核心蛋白聚糖對HuH7細胞增殖的影響及機制

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減核心蛋白聚糖對HuH7細胞增殖的影響 及機制（作者：單位：郵編：）作者：上官建營 竇科峰 李霄 胡小軍，張福琴，雍召生， 遆振宇【摘要】 目的：探討核心蛋白聚糖（decorin, DCN對HuH7細胞系體 外增殖的影響及機制。方法：加入不同濃度（0、25、50、75、100、 125、150、200卩g/L）的DCN培養(yǎng)HuH7細胞系不同時間（12、24、 48、72 h和2周）,用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽（MTT）法及克隆實 驗測定細胞增殖速度和活力，流式細胞術(shù)測定細胞周期和凋亡情況。 結(jié)果:DCN濃度增加及作用時間延長，細胞增殖速度減慢、活力減 低，G1

2、期細胞增多，凋亡增加。結(jié)論：DCN可能為一種負性調(diào)控蛋白， 可通過調(diào)節(jié)細胞周期，抑制肝癌細胞的增殖，促進其凋亡?！娟P(guān)鍵詞】 核心蛋白聚糖；HuH7;細胞周期；凋亡Abstract AIM: To inv estigate the effects and mecha nismof decorin（DCN） on the proliferationof HuH7 hepatomacarcinoma cell line in vitro. METHODSHepatomacarcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (

3、0, 25, 50,75, 100, 125, 150, 200 卩 g/L) for different time(12, 24, 48,72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTTand clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTSThe proliferation of HuH7cells could be in hibited by DCNn vitro and the in hibi

4、ti oneffect was thetime and dose depe ndent relati on ship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficie ntly in duced by DCN in a time/dosejtidepe ndent manner.CONCLUSIONDCNmaybe a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell prolifer

5、ationthrough inhibitingcellcycle and in duc ing apoptosis of cell in vitro.Keywordsdecori n; HuH7; cell cycle; apoptosis核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家 族中的一員，主要由結(jié)締組織產(chǎn)生，是一種多效性分子1。有許多 資料表明DCN是一種抗增殖因子，能夠抑制多種細胞增殖，極可能 是一種腫瘤抑制物，使轉(zhuǎn)化的細胞和腫瘤靜止2,這提示DCN有可 能成為新的抗腫瘤藥物。本實驗旨在探討DCN對人肝癌細胞生長的影 響及其作用機制，為肝癌的防治提供新的思

6、路。1材料和方法1.1材料 人類肝癌細胞HuH7細胞由本實驗室提供。RPMI 1640 培養(yǎng)基購于Gibco公司，按說明以雙蒸水溶解，濾膜過濾除菌，分 裝，-20 C凍存?zhèn)溆谩Ｐ律Ｑ鍨楹贾菟募厩嗌锕こ滩牧瞎井a(chǎn) 品，經(jīng)56C 30 min水浴滅活后，-20 C凍存?zhèn)溆谩?6孔、6孔細胞 培養(yǎng)板為 Corning 擬Costar 公司產(chǎn)品。Recombinant Human Decorin（Catalog Number: 43擬DE）購自美國 RD公司，用 PBS稀釋濃 度為 1 000 卩 g/L, -20 C凍存?zhèn)溆?。HEPlass100 CO2孵箱為 Thermo 公司產(chǎn)品，CKX4

7、1熒光倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產(chǎn)品，流式細 胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1 細胞培養(yǎng)HuH7細胞培養(yǎng)于100 mL/L新生牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液中，含105 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)條 件為37C、50 mL/L CO2、飽和濕度。培養(yǎng)的細胞均為上皮樣貼壁 生長，細胞密度（0.11） x 109/L,每34 d傳代1次，取對數(shù)生長 期細胞用于實驗。1.2.2細胞處理 取對數(shù)生長期細胞調(diào)整密度至1X 109/L,接種 于96孔板，100卩L/孑L。接種24 h后換液，分別加入含0、25、50、 75、100、150、200

8、卩g/L DCN的培養(yǎng)液，分別以PBS為空白對 照、不含DCN培養(yǎng)液為陰性對照，每孔設(shè)4個復(fù)孔，分別于12、24、 48、72 h用MTT法檢測吸光度（A490值）,并繪制曲線。取對數(shù)生長 期細胞接種于6孔板，200個細胞/孔。接種24 h后換液，分別加入 含 0、25、50、75、100、125、150 卩 g/L DCN 的培養(yǎng)液，分 別以PBS為空白對照、 不含DCN培養(yǎng)液為陰性對照培養(yǎng)2周，當(dāng)培 養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，甲醇固定，吉姆薩染色 后計克隆數(shù)，計算克隆率，并繪制曲線。123流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡 收集對數(shù)期生長的HUH7 細胞,配成單細胞懸液（1 X 10

9、9/L）,與濃度為0、25、50、75、100、 150卩g/L的DCN共同孵育96 h, PBS清洗，標本用胰蛋白酶消化成 細胞懸液，其中一份標本用PBS洗滌2次并將細胞密度調(diào)整為109/L。 首先用微量移液槍移取20 L細胞懸液，然后細胞懸液中加入Annexin擬.V并避光靜置15 min后，將PI染料加入并靜置30 min,上 機檢測。另一份標本加無水乙醇固定。PBS洗滌乙醇，取細胞懸液2 mL, 以1 500 r/min離心5 min,棄上清，輕輕搖動，加入PI去污染液（含 10 mL/L Trit on X擬100）2 mL,避光染色10 min。流式細胞儀檢測,每 份標本測定20

10、000個細胞，測量速率為150200個細胞/s。用 MultiCycle for Win dows軟件分析被采集資料。1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用x 士 s表示，應(yīng)用SPSS15.0軟件包進 行統(tǒng)計分析，不同時間及濃度DCN對細胞增殖情況、細胞周期及凋 亡率影響的比較采用SNK；q檢驗,檢驗水準取a =0.05。2結(jié)果2.1 DCN不同濃度及時間對HuH7細胞增殖的影響HuH7細胞經(jīng) Dcr作用不同時間，其吸光度在同一時間點隨作用濃度增加而逐漸降 低，說明細胞增殖隨DCNt度增加而逐漸減弱；同一濃度DCN作用， 隨著作用時間的延長，吸光度增加速度逐漸減慢，說明較對照組細 胞增殖活力減低（圖1,

11、 P0.052.2 DCN作用濃度對HuH7細胞增殖的影響將不同濃度DCN乍用 HuH7細胞96 h后吸光度（A490值）結(jié)果做統(tǒng)計分析（表1）。顯示不同 濃度DCNA值與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P0.05或P0.01）, 表明不同濃度DCN對細胞增殖的影響不同，且隨濃度增加，抑制效 果逐漸增強。2.3克隆實驗結(jié)果HuH7細胞以不同濃度DCN培養(yǎng)2周， 出現(xiàn)肉眼可見克隆，處理后計數(shù)并計算克隆率（Clone Rate）, 結(jié)果 顯示，隨著DCN濃度增加，細胞克隆率呈下降趨勢，這表明DCN對 HuH7增殖有一定抑制作用（圖2）。表1不同濃度DCN乍用HuH7細胞 96 h A 值2.4

12、DCN寸HuH7細胞周期和凋亡率的影響 隨著DCr濃度的增加， HuH7的 G1期細胞數(shù)明顯增多，S期細胞數(shù)明顯減少，G2期細胞數(shù)則 無明顯變化規(guī)律，同時凋亡細胞率逐漸升高（圖3、4）。3討論DCN是在細胞外基質(zhì)中存在的小分子蛋白聚糖，與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展密切相關(guān)。Santra等3將DCNCDNA急定轉(zhuǎn)染人乳腺癌 MDA；453 細胞，這些被成功轉(zhuǎn)染的細胞克隆表現(xiàn)明顯的生長抑制，細胞克隆在軟瓊脂上不形成集落，在scid小鼠中不形成腫瘤，并且G1期細胞 增加。此外，Nash等4研究發(fā)現(xiàn)直接加入人DCN能夠抑制卵巢癌細 胞系SKOV和2774細胞的增長，并且與抗腫瘤藥物卡鉑有協(xié)同作用。 Konin

13、ger等5研究發(fā)現(xiàn)直接加入人DCN能夠抑制胰腺癌細胞系的增 殖，Tralh崔o等 進一步報道腺病毒介導(dǎo)的 DCN cDNA勺表達能夠 使腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)凋亡并且可以抑制對側(cè)腫瘤細胞的生長，而且這種抑制還是特異性的，正常組織細胞卻不發(fā)生凋亡和生長抑制本研究顯示DCN可抑制體外培養(yǎng)HuH7細胞增殖，流式細胞術(shù)檢 測GO期細胞顯著增多，G1期細胞周期阻滯，G0/G1期的腫瘤細胞比 率越高，表明DCN可以延緩腫瘤細胞由G1期向S期的過渡，使S期 和G2期細胞明顯降低，提示DCN可能影響細胞周期細胞，使HuH7細 胞多數(shù)停滯于DNA合成前期，DNA合成障礙，使腫瘤細胞的倍增時間 延長7。同時本實驗中經(jīng)

14、DCN乍用后的HuH7細胞凋亡率顯著地增高， 提示誘導(dǎo)凋亡亦可能是 DCN抑制肝癌細胞的機制之一。國內(nèi)外有關(guān) DCN文獻報道其有效工作濃度基本上都是在mg/L水平，本實驗將重組人DCN用 PBS稀釋成1 000卩g/L, -20 C凍存?zhèn)溆谩Ｔ陬A(yù)實驗及 實驗時均得出理想的結(jié)果，而且隨劑量增大及時間的延長抑制效果 明顯增加。在肝癌細胞體外培養(yǎng)小劑量DCN未見到刺激細胞增殖作用， 這可能早期國內(nèi)報道 DCN對正常肝細胞及肝星形細胞有雙重調(diào)節(jié)作 用不同，即0.01 mg/L DCN可刺激正常肝細胞及肝星形細胞的增殖； 5、10 mg/L DCN則具有抑制細胞生長的作用，這可能提示DCN在肝 癌中的作

15、用不同于正常肝細胞，小劑量DCN對肝癌細胞系HuH7即有 明顯抑制效果可能也與其本身生長特性也有一定關(guān)系。國外報道DCN最高濃度用到500 mg/L,且發(fā)現(xiàn)增加到一定劑量后，細胞抑制效果 不再增加4。本實驗所用小劑量有明顯抑制作用，但由于劑量普遍 偏小，未發(fā)現(xiàn)抑制效應(yīng)平臺期，DCN對于肝癌細胞系進一步作用效果 有待于深入研究。目前對肝癌治療尚沒有理想的藥物，DCN的發(fā)現(xiàn)為防治肝癌開辟 了新的途徑。DCN是機體本身所有的細胞外基質(zhì)的成份，從組織中提 取天然的DC有廣泛的來源和技術(shù)上的可行性，基因克隆技術(shù)也已成 功獲得DCN,使得DCN在肝癌的防治中具有良好的應(yīng)用前景。我們觀 察了不同濃度DCN乍

16、用不同時間對人肝癌細胞株 HuH7細胞體外生長 的影響，結(jié)果顯示，DCN能夠抑制HuH7細胞的體外增殖，抑制G1/S 期轉(zhuǎn)換，抑制腫瘤細胞的生長，具有抗腫瘤作用和腫瘤組織的分化 調(diào)節(jié)作用，且這種增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用呈劑量依賴性和時間依 賴性，隨著DCN濃度的增加，作用逐漸呈上升趨勢。這提示我們?nèi)绻?DCr用于臨床抗肝癌治療時，必需有足夠用藥計量和用藥時間，從而 維持有效濃度，才能更好的發(fā)揮抗腫瘤作用?！緟⒖嘉墨I】1 Dodge GR, Diaz A, Sanz擬Rodriguez C, et al.Effects of i nterfero n扌!)；gamma and tumor n ec

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18、ge ne, 2002, 21 (23): 3688-3695.3 Santra M, Skorski T, Calabretta B, et al. De novodecori n gene expressi on suppresses the malig nant phe no type in human colon cancer cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(15): 7016-7020.4 Nash MA, Loercher AE, Freedman RS. In vitro growth inhibition of ovarian cancer cells by decorin: synergism ofaction between decorin and carboplatinJ. Cancer Res, 1999,59: 6192-6196.5 Koninger J, Giese NA, diMol