(2021年整理)實(shí)驗(yàn)報(bào)告：線蟲RNA干擾的基因沉默

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：線蟲rna干擾的基因沉默實(shí)驗(yàn)報(bào)告：線蟲rna干擾的基因沉默 編輯整理：尊敬的讀者朋友們：這里是精品文檔編輯中心，本文檔內(nèi)容是由我和我的同事精心編輯整理后發(fā)布的，發(fā)布之前我們對(duì)文中內(nèi)容進(jìn)行仔細(xì)校對(duì)，但是難免會(huì)有疏漏的地方，但是任然希望（實(shí)驗(yàn)報(bào)告：線蟲rna干擾的基因沉默）的內(nèi)容能夠給您的工作和學(xué)習(xí)帶來(lái)便利。同時(shí)也真誠(chéng)的希望收到您的建議和反饋，這將是我們進(jìn)步的源泉，前進(jìn)的動(dòng)力。本文可編輯可修改，如果覺得對(duì)您有幫助請(qǐng)收藏以便隨時(shí)查閱，最后祝您生活愉快 業(yè)績(jī)進(jìn)步，以下為實(shí)驗(yàn)報(bào)告：線蟲rna干擾的基因沉默的全部?jī)?nèi)容。實(shí)驗(yàn)一：線蟲rna干擾的基因沉默1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?rna干擾（rna inter

2、ference，rnai）是一種使基因使失活的有效方法,在線蟲中，rna干擾因?yàn)楹?jiǎn)單而成為研究基因功能的有效手段。我們利用表達(dá) tag214 dsrna的大腸桿菌喂食線蟲來(lái)介導(dǎo)rnai,以達(dá)到鑒定tag-214基因功能的目的。二、實(shí)驗(yàn)背景 rnai是近年來(lái)以秀麗線蟲的研究為基礎(chǔ)而發(fā)展起來(lái)的一種基因knock down 技術(shù)，將體外合成的含有目的基因的dsrna通過(guò)某種方式引入到線蟲體內(nèi)，導(dǎo)致其體內(nèi)相應(yīng)的目的基因mrna降解，從而達(dá)到基因沉默的目的。三、實(shí)驗(yàn)原理 通過(guò)顯微注射dsrna或者把線蟲浸入到含有dsrna的溶液中,或者用能夠表達(dá)dsrna的大腸桿菌喂食線蟲，可以將dsrna導(dǎo)入大腸桿菌

3、中。在大腸桿菌ht115中，含有目的基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒,在iptg的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出正義和反義的rna,兩條rna鏈通過(guò)退火形成dsrna。當(dāng)線蟲以此大腸桿菌為食時(shí),就攝取了大腸桿菌合成的dsrna,并觸發(fā)了線蟲體內(nèi)rna干擾的發(fā)生.本實(shí)驗(yàn)將利用表達(dá) tag214 dsrna的大腸桿菌喂食線蟲來(lái)介導(dǎo)rnai，以達(dá)到鑒定tag-214基因功能的目的。四、實(shí)驗(yàn)材料:1。秀麗線蟲（c。elegans）rrf-3突變體（rnai敏感型) 由于線蟲的rna的干擾操作簡(jiǎn)單快速，且重復(fù)性好,已成為鑒定基因功能以及基因間互相作用關(guān)系的有效材料。秀麗線蟲屬于線性動(dòng)物門,線蟲綱，小桿線蟲目，廣桿線蟲屬.秀麗線蟲是一種

4、生活在土壤中的線蟲,長(zhǎng)約1mm,直徑70um，由959個(gè)細(xì)胞組成。秀麗線蟲具有雌雄同體和雄性個(gè)體兩種性別.雌雄同體的線蟲有兩條x染色體和5對(duì)常染色體.其基因組大小為80mb，包含13000個(gè)基因。如上左圖為秀麗線蟲的模式圖（上為雌雄同體，下為雄性個(gè)體），右圖為秀麗線蟲的生活史。線蟲具有生活周期短，易培養(yǎng)和保存等優(yōu)點(diǎn),由于其身體透明，因此可以在顯微鏡下跟蹤觀察每個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)，是目前遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要模式生物。2。大腸桿菌野生型菌株op50菌株op50是一種尿嘧啶缺陷型大腸桿菌,它涂布于ngm培養(yǎng)基上，由于該種大腸桿菌是尿嘧啶缺陷型，只能從ngm中獲取尿嘧啶,無(wú)法自身合成。所以生

5、長(zhǎng)速度會(huì)比普通的大腸桿菌慢很多,這樣既可以提供線蟲食物，又不會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)。如果用普通的大腸桿菌,由于沒(méi)有限制,會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)，而且濕度，氧氣已經(jīng)各種環(huán)境因素會(huì)制約線蟲的生長(zhǎng).3.帶有tag-214發(fā)夾結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的ht115菌株將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ht115，在iptg誘導(dǎo)下成功獲得目的基因?qū)?yīng)的雙鏈rna。五、實(shí)驗(yàn)試劑：1.ngm普通固體培養(yǎng)基（1l配方） nacl 3。0g 細(xì)菌蛋白胨 16.0g 蒸餾水 1.0l 瓊脂 16。0g 1mol/l mgso4 1.0ml 1mol/l cacl2 1.0ml 高壓滅菌后加入下列溶劑(每組分配以上溶液250ml） 膽固醇 250l 1mol/l磷

6、酸鉀緩沖液6。25ml配方(1l） kh2po4 129。25g k2hpo4 51。75g2。含有氨芐青霉素和iptg的ngm固體基（用于rnai)(1l配方) nacl 3.0g 細(xì)菌蛋白胨 2。5g 蒸餾水 974ml 酵母提取物 0。8g 瓊脂 17。0g 1mol/l mgso4 41.0ml 1mol/l cacl2 21.0ml 高壓滅菌后加入下列溶劑（每組分配以上溶液250ml) 膽固醇 250l 1mol/l磷酸鉀緩沖液6.25ml配方(1l） kh2po4 129。25g k2hpo4 51。75g 1mol/l氨芐青霉素1。2ml iptg的終濃度達(dá)到4mmol/l3。l

7、b液體培養(yǎng)基(1l配方) nacl 1% 牛肉膏蛋白胨 1 酵母提取物 0。5 加蒸餾水補(bǔ)足 1l4.m9緩沖液（1l配方） na2hpo 45。8g kh2po4 3。0g nacl 1。0g 蒸餾水 1.0l5。氨芐青霉素和四環(huán)素抗生素 氨芐青霉素 （100mg/ml) 四環(huán)素(100mg/ml）六、實(shí)驗(yàn)器材：天平 實(shí)體顯微鏡 酸度計(jì) 水浴鍋 超凈工作臺(tái) 滅菌鍋 恒溫?fù)u床 恒溫生化培養(yǎng)箱 常溫臺(tái)式離心機(jī)七、實(shí)驗(yàn)步驟第一天i.配制實(shí)驗(yàn)試劑,并在超凈工作臺(tái)中配制ngm固體培養(yǎng)基和用于用于rnai的ngm固體培養(yǎng)基。ii活化大腸桿菌op50，挑取少量菌于3mllb液體培養(yǎng)基內(nèi)，37震蕩培養(yǎng)20h

8、左右.第二天i.鋪菌，將200l的op50菌液接入到60nm的ngm平板中央，順時(shí)針?lè)较蚧蝿?dòng)平板使菌液盡量均勻分布在平板上，室溫下放置干燥。ii.活化大腸桿菌ht115，方法同上,將control和帶有tag214基因的分別做好標(biāo)記。第三天i。將10-20只rrf-3突變體的線蟲接到鋪有op50的ngm平板上，在培養(yǎng)皿蓋側(cè)面標(biāo)上線蟲名稱和日期，然后被放入到溫箱中,20恒溫培養(yǎng).ii。再次活化ht115菌體，即從之前活化的菌液中control和tag-214的分別取30l菌液加入到3mllb液體培養(yǎng)基內(nèi),37震蕩培養(yǎng)20h左右.第四天i。鋪菌，分別將200l的ht115的control和tag2

9、14的菌液接入到60nm的ngm平板中央，順時(shí)針?lè)较蚧蝿?dòng)平板使菌液盡量均勻分布在平板上，室溫下放置干燥第五天i。首先在實(shí)體鏡下觀察線蟲的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)ngm平板上有較多的成蟲時(shí),可以進(jìn)行以下操作：取3ml的m9緩沖液加入到ngm平板上,反復(fù)輕輕地晃動(dòng)平板，將平板上的線蟲沖洗下來(lái)，然后將含有線蟲的m9緩沖液轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中ii。向離心管中加入2ml的nacloro溶液和1ml的naoh溶液，之后馬上蓋緊蓋子,劇烈晃動(dòng)離心管.當(dāng)發(fā)現(xiàn)溶液中的線蟲身體呈現(xiàn)彎曲狀，并且還沒(méi)有出現(xiàn)絮狀物時(shí)，加入m9緩沖液至11ml，以終止反應(yīng)。iii。將離心管放入離心機(jī)中，3000r/min離心1min.iv.小心

10、棄去上清液,加入m9緩沖液至11ml，再次離心3000r/min離心1min。v.再重復(fù)上一步。vi.將上清液棄去，留有底部沉淀和少量液體。沉淀中含有線蟲的卵.小心吹打沉淀，并將沉淀滴入未鋪菌的60nm的ngm培養(yǎng)皿的中央，并放入溫箱中20恒溫培養(yǎng)1620h。第六天i。收獲l1幼蟲。培養(yǎng)16-20h后，ngm平板上的線蟲發(fā)育成l1幼蟲。取500ul的m9緩沖液沖洗平板中的線蟲，并將沖洗下的l1幼蟲放到1。5ml的離心管中。將l1幼蟲平均分為兩份，分別接到大腸桿菌ht115(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)的平板中。20培養(yǎng)。ii.single worm（挑單個(gè)蟲)睫毛依次蘸取naclo 、70%乙醇、無(wú)菌水/

11、m9緩沖液，在顯微鏡下分別挑取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的線蟲，分別放在兩個(gè)含有op50的ngm固體培養(yǎng)板上，每個(gè)平板里放一定數(shù)目的線蟲。iii。觀察rnai的表型和效率第二天在顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板內(nèi)的卵，并在其后的幾天觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板內(nèi)的卵是否能孵化成成蟲。并對(duì)孵化出的成蟲進(jìn)行一個(gè)統(tǒng)計(jì)。8、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們小組觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板內(nèi)的卵是否能孵化成成蟲，并對(duì)孵化出的成蟲進(jìn)行一個(gè)統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組：卵數(shù)幼蟲數(shù)孵化率161935056.54%298447448。17%34112.44對(duì)照組：卵數(shù)幼蟲數(shù)孵化率155754698.032232191.40我們小組將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的蟲卵數(shù)/

12、接蟲數(shù)取了平均值,并運(yùn)用excel做成了柱狀圖進(jìn)行明顯的比較。圖1我們又對(duì)結(jié)果進(jìn)行了方差分析,結(jié)果如下：圖2我們小組又收集并分析了其他小組的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)，同樣也做了一個(gè)方差分析：dependent variable：孵化率sourcetype iii sum of squaresdfmean squarefsig.corrected model5。603a15.603147。321.000intercept9.25919。259243.460.000條件5.60315.603147.321。000error1.52140.038total16.38342corrected total7。12441a。 r squared = .786 （adjusted r squared = 。781）分析方差結(jié)果如圖： 從數(shù)據(jù)以及圖標(biāo)結(jié)果看來(lái)，對(duì)照組平均產(chǎn)卵比例遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)卵比例，說(shuō)明tag214基因有控制線蟲產(chǎn)卵的功能，當(dāng)這種基因被沉默掉后，線蟲的產(chǎn)卵率明顯下降，另一方面也說(shuō)明此次的rna干擾實(shí)驗(yàn)做的比較成功，得到了與理論相一致的結(jié)果. 但是