丁酸梭菌C2菌株對魚類腸道致病菌體外抑制作用研究

1、丁酸梭菌c2菌株對魚類腸道致病菌體外抑制作用研究?100?(總第151期)水利漁業(yè)2007年第27卷第3期丁酸梭茵c2菌株對魚類腸道致病菌體外抑制作用研究宋增福r,吳天星,宋會儀(浙江大學化學系,杭州3100272上海水產(chǎn)大學生命學院200090;浙江大學動物學院,杭州310029)摘要:以枯草芽孢桿菌,硫酸鏈霉素為對照組,以丁酸梭菌c菌株為試驗組,運用濾紙片瓊脂平板擴散法,研究了丁酸梭菌c菌株對魚類腸道致病菌遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌的抑制作用.研究結(jié)果表明,丁酸梭菌c菌株可以有效抑制這3種病原菌,并且抑制效果要明顯優(yōu)于硫酸鏈霉素.關(guān)鍵詞:丁酸梭菌;抑菌作用;魚類腸道致病菌中圖分類

2、號:$942.3文獻標識碼:a文章編號:10031278(2007)03010002隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,水產(chǎn)病害已經(jīng)成為限制水產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的瓶頸因素,而長期使用抗生素和化學藥物防治水產(chǎn)病害,會增加藥殘和病原的耐藥性,直接危及到人類健康和生存環(huán)境.因此,控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病就迫切需要高效無污染,無毒副作用的替代藥品,減少甚至禁止使用抗生素.現(xiàn)代微生態(tài)學研究表明,益生菌(probiotics)是一種能夠改善宿主腸道菌群平衡并對其有益的微生物,飼料中添加益生菌不僅能避免抗生素的副作用,達到防病治病的效果,而且能促進動物生長.因此,在現(xiàn)代生產(chǎn)條件下,水產(chǎn)益生菌的研究和開發(fā)受到重視,益生菌應用技

3、術(shù)獲得了前所未有的發(fā)展機會.丁酸梭菌自從被日本研究人員發(fā)現(xiàn)以來,一直作為防治腸炎的藥物在臨床上得到應用,尤其是在日本,韓國等東南亞國家.丁酸梭菌可以形成芽孢,具有耐高溫,耐酸,耐鹽和耐擠壓等特性,在制粒過程和酸性的動物腸道環(huán)境中均能保持高度的穩(wěn)定性.試驗研究還表明,丁酸梭菌可以有效地抑制出血性大腸桿菌,痢疾志賀氏菌,霍亂沙門氏菌,霍亂弧菌等人和動物腸道里的有害菌群,其抑制作用被認為是起到治療效果的主要原因之一.但是該菌對引起魚腸道疾病的有關(guān)致病菌是否有抑制作用,至今沒有見到相關(guān)報道.本研究目的是探討丁酸梭菌c,菌株對魚腸道致病菌遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌的抑制作用,為該菌作為水產(chǎn)類新

4、獸藥的研制和開發(fā)提供基本數(shù)據(jù).1材料和方法1.1實驗設(shè)計實驗設(shè)丁酸梭菌c為試驗組,枯草芽孢桿菌和硫酸鏈霉素為對照組;每組分遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌3個處理,每個處理3個重復.在12,18,24,36,48h測定各實驗組抑菌圈直徑.1.2材料收稿日期:20o61211基金項目:浙江省重大科技攻關(guān)課題(2004201)通訊作者:吳天星,email:作者簡介:宋增福,1971年生,男,山東蒙陰人,博士,主要從事動物微生態(tài)與水產(chǎn)病害防治研究.1.2.1菌種丁酸梭菌c,菌株由浙江大學寧波理工學院分子設(shè)計與營養(yǎng)工程實驗室保存;遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌

5、由上海水產(chǎn)大學農(nóng)業(yè)部漁業(yè)動植物病源庫提供;枯草芽孢桿菌由無錫阿爾保爾生物工程有限公司提供.1.2.2培養(yǎng)基丁酸梭菌培養(yǎng)基:葡萄糖lg,胰蛋白胨1g,酵母粉0.5g,牛肉浸膏0.3g,硫酸銨0.1g,硫酸錳0.02g,硫酸鎂0.05g,碳酸鈣0.1g,氯化鈉0.2g,磷酸氫二鉀0.4g,水100g,瓊脂2g.致病菌與枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨營養(yǎng)培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)ph值為.2.3主要儀器和設(shè)備醫(yī)用超凈工作臺,電熱恒溫培養(yǎng)箱,自動ph測定儀,電子天平,電熱高壓滅菌鍋,顯微鏡,冰箱,培養(yǎng)皿,吸管,試管,燒杯,三角瓶,量簡,酒精燈,濾紙片,二氧化碳厭氧工作站等.1.3方法1.3.1丁

6、酸梭菌的活化丁酸梭菌的凍干粉接種于裝有液體培養(yǎng)基的小三角瓶,裝量90ml,耐熱薄膜塑料封口,28c靜止厭氧培養(yǎng)24h,然后轉(zhuǎn)接小三角瓶,接種量為10%.1.3.2致病菌和芽孢桿菌的活化嗜水氣單胞菌,鰻弧菌,遲緩愛德華氏菌和芽孢桿菌接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的小三角瓶,裝量90ml,耐熱薄膜塑料封口,電熱恒溫箱28c培養(yǎng)24h,然后轉(zhuǎn)接小三角瓶,接種量為10%.1.3.3丁酸梭菌的抑菌作用參考吳惠仙采用濾紙片瓊脂平板擴散法進行,稍作修改.將丁酸梭菌,枯草芽孢桿菌活化后,初始接種密度為1.010/ml,24h后稀釋各菌液至1.010/ml.同時,活化搖床培養(yǎng)嗜水氣單胞菌,鰻弧菌和遲緩愛德華氏

7、菌,16h后接種已活化的密度為1.010/ml的各致病菌株0.1ml到各平皿涂布,并置入含有丁酸梭菌,枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物及硫酸鏈霉素(1000iu/ml)的藥敏試紙進行拮抗實驗.測定前,首先將直徑7.2mm的無菌濾紙片浸沒于丁酸梭菌,枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液及硫酸鏈霉素(10001u/ml)的溶液中3min后貼片.在28c培養(yǎng)12,18,24,36,48h測量抑菌圈直徑,每個平皿設(shè)3個重復.1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計2007年第27卷第3期水利漁業(yè)(總第151期)?101?實驗數(shù)據(jù)以平均值標準差(meansd)表示,采用microsoftexcel2003處理硫酸鏈霉素組數(shù)據(jù),用t檢驗進行顯著性檢驗;用spss

8、10.0(usa)處理丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌組,最小顯著極差法(lsd)進行顯著性的比較.顯著水平均設(shè)為d=0.05.2結(jié)果2.1丁酸梭菌c:,枯草芽孢桿菌和硫酸鏈霉素的抑制作用對致病菌抑制實驗結(jié)果見圖1圖3.丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌都有抑制作用,而硫酸鏈霉素對遲緩愛德華氏菌沒有抑制作用.在12,18,24,36,48h5個時間段中,丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對遲緩愛德華氏菌的抑制作用差異不顯著(p>0.05);在12,18,24h3個時間段里,丁酸梭菌對鰻弧菌的抑制作用大于枯草芽孢桿菌(p<0.05),但是從36h起兩者對鰻弧菌的抑制作用差異不顯著

9、.丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌的抑制作用沒有差異,而硫酸鏈霉素對鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的抑制作用始終低于丁酸梭菌(p<0.05).作用時間/ht-3丁酸梭菌c.口枯草芽孢桿菌口硫酸鏈霉素圖1丁酸梭菌c,枯草芽孢桿菌和硫酸鏈霉素對遲緩愛德華氏菌抑制作用l6l4e12麥10刪8囂s囂42o作用時i司/h圈丁酸梭菌c口枯草芽孢桿菌t-3硫酸鏈霉素圖2丁酸梭菌c:,枯草芽孢桿菌和硫酸鏈霉素對鰻弧菌抑制作用2.2丁酸梭菌c:,枯草芽孢桿菌和硫酸鏈霉素抑制作用變化趨勢2.2.1丁酸梭菌c:圖4顯示,丁酸梭菌c:對遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌的抑制能力隨著時間的延長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨

10、勢,在24h達到高峰,隨后逐步下降.且且圈圈囂作用時間/h圈丁酸梭菌c:囝枯草芽孢桿菌e3硫酸鏈霉素圖3丁酸梭菌c,枯草芽孢桿菌和硫酸鏈霉素對嗜水氣單胞菌抑制作用+遲緩愛德華氏菌作用時間/h圖4丁酸梭菌c:抑制作用變化趨勢2.2.2枯草芽孢桿菌圖5可以顯示枯草芽孢桿菌對遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌,嗜水氣單胞菌的抑制能力隨著時間的延長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在24h達到抑菌的高峰,隨后逐步下降.但是對遲緩愛德華氏菌的抑制作用變化比較大,而對鰻弧菌的抑制變化比較平緩.+遲緩愛德華氏菌ee圈圈囂作用時間/h圖5枯草芽孢桿菌抑制作用變化趨勢2.2.3硫酸鏈霉素如圖6所示,硫酸鏈霉素的抑制作用隨時間基本沒

11、有變化.3討論大多數(shù)水生益生菌能夠抑制或者殺死周圍異種有害的菌群.目前,對益生菌抑菌的解釋主要集中在以下幾種觀點:(1)產(chǎn)酸降低了ph值,所造成的酸性環(huán)境致使病原菌無法生存;(2)產(chǎn)生了抗生素或者細菌素,抑制了細菌;(3)產(chǎn)生了過氧化氫等強氧化劑或者溶菌酶,殺死了細菌;(4)腸道內(nèi)的定植占位或者營養(yǎng)競爭抑制了細菌的增長.(下轉(zhuǎn)第115頁)h8642ouiui懈匿組囂642o8642o山山刪匿粗囂2007年第27卷第3期水利漁業(yè)(總第151期)?l15?美和自然美的和諧統(tǒng)一原則,重視旅游產(chǎn)品的非物質(zhì)開發(fā).休閑垂釣旅游地的經(jīng)營從某種意義上可以說是靠天吃飯,季節(jié)性強的特點決定了休閑垂釣旅游地的開發(fā)過

12、程中要改變項目單一的狀況,多元化經(jīng)營,用多種旅游項目吸引游客.以垂釣為主,進行綜合經(jīng)營,多業(yè)并舉.在以垂釣為旅游休閑活動主題進行旅游開發(fā)時應力求功能綜合化,產(chǎn)品功能設(shè)計多樣化,加強娛樂因素,加強體驗經(jīng)濟,使產(chǎn)品具有較廣的市場接受面,多層次與多元化,形成集休息娛樂,健身康體,文化學習,會議展示及特色觀光于一體的綜合性度假地,全方位地滿足客人的多種需求.應更多考慮女性和兒童游客的旅游需求,爭取最大范圍的游客,盡量延長旅游地生命周期.一般男性旅游者比女性旅游者更感興趣的是垂釣的過程,在筆者的調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)男性垂釣者的數(shù)量也遠遠高于女性垂釣者.一般的垂釣地重視的都是開發(fā)垂釣愛好者這個客源市場,而忽視了

13、一個家庭的構(gòu)成中還應該包括女性和兒童.家庭化已成為我國度假休閑旅游的一個重要特征,少年兒童是現(xiàn)代家庭一個重要組成部分,兒童消費市場潛力巨大,功能設(shè)計時應該對兒童進行專門市場定位,注意開發(fā)兒童游樂設(shè)施和游樂項目,以便能為其父母提供一個良好的度假環(huán)境.不同的人因年齡,性別,經(jīng)歷的不同對同樣的產(chǎn)品也會產(chǎn)生不同的體驗,因此在產(chǎn)品設(shè)計中需要注意區(qū)別對待.要建立良好的公共關(guān)系,并加強營銷的力度,加大加強客源市場開發(fā).可采用邊開發(fā)建設(shè)邊宣傳促銷,實行滾動式發(fā)展的模式.形成市場的途徑可以通過俱樂部制或會員制o,4結(jié)語休閑垂釣地是我國漁業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整過程中出現(xiàn)的新鮮事物,也是具有中國特色的旅游目的地形式,目前尚處在

14、發(fā)展的初期階段,開發(fā)歷史雖不長,卻出現(xiàn)了遍地開花式的發(fā)展,加強管理和研究迫在眉睫.在調(diào)查訪談階段,由于時間和人力,物力有限,調(diào)查的樣本量也較有限,結(jié)果有一定的局限性.如時間上,由于休閑垂釣旅游活動的季節(jié)性特點和作者時間精力有限,故一般只抽取雙休日和節(jié)假日;在調(diào)查地點的選取上,由于作者當時身處湖南內(nèi)陸地區(qū),對于規(guī)則比賽型和養(yǎng)殖觀光型以及沿海地區(qū)的垂釣地涉及得不夠全面.但本研究結(jié)果還是基本能代表內(nèi)陸地區(qū)經(jīng)營性垂釣地的經(jīng)營狀況和普通民眾的需求.(責任編輯張俊友)作州時f司/h圖6硫酸鏈霉素抑制作用變化趨勢丁酸梭菌抑菌機制目前比較公認的觀點,是丁酸梭菌產(chǎn)生大量丁酸,丙酸和乙酸等短鏈脂肪酸,造成酸性環(huán)境

15、,降低了ph值,致使其它的微生物難以生存.國內(nèi)的許多研究報告已證實丁酸梭菌對大腸桿菌,沙門氏菌等常見人體腸道致病菌具有拮抗作用.j.而唐寶英等研究了丁酸梭菌對動物腸道致病菌的體外拮抗作用,發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌可以有效的抑制豬大腸桿菌c83902,雞大腸桿菌c83851,雞白痢沙門氏菌(salmonellagallinarum)sg9.本試驗對魚致病菌的研究表明,丁酸梭菌c,菌株可以有效地抑制魚腸道致病菌遲緩愛德華氏菌,鰻弧菌和嗜水氣單胞菌,并且48h內(nèi)比硫酸鏈霉素抑制效果好.隨著時間的延長,丁酸梭菌c抑菌作用下降的趨勢要比枯草芽孢桿菌的緩慢.抑菌效果隨時間延長會降低,推測是由于濾紙片上酸性物質(zhì)的揮發(fā)或

16、者形成芽孢的原因.但是也有試驗表明,即使在中性條件下,丁酸也可以起到抑菌作用.因此推測丁酸梭菌除了可以造成酸性環(huán)境之外,還存在其它的抑菌途徑,這有待于更多試驗來探討.丁酸梭菌作為益生菌,從抑菌角度分析,可以考慮替代抗生素作為新一代的魚用藥物加以開發(fā)和利用,從而減少抗生素和化學藥物的使用,減少藥物殘留和環(huán)境污染.這必將有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展.參考文獻:1張雪平,陸儉,傅思武.丁酸梭菌與雙歧桿菌對腸道致病菌的體外生物拮抗作用j.中國微生態(tài)學雜志,2001,13(5):260262.2吳惠仙.生物防治用途芽孢桿菌對水產(chǎn)條件致病菌抑制作用與對中華絨螯蟹,日本沼蝦及中華鱉保護效果的評價d.杭州:浙江大學,2005.3呂存女,鄺欣,張雪平.丁酸梭菌與嬰兒雙歧桿菌對艱難梭菌體外生物拮抗作用的研究j.中國微生態(tài)學雜志