環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌新型試劑盒研制可行性研究報(bào)告

1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌新型試劑盒研制可行性研究報(bào)告 李思光南昌大學(xué)一、選題的必要性1、項(xiàng)目所處技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)政策本項(xiàng)目屬生物高技術(shù)領(lǐng)域，是國(guó)家重點(diǎn)支持的研究領(lǐng)域，項(xiàng)目主要針對(duì)嚴(yán)重影響人類健康的主要病原菌的檢測(cè)與診斷需要進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)的研究與試劑盒的開(kāi)發(fā)，本項(xiàng)目的實(shí)施可產(chǎn)生具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的科研成果。本項(xiàng)目技術(shù)含量高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，項(xiàng)目完成后能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，項(xiàng)目符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)、技術(shù)政策。2、項(xiàng)目所處技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀目前的病原菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確性低，開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)技術(shù)和配套試劑是病原菌檢測(cè)工作中亟待攻克的難題。本項(xiàng)目針對(duì)病原菌檢測(cè)中存在的問(wèn)題，采用高靈敏

2、度、高特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)試劑。3、項(xiàng)目技術(shù)先進(jìn)性，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的推動(dòng)作用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的dna聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增dna的新技術(shù)。該技術(shù)在1h內(nèi)能擴(kuò)增出109靶序列拷貝。lamp技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)的推廣對(duì)生物學(xué)、食品科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的檢測(cè)和診斷技術(shù)的進(jìn)步有推動(dòng)作用。4、項(xiàng)目目前進(jìn)展情況課題組開(kāi)展了大量前期研究工作，已完成了本項(xiàng)目所需的科研平臺(tái)建設(shè)任務(wù)，開(kāi)展了嗜水單胞菌和金黃色葡萄

3、球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增研究，取得了階段性研究成果，這些工作為本項(xiàng)目的順利完成奠定了基礎(chǔ)。二、技術(shù)方案論述（一）項(xiàng)目技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)，項(xiàng)目完成時(shí)達(dá)到的技術(shù)水平1、技術(shù)關(guān)鍵（1）本項(xiàng)目的技術(shù)關(guān)鍵之一是引物設(shè)計(jì)。與常規(guī)pcr引物不同，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)難度大，一組引物要求有6個(gè)位點(diǎn)與靶序列完全匹配才能夠進(jìn)行擴(kuò)增。目前我們已從國(guó)際基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了部分病原菌的基因組dna，并根據(jù)基因組特點(diǎn)采用等溫?cái)U(kuò)增軟件設(shè)計(jì)了部分引物，現(xiàn)正通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定這些引物的性能。（2）本項(xiàng)目的另一技術(shù)關(guān)鍵是最佳等溫?cái)U(kuò)增體系優(yōu)化。通過(guò)對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dntp濃度、bstdna聚合酶用量、mg

4、2+濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件。2、創(chuàng)新點(diǎn)（1）既往對(duì)病原菌的檢測(cè)一般采用細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定法，但該方法的準(zhǔn)確率低，所需時(shí)間長(zhǎng)，往往延誤臨床正確的診斷和治療。近年來(lái)，人們將pcr技術(shù)用于病原菌的檢測(cè)。pcr技術(shù)雖然較傳統(tǒng)方法靈敏、快速，但需要較昂貴的儀器設(shè)備。更為重要的是，pcr方法容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，影響對(duì)樣品的正確判斷。本項(xiàng)目將建立適合于食品和臨床標(biāo)本大規(guī)模檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)。與目前的檢測(cè)方法相比，等溫?cái)U(kuò)增法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。而且，等溫?cái)U(kuò)增法是在恒溫下進(jìn)行，只需一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫裝置，不需要pcr實(shí)驗(yàn)中的昂貴儀器，因而易于

5、在基層食品質(zhì)量檢測(cè)部門和醫(yī)院推廣使用。（2）目前，國(guó)外已有將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于病毒dna和rna檢測(cè)的報(bào)道，但將其應(yīng)用于病原菌檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道極少，國(guó)內(nèi)基本上還未開(kāi)展環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增研究工作。本項(xiàng)目首次提出將環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于食品和臨床標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)，并對(duì)目前的等溫?cái)U(kuò)增方法提出改進(jìn)策略，發(fā)展可同時(shí)檢測(cè)多種病原菌的多重等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以克服當(dāng)前一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)只能檢測(cè)一種dna或rna的缺點(diǎn)。因此，本項(xiàng)目的實(shí)施，將開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病原菌檢測(cè)試劑盒。3、項(xiàng)目完成時(shí)達(dá)到的技術(shù)水平項(xiàng)目完成時(shí)，開(kāi)發(fā)的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)及其配套試劑盒達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。（二）項(xiàng)目技術(shù)

6、方案1、技術(shù)方案（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（lamp）和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)常見(jiàn)病原菌方法的建立常見(jiàn)病原菌特異性lamp引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的常見(jiàn)病原菌dna序列，采用lamp專用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性lamp引物（包括每類致病菌的兩個(gè)外引物、兩個(gè)內(nèi)引物和兩個(gè)環(huán)引物，其中每個(gè)內(nèi)引物均具有兩段能夠識(shí)別靶分子上特定位點(diǎn)的序列，以保證靶序列的特異性擴(kuò)增。）常見(jiàn)病原菌基因組dna的提取。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的基因組dna快速提取技術(shù)提取致病菌dna。lamp擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化：對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dntp濃度、bstdna聚合酶用量、mg2+濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。

7、溫育條件的優(yōu)化：在55-65之間優(yōu)化等溫?cái)U(kuò)增溫度。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：建立快速顯色法和電泳分析法兩種檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。以上述研究結(jié)果為基礎(chǔ)，建立常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)。（2）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的靈敏度分析將常見(jiàn)病原菌目標(biāo)基因克隆至pmd-18t載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，倍比稀釋成含目的基因拷貝數(shù)為105、104、103、102、101，以其為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)本方法的靈敏度。（3）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的特異性分析分別以病原菌和非病原菌基因組dna為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)本方法的特異性。（4）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介

8、導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法及常規(guī)pcr擴(kuò)增方法比較分析以lamp的兩個(gè)外引物做常規(guī)pcr擴(kuò)增，并與lamp的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較分析，進(jìn)一步判斷l(xiāng)amp技術(shù)的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。（5）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法在食品檢測(cè)和臨床診斷中的應(yīng)用研究 將本方法應(yīng)用于食品檢測(cè)和臨床診斷中，分析本方法對(duì)不同樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確率。（6）病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒的研制根據(jù)本項(xiàng)目所建立的lamp最佳反應(yīng)體系和lamp反應(yīng)產(chǎn)物顯示方法，研制開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)病原菌的試劑盒（包括單一病原菌檢測(cè)試劑盒和多種病原菌同時(shí)檢測(cè)試劑盒）。2、工藝流程引物優(yōu)化、組合lamp反

9、應(yīng)體系的建立靈敏度試驗(yàn)特異性試驗(yàn)反應(yīng)條件優(yōu)化陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照試劑盒中試同類產(chǎn)品比較試驗(yàn)國(guó)標(biāo)法比較試驗(yàn)lamp方法應(yīng)用于病原體檢測(cè)樣品收集核酸提取引物設(shè)計(jì)基因序列分析（三）項(xiàng)目技術(shù)質(zhì)量指標(biāo)（1）本項(xiàng)目建立的方法對(duì)病原菌檢測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)到95%。（2）本項(xiàng)目建立的方法對(duì)病原菌目的基因檢測(cè)的靈敏度達(dá)到101拷貝。（3）本項(xiàng)目建立的方法不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。（4）對(duì)病原菌目的基因的等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程在30-60分鐘內(nèi)完成，顯色法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在5分鐘內(nèi)完成，電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在60分鐘內(nèi)完成。（四）項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程中各階段目標(biāo)2007年度第一季度：設(shè)計(jì)引物，引物合成，購(gòu)買實(shí)驗(yàn)菌株和有關(guān)試劑，完善實(shí)驗(yàn)條件。第二季度

10、：樣品采集，病原菌dna提取。 第三季度：等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化，溫育條件優(yōu)化。第四季度：擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)方法的建立（快速顯色法、電泳分析法）。2008年度第一季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法操作程序確定，多重等溫?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測(cè)多種病原菌實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立。第二季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法的準(zhǔn)確度分析。第三季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法的靈敏度分析。第四季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法與常規(guī)pcr擴(kuò)增方法比較分析。2009年度第一季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法在食品和臨床標(biāo)本上的應(yīng)用及效果分析。第二季度：環(huán)介導(dǎo)

11、等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌試劑盒和多重等溫?cái)U(kuò)增試劑盒研制。第三季度：試劑盒的應(yīng)用及技術(shù)推廣。第四季度：課題總結(jié)，鑒定。（五）項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)預(yù)算情況本項(xiàng)目申請(qǐng)科研經(jīng)費(fèi)5萬(wàn)元。其中設(shè)備、儀器購(gòu)置費(fèi)1萬(wàn)元；材料、樣品加工費(fèi)0.5萬(wàn)元；土建安裝費(fèi)0.5萬(wàn)元；資料、調(diào)研費(fèi)0.5萬(wàn)元；實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)費(fèi)2萬(wàn)元；鑒定費(fèi)0.5萬(wàn)元。三、項(xiàng)目實(shí)施支撐條件1、項(xiàng)目技術(shù)來(lái)源本項(xiàng)目的技術(shù)由項(xiàng)目申請(qǐng)人建立。2、項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)條件項(xiàng)目申請(qǐng)人所在學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院擁有食品科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科、生物化學(xué)與分子生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科和食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。這些重點(diǎn)學(xué)科和重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施完善、先進(jìn)，具有進(jìn)行本項(xiàng)目研究的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，為本項(xiàng)目的

12、完成提供了保障。項(xiàng)目申請(qǐng)人所在的江西省生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件先進(jìn)，具有pe-9700型pcr儀，全自動(dòng)dna測(cè)序儀（abi prism 3100型）、高速冷凍離心機(jī)、超速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱、milli-q超純水系統(tǒng)、各種規(guī)格的電泳儀、紫外分光光度計(jì)、設(shè)施先進(jìn)的細(xì)菌培養(yǎng)室等儀器設(shè)備?，F(xiàn)已完成了本項(xiàng)目所需的科研平臺(tái)建設(shè)工作。項(xiàng)目申請(qǐng)人長(zhǎng)期從事分子生物學(xué)研究工作，熟練掌握了分子生物學(xué)研究技術(shù)。課題組已開(kāi)展了本項(xiàng)目的前期研究工作，目前正在進(jìn)行嗜水單胞菌和金黃色葡萄球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增研究，基本掌握了等溫?cái)U(kuò)增專用引物設(shè)計(jì)軟件的使用和等溫?cái)U(kuò)增的操作要點(diǎn)，這為本項(xiàng)目的順利完成奠定了技術(shù)基

13、礎(chǔ)。3、項(xiàng)目申請(qǐng)單位人才資源情況項(xiàng)目申請(qǐng)單位南昌大學(xué)是我省唯一一所省部共建的“211”工程重點(diǎn)建設(shè)大學(xué)，人才資源豐富，科研力量雄厚。生命科學(xué)學(xué)院有專任教師150人，其中正副教授60人，講師28人，中高級(jí)技術(shù)人員比例2:1。4、項(xiàng)目組人員專業(yè)結(jié)構(gòu)、職稱結(jié)構(gòu)項(xiàng)目組科研人員7人，主要由生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)、微生物學(xué)專業(yè)人員組成，專業(yè)結(jié)構(gòu)合理?？蒲腥藛T中，教授2人、副教授2人、研究生3人。其中具有博士學(xué)位的教師2人。5、項(xiàng)目新增投資籌集情況本項(xiàng)目申請(qǐng)科研經(jīng)費(fèi)5萬(wàn)元。四、項(xiàng)目預(yù)期經(jīng)濟(jì)效益1、預(yù)期市場(chǎng)需求病原菌的檢測(cè)是食品檢測(cè)和臨床診斷中的常規(guī)項(xiàng)目，食品檢測(cè)部門和醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)檢測(cè)試劑的需求量巨大。等溫?cái)U(kuò)

14、增技術(shù)在病原菌的檢測(cè)工作中有很大潛力。然而，目前國(guó)外僅有將其用于病毒dna和rna檢測(cè)的研究報(bào)道，在病原菌檢測(cè)領(lǐng)域尚無(wú)以此技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)試劑，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)這方面的研究開(kāi)發(fā)報(bào)道。因此，開(kāi)發(fā)病原菌的環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增試劑具有廣闊的前景。2、預(yù)期盈利水平目前以傳統(tǒng)方法檢測(cè)一個(gè)樣品中的一種致病菌的收費(fèi)約50元。本項(xiàng)目建立的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)一個(gè)樣品的試劑成本約8元，如果以20元銷售，可獲利潤(rùn)12元。一個(gè)小型試劑生產(chǎn)企業(yè)一年至少可生產(chǎn)檢測(cè)50萬(wàn)個(gè)樣品的試劑，每年獲利600萬(wàn)元。因此，該技術(shù)的推廣可產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟(jì)效益。3、預(yù)期產(chǎn)業(yè)化前景本項(xiàng)目是針對(duì)嚴(yán)重影響人類健康的病原菌的檢測(cè)問(wèn)題提出的，研究成果的實(shí)用性強(qiáng)，易于轉(zhuǎn)

15、化。在產(chǎn)品的研制工作中采用了現(xiàn)代分子生物學(xué)新技術(shù)，產(chǎn)品的科技含量高，生產(chǎn)成本低，利潤(rùn)空間大。本產(chǎn)品的生產(chǎn)不需特殊大型設(shè)備，產(chǎn)品定型后可向中小型生化試劑生產(chǎn)企業(yè)轉(zhuǎn)讓，因此，本項(xiàng)目的產(chǎn)業(yè)化前景廣闊。我省具有一定生產(chǎn)能力的試劑生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)技術(shù)培訓(xùn)后可生產(chǎn)本產(chǎn)品。4、項(xiàng)目實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)分析課題組已開(kāi)展了本項(xiàng)目的前期研究工作，目前正在進(jìn)行嗜水單胞菌和金黃色葡萄球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增研究，基本掌握了等溫?cái)U(kuò)增專用引物設(shè)計(jì)軟件的使用和等溫?cái)U(kuò)增的操作要點(diǎn)，這為本項(xiàng)目的順利完成奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。項(xiàng)目申請(qǐng)人所在實(shí)驗(yàn)室為江西省生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)條件先進(jìn)，現(xiàn)已完成了進(jìn)行本項(xiàng)目研究的科研平臺(tái)建設(shè)工作。因此，本項(xiàng)目的

16、實(shí)施基本上不存在技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。常規(guī)檢測(cè)病原菌的細(xì)菌培養(yǎng)分離鑒定法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，近年發(fā)展起來(lái)的pcr鑒定法易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。與常規(guī)檢測(cè)技術(shù)和pcr技術(shù)相比，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、低成本等優(yōu)點(diǎn)。在本項(xiàng)目的研究中，我們還將建立一次測(cè)試能夠檢測(cè)多種致病菌的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)易于質(zhì)控，適用于大批量樣品同時(shí)檢測(cè)，值得在食品病原菌普查和人體健康普查工作中推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)以其明顯的優(yōu)勢(shì)將完全能夠取代目前使用的常規(guī)分析方法和pcr方法，成為病原菌檢測(cè)中的主要檢測(cè)方法。因此，本項(xiàng)目的成果轉(zhuǎn)化基本上不存在市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)。五、項(xiàng)目預(yù)計(jì)社會(huì)效益、環(huán)境效益1、對(duì)社會(huì)發(fā)展的作用本項(xiàng)目的實(shí)施將開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病原菌檢測(cè)技術(shù)和配套試劑