒學領域的發(fā)展作出了 重要貢獻。正是由于電鏡的出現(xiàn)，實現(xiàn)了人類可直觀病毒及其他生物大 分子的可能。因此電子顯微鏡技術可以說是最直接，最準確的檢測病毒 的手段，它可以直接看到病毒的形態(tài)結構、存在與否，所以在進入了分 子水平的今天它仍然有著不可替代的作用。電鏡負染技術是20世紀60年 代開始使用于英國試驗室，當時人們發(fā)現(xiàn)一些重金屬離子能繞核蛋白體 四周沉淀下來，形成一個黑暗的背景，在核蛋白體內部不能沉積而形成 一個清晰的亮區(qū)，其圖像如同一張照相的底片

7、，因此人們習慣地稱為負 染色，電鏡負染技術也就由此而生。 5.免疫電鏡檢測法 免疫電鏡技術是將免疫學原理與電鏡負染技術相結合的產物，在電 鏡制樣過程中，病毒顆粒不能集中的沉積在有效的電鏡視野內，而容易 造成電鏡觀察時的疏漏，免疫電鏡法利用了抗體、抗原的親和性與吸附 性的這一特點，在電鏡制樣過程中，于銅網(wǎng)上先鋪展一層細胞色素A， 稍后再添加一滴抗體，多余液滴用濾紙吸掉，最后點上一滴抗原和染液， 由于細胞色素A的作用，減少了樣品即抗體、抗原的表面能力，能形成 均勻的涂層，再加抗體、抗原的吸附作用使病毒能較集中地沉集在有效 視野內，從而便于電鏡下的觀察，大大提高了檢測幾率。 6.電鏡超薄切片法 該技

8、術的發(fā)展已經達到病毒的體內定位研究和體內復制及 侵染過程的動態(tài)研究水平，并能直觀病毒生物大分子的亞基單 位，已經從細胞水平發(fā)展到分子水平。尤其對一些未知病毒， 難于提純的病毒材料，負染技術不能解決的檢測材料都可用此 方法，通過對組織細胞的直接觀察而得到解決，因此在病毒學 檢測和脫毒快繁的實際生產中均有著特殊的重要性和不可取代 的作用。 7.基因檢測技術 基因工程技術的興起在對病毒的檢測手段中帶來了新的飛躍，檢測 水平已經達到超微量，即微克水平。其成熟的方法也很多，如分子探針 雜交檢測技術，利用一定序列的核苷酸合成探針，通過分子雜交技術， 檢測出供試樣品中與之相補的堿基序列。PCR技術是通過體外

9、擴增可以 使供試樣品中的目的基因片段很快擴增，使之達到了對即使是病毒含量 極低的樣品，也能靈敏準確地得到定性的結果。基因檢測技術對病毒的 檢測已經達到分子水平，其靈敏度和特異性是任何生化方法的檢測所不 能比擬的，同時可以省略大量的病毒提純和血清的制備工作。 Part2 動物病毒動物病毒 細胞病變效應 紅細胞吸附現(xiàn)象 50%致死量（LD50）或 50%組織細胞感染量（TCID50）的測定 蝕斑和感染病灶 血凝現(xiàn)象和干擾現(xiàn)象 1.細胞病變效應 細胞變化，由病毒引起的細胞病變稱為 細胞病變效應 ，不同病毒有不同 的病變效應。用于細胞培養(yǎng)的標本一般以細胞病變效應作為病毒感染的指標 2.包含體 包含體是

10、某些病毒增殖過程中在宿主細胞內形成的嗜酸性或嗜堿性的病變結構。 由于不同病毒包含體的大小、形狀、組分 以及存在于宿主細胞中的部位均不 同，所以包含體可用于病毒的分類、快速鑒別和某些病毒疾病的輔助診斷指標。 例如，昆蟲病毒可根據(jù)包含體的特性及有無分為質型包含體病毒、核型包含體 病毒、顆粒體病毒及無包含體病毒4類；煙草花葉病毒與馬鈴薯Y病毒的形態(tài) 及其相似，但它們的包含體形態(tài)截然不同，前者為三角形，后者為矩形；狂犬 病毒可在神經元細胞中形成特征性的嗜酸性包含體，又稱內基氏小體，具有診 斷價值。 1.細胞融合現(xiàn)象 指由于病毒感染宿主細胞而出現(xiàn)的多核細胞現(xiàn)象。其發(fā)生決定于病毒和 細胞的種類，也受病毒數(shù)

11、量、溫度、離子強度等因素的影響。如豬腎繼 代細胞內引起細胞融合，但不能在人的二倍體成纖維細胞中誘發(fā)融合現(xiàn) 象。 2.紅細胞吸附現(xiàn)象 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時，以細胞膜上出現(xiàn) 病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發(fā)生紅細胞吸附 現(xiàn)象。若加入相應的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現(xiàn)象 的發(fā)生，稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖 的指征，還可作為初步鑒定。 3. 50%致死量（LD50） 或50%組織細胞感染量（TCID50）的測定 本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動 物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小

12、病毒量，即將病毒懸 液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)中，經一定 時間后，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產生痘斑或尿囊液有血 凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經統(tǒng)計學方法計算出50%感染量或 50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。 4.蝕斑和感染病灶 一些動物病毒在動物細胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)時，由于受病毒感染 細胞裂解，出現(xiàn)與噬菌斑類似的蝕斑或稱空斑。 5.血凝現(xiàn)象和干擾現(xiàn)象 血凝現(xiàn)象指帶有血凝素的病毒能凝聚一定種類哺乳動物或禽類的紅 細胞。如流感病毒、天花病毒?？筛鶕?jù)病毒凝聚的血細胞種類及凝聚條 件不同而鑒定病毒。 干擾現(xiàn)象指兩種不同的病毒同時或先后感

13、染同一宿主細胞時，一種 病毒抑制另一種病毒增殖的現(xiàn)象。如乙型腦炎病毒能干擾脊髓灰質炎病 毒，流感病毒可干擾西方型馬腦炎病毒的增殖等。若在某一組織細胞培 養(yǎng)物同時加入接種物及可被干擾的病毒，若后者被抑制，則可間接判斷 接種物存在可干擾后者的病毒。 噬菌體病毒雙層平板法 菌體的噬菌斑測定一般采用雙層平板法，將一定量經稀釋的噬菌體 懸液與高濃度敏感菌懸液及半固體瓊脂培養(yǎng)基（1%瓊脂）混合均勻，倒 入含底層瓊脂培養(yǎng)基（2%瓊脂）9的平板，經過一段時間培養(yǎng)后，在細 菌菌苔上會出現(xiàn)一個個圓形局部透明區(qū)域，即噬菌斑?？梢哉J為，每個 噬菌斑是一個噬菌體侵染的結果，一個噬菌斑中的噬菌體遺傳性都相同， 故通過多次

14、重復接種，可獲得純系噬菌體。因每種噬菌體的噬菌斑有一 定大小、形狀、邊緣和透明度，故可以作為鑒定的指標。此外，噬菌斑 亦可用于病毒的定量。 Part3 噬菌體病毒噬菌體病毒 Part4 其他鑒定方法其他鑒定方法 免疫熒光（IF）法 病毒形態(tài)和結構觀察法 血清學鑒定法血清學鑒定法 電噴方法 1.免疫熒光（IF）法 病毒在細胞內增殖引起細胞退形性變，表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓、出 現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產生特征性CPE，普通光學倒置顯微鏡 下可觀察上述細胞病變，結合臨床表現(xiàn)可做出預測性診斷。免疫熒光 （IF）法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點，細胞內的病毒或抗原可 被熒光素標記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒 光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。 2.病毒形態(tài)和結構觀察法 病毒懸液經高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直 接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用 分子生物學技術分析病毒核酸組成、基因組織構、序列同源性比較加以 鑒定。 3.血清學鑒定法 用已知的診斷血清來鑒定。補體結合試驗可鑒定病毒科屬；中和試 驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病 毒株，應結合臨床癥狀，檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應注 意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒